高效液相色谱法检测鲫鱼不同组织中的胶原蛋白含量

※成分分析　艮晶科学　２０１５．Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．１４　６５　高效液相色谱法检测鲫鱼不同组织中的　胶原蛋白含量　贡雯玉Ｌ　，卞欢　，吴海虹　，王道营　，耿志明　，刘芳　，张牧焓　，徐为民　，诸永志　水　（１．江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京　２１００１４；　２．南京农业大学教育部肉品加工与质量控制重点实验室，江苏南京　２１００９５）　摘要：为提高水产品胶原蛋白的利用率，采用柱前衍生．高效液相色谱法对鲫鱼鱼皮、鱼肉、鱼鳞、鱼鳔组织中　的羟脯氨酸含量进行检测，再将羟脯氨酸含量换算成相应胶原蛋白的含量。鲫鱼样品经盐酸１１０℃水解１８　ｈ，丹磺　酰氯衍生，采用高效液相色谱．紫外法进行检测。色谱柱：反相Ｃ，。柱（２５０　ｍｍ×４．６　ｍｍ，５　ｍ）；流动相：Ａ为　甲醇，Ｂ为四氢呋喃．甲醇．０．０５　ｍｏｌ／Ｌ乙酸钠（１：１５：８４，Ｖ／　）溶液，采用梯度洗脱；流速１　ｍＬ／ｍｉｎ；柱温４０℃；　检测波长２５４　ａｍ。结果表明：羟脯氨酸在２０￣４００　Ｉｘｇ／ｍＬ范围内呈现良好的关系（　＝０．９９９　８），最低检测限为　０．１８　Ｐ．ｇ／ｇ，不同水平的平均回收率为８０．２２％￣８３．３３％，相对标准偏差范围为０．３１％～１．８４％。实际样品分析显示，　鱼皮、鱼肉、鱼鳞、鱼鳔组织中胶原蛋白含量分别为１０６．６２、２４．７５、１６６．９４、１　１５．０５　ｍｇ／ｇ。本实验建立的分析方法　简便快捷、具有较好的灵敏度和可靠性，可用于水产品不同组织中胶原蛋白的定量分析。　关键词：鲫鱼；羟脯氨酸；胶原蛋白；高效液相色谱法　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｉｎ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ　Ｃｒｕｃｉａｎ　Ｃａｒｐ（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ　ａｕｒａｔｕｓ）ｂｙ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　，ＷＡＮＧＤａｏｙｉｎｇ　，ＧＥＮＧ：￣ａｉｍｉｎｇ　，ＬＩＵＦａｎｇ　，ＺＨＡＮＧＭｕｈａｎ　，ＸＵＷｅｉｍｉｎ　，ＺＨＵＹｏｎｇｚｈｉ　，，Ｉｃ　ＧＯＮＧＷｅｎｙｕ￣ａＢＩＡＮＨｕａｎ　，ＷＵＨａｉｈｏｎｇ　，（１．Ｉｎｓｉｔｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１００１４，Ｃｈｉｎａ；　２．ＫｅｙＬａｂｏｍｔ￣ｏｆＭｅａｔＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇａｎｄＱｕａｉｆｔｙＣｏｎｎｏＬＭ－Ⅱ　乜ｙｏｆＥｄＩｌｃａ１ｉ　Ｎａｎｊｉｎｇ　Ａ　ａｄｎ蚰】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１００９５，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｉｎ　ｆｉｓｈｅｒｙ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ａ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　（ＨＰＬＣ）ｍｅｔｈｏｄ　ｗｉｈ　ｔｐｒｅ—ｃｏｌｕｍｎ　ｄｅｎｖａｔｉｚａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｋｉｎ，ｍｅａｔ，ｓｃａｌｅ，ａｎｄ　ｂｌｕｂｂｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｒｕｃｉｎ　ｃａｒｐ　Ｃａｒａｓｓｉｕｓ　ａｕｒａｔａｕｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｗａｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｓａｍｐｌｅｓ．Ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ　ａｃｉｄ　ａｔ　１　１０℃ｆｏｒ　１　８　ｈ．ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｆｉｏｎｓ　ｗｉｈ　ｄａｔｎｓｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ．Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ＨＰＬＣ　ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ａｎ　ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＨＰＬＣ－ｕｖ）．Ｔｈｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｃｏｎｄｉｉｔｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｔ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：ｃｏｌｕｍｎ，Ｃｌ８（２５０　ｎｌｎｌ×４．６　ｍｍ，５　ｒｕｎ）；ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ，Ａ：ｍｅｈａｔｎｏｌ，Ｂ：　ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ—ｍｅｔｈａｎｏｌ－０．０５　ｍｏｌ／Ｌ　ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ（１：１５：８４，Ｖ／　；ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ，１．０　ｍＬ／ｍｉｎ；ｃｏｉｎＩｎｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，４０℃；ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ，２５４　ｍｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｅｘｉｓｔｅｄ　ｗｈｅｎ　ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ　ｗａｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　２０－４００　ｔｔｇ／ｍＬ（Ｒ２＝０．９９９　８１．Ｔｈｅ　ｌｉｍｉｔ　ｏｆ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＬＯＤ）Ｗａｓ　０．１８　Ｉ￣ｇ／ｇ　ｎｄ　ａｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ｗｅｒｅ　８０．２２％－－８３．３３％　ｗｉｔｈ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ（ＲＳＤｓ）ｏｆ　０．３１％－１．８４％．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｃｏＨａｇｅｎ　ｉｎ　ｓｋｉｎ，ｍｅａｔ，ｓｃａｌｅ，ｂｌｕｂｂｅｒ　ｏｆ　ｃｒｕｃｉａｎ　ｃａｒｐ　ｗｅｒｅ　１０６．６２，２４．７５，１６６．９４，ｌ１５．０５　ｍｇ／ｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｍａｎｅｕｖｅｒａｂｉｌｉｔｙ，　ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ　ｅｎｓｉｔｓｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｃｙ，ａｎｄ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｅｍｐｌｏｙｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｉｎ　ｆｉｓｈｅｒｙ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｒｕｃｉｎｃａａｒｐ（Ｃａｒａｓｓｉｕｓａｕｒａｔｕｓ）；ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ；ｃｏｌｌａｇｅｎ；ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）　中图分类号：ＴＳ２５４．７　ｄｏｉ：１０．７５０６／ｓｐｋｘ１００２－６６３０－２０１５１４０１３　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２．６６３０（２０１５）１４．００６５．０５　随着生活节奏的加快，用传统方法熬制汤煲过于　耗时，因此健康快捷的汤煲类产品将会有很大的市场空　收稿日期：２０１４．１１－１９　间。目前，汤煲类产品主要为冲调型汤煲和真空包装型　汤煲ｎ　；冲调型汤煲营养欠缺，真空包装型汤煲食材易烂　基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目（２０１４ＢＡＤ０４Ｂ００）；江苏省农业科技自主创新资金项目（ＣＸ（１４）２１１７）　作者简介：贡雯玉（１９９１一），女，硕士研究生，研究方向为肉品加工与质量控制。Ｅ．ｍａｉｌ：ｇｗｙ３４２８＠１６３．ｃｏｍ　通信作者：诸永志（１９７５一），男，副研究员，硕士，研究方向为肉品加工与质量控制。Ｅ－ｍａｌｌ：ｙｏｎｇｚｈｉｚｈｕ＠１６３．ｔｏｍ　６６　２０１５，Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．１４　良晶科学　※成分分析　且有蒸煮味，因此当务之急是开发新型汤煲类产品。鲫　鱼（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ　ａｕｒａｔｕｓ）是我国国民消费的大众品种，在　淡水鱼中营养最为丰富；其肉质细嫩，比畜、禽肉更容　易消化和吸收，产妇食用鲫鱼汤能有效催乳，对母体恢　复也有很好的补益作用，鲫鱼浓汤也是家庭中最为普遍　的食用方法。鲫鱼含有全面且优质的蛋白质，其中胶原　蛋白占鲫鱼总蛋白质含量的２５％￣３０％［２】，相当于体质量　的６％，是含量最丰富、分布最广泛的蛋白质。胶原蛋白　主要存在于鲫鱼的皮、骨、软骨、鳞中，是结缔组织重　要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的作用ｐ　。　胶原蛋白的浓度越大，其分子间的交联度就越大，形成　的凝胶结构就越致密，凝胶强度也越大，所以本实验研　究鲫鱼不同组织胶原蛋白含量，以胶原蛋白含量多的组　织作为原料处理后（如鱼鳞胶）加入鲫鱼汤，制作天然　营养的固体凝胶型鲫鱼汤，以此填补产品空白。目前，　国内外关于水产中胶原的报道集中在深海鱼（黄鳍金枪　鱼、小须鲸、河豚、尖吻鲈、鳕鱼等）Ｈ　、淡水鱼皮、　鱼鳞（鲤鱼、罗非鱼、草鱼等）［７．加　的胶原提取工艺，以　及水产品如海参的羟脯氨酸含量研究上，而对淡水鱼中　各部分组织胶原的定量分析报道很少。　胶原蛋白中含有２种特有的氨基酸——脯氨酸和羟脯　氨酸，它们的含量很高，约占２５％　他】。羟脯氨酸是胶原　蛋白的特异性氨基酸，在胶原蛋白的生物合成过程中，　没有游离的羟脯氨酸参与合成，所有的羟脯氨酸均由己　合成的肽链中的脯氨酸经羟化酶作用转化而来。胶原蛋　白中的羟脯氨酸含量稳定，通过测定羟脯氨酸的含量即　可获得胶原蛋白含量［１　Ｈ　。传统测定羟脯氨酸的方法是比　色法“　】，样品需要量大，操作步骤繁琐，影响因素多，　且特异性、灵敏性差；氨基酸自动分析法是一种快速、　准确灵敏度高的测定方法　“，适用于多种氨基酸同时　分析，对于单一氨基酸的分析而言其费用高，普通实验　室难以实现；高效液相色谱仪具有优良的灵敏度和精密　度，近年来广泛用于氨基酸、尤其是单一氨基酸的分析　测定。本实验以丹磺酰氯（ｄａｎｓｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｄｎｓ．Ｃ１）作　为液相色谱柱前衍生试剂，通过样品水解、衍生条件的　确立、以及高效液相色谱分离、检测条件的优化，建立　鲫鱼鱼皮、鱼肉、鱼鳞、鱼鳔组织中羟脯氨酸的定量检　测方法。　１　材料与方法　１．１　材料与试剂　鲫鱼　市购；新鲜鲫鱼经宰杀之后，去内脏，清洗　鱼腹内的黑膜。分别取不同部位样品组织，切碎待用。　三一羟基脯氨酸标准品（三－Ｈｙｐ，纯度９９％）　美国　Ａｌａｄｄｉｎ公司；甲醇、四氢呋喃（均为色谱纯）　美国　Ｔｅｄｉａ公司；衍生试剂：Ｄｎｓ．Ｃ１（纯度＞９８％）　日本　ＴＣＩ公司：称取０．０４　ｇ　Ｄｎｓ．Ｃ１，用丙酮溶解，并定容至　１０　ｍＬ，４℃避光保存，有效期３　ｄ；其余试剂均为分析纯。　１．２　仪器与设备　ｅ２６９５高效液相色谱（配有二极管阵列检测器、　ＸＢｒｉｄｇｅ　Ｃｌ８色谱柱）　美国Ｍｉｌｆｏｒｄ公司；ＨＳ２０６０Ａ超声　波振荡器　常州国华电器有限公司；烘箱　上海索谱　仪器有限公司；纯水仪　美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司。　１＿３　方法　１．３．１　标准溶液配制　称取适量羟脯氨酸标准品，用超纯水溶解，配制　１．００　ｇ／Ｌ标准贮备液，于４℃保存，ｌ临用时用超纯水稀释　配制质量浓度为２０￣４００　ｕｇ／ｍＬ系列标准工作溶液。　１．３．２　样品处理　称取２　ｇ（准确至０．００１　ｇ）绞碎后的样品于１０　ｍＬ水解　管中，加入６　ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液６　ｍＬ，充氮气１　ｍｉｎ，抽真空至　管内盐酸起泡，用火焰封口，于１１０℃烘箱中水解１８ｈ。冷　却后，将水解液全部转移到５０ＩＩ１Ｌ容量瓶中，加水至刻度。　混匀后，取５　ｍＬ水解液于１０　ｍＬ容量瓶中，用２　ｍｏｌ／Ｌ氢氧　化钠溶液调节ｐＨ值至中性，加水稀释至刻度。稀释液经　０．２２岬微孔滤膜过滤，待高效液相色谱分析。　１．３．３　衍生　取过滤后的稀释液１　ｍＬ于１０　ｍＬ具塞离心管中，加　饱和碳酸氢钠溶液４００　ｇＬ，衍生试剂８００　ｇＬ，旋涡混匀　３０　Ｓ，８０℃水浴中避光反应４５　ｍｉｎ，取出迅速冷却，加入　１　ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液８００　ｇＬ终止反应，经０．２２　ｌａｍ微孔滤膜过　滤，待高效液相色谱分析。　１．３．４　色谱条件　梯度洗脱程序见表１，色谱柱：ｃＩＲ｛主（２５０ｒｒａｎ￣４．６ｒｒａｎ，　５　ｔａｍ）；流动相：Ａ为甲醇，Ｂ为四氢呋喃．甲醇．０．０５　ｍｏｌ／Ｌ　乙酸钠（１：１　５：８４，　）溶液：梯度洗脱，流速　１　ｍＬ／ｍｉｎ；柱温４０℃；检测波长２５４　ｎｌｎ；进样量２０　。　表１　梯度洗脱程序　Ｔａｂｌｅ　１　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｐｒｏｇｒａｍ　１．３．５　精密度实验　配制不同质量浓度的羟脯氨酸标准溶液，按照１．３．２　节和１－３－３节方法处理，并进行高效液相色谱测定，以测　定的结果计算相对标准偏差（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎ，　ＲＳＤ）。　１．３．６　回收率实验　分别称取２　ｇ不同组织样品，根据其羟脯氨酸含量添　※成分分析　艮晶科学　２．３　色谱条件优化　２０１５。Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．１４　６７　加不同水平（５０％、１００％、１５Ｏ％）的羟脯氨酸标准品，　按１．３．２节和１．３．３节方法进行实验，测定羟脯氨酸含量，　实验中流动相Ａ为甲醇，Ｂ为四氢呋喃、甲醇和　０．０５　ｍｏｌ／ＬＴ，酸钠组成的混合溶液。其中对乙酸钠缓冲液　分别配制了３种不同ｐＨ值分别为４．８、４．０、３．４，观察了　三者对羟脯氨酸在Ｃ　。柱上保留行为的影响。结果发现，　ｐＨ值越低越有利于分离，有些文献报道使用ｐＨ值为３．１　的缓冲液，但考虑到色谱柱的使用寿命，选择ｐＨ值为３．４　的乙酸钠缓冲液，在ｐＨ值为３．４时羟脯氨酸的峰形最好，　并且保留时间明显提前；四氢呋喃的加入能有效地改善　计算回收率，每一样品做３次平行实验。　１．３．７　计算公式　回收率和胶原蛋白含量按公式（１）、　（２）计算：　Ｖｒ＿Ｖ　回收率，％＝　厶　ｘ１００　（１）　式中：肭加入羟脯氨酸后样品中羟脯氨酸的测定总　量／ｍｇ；ｙ为样品中羟脯氨酸测定量／ｍｇ；Ｚ为加入标准羟　脯氨酸量／ｍｇ。　胶原蛋白含量／（ｍｇ／ｇ）＝羟脯氨酸含量×１１．１（２）　２　结果与分析　２．１　水解条件的确定　测定蛋白质中的氨基酸首先要通过水解破坏蛋白质　的肽键，一定浓度的酸液可以使胶原蛋白水解为肽及游　离的三．氨基酸，并释放到溶剂中。酸水解的优点是水解　彻底，水解的最终产物是三一氨基酸，没有旋光异构体产　生。酸浓度和温度对动物组织胶原蛋白的水解过程有较　大影响，增加酸浓度和提高温度可使反应进程加快，使　胶原蛋白水解为多肽的过程更彻底【２　。本实验观察了水　解温度、时间以及盐酸浓度对鲫鱼不同组织中胶原蛋白　水解产生羟脯氨酸的影响，最终确定的水解条件为：水　解温度１１０℃，６　ｍｏＦＬ盐酸溶液中水解１８　ｈ。　２．２　衍生试剂选择　动物组织中的胶原蛋白经酸水解后生成包括羟脯氨　酸在内的氨基酸混合物，羟脯氨酸本身不具有紫外、荧　光吸收，需要衍生后才能进行分析。Ｄｎｓ．Ｃ１在氨基酸的　液相色谱分析中有着广泛的应用口　，常作为液相色谱的　柱前衍生试剂口　。Ｄｎｓ．Ｃ１可以同伯胺或仲胺基上的活泼　氢反应，脱掉一分子的ＨＣＩ生成具有荧光和紫外吸收的衍　生物，其衍生操作简单、衍生物稳定性较好、可定量完　成磺酰化反应、有较强的荧光和紫外吸收。本实验同样　选择Ｄｎｓ．Ｃ１作为鲫鱼不同组织胶原蛋白水解液中羟脯氨　酸的柱前衍生试剂，衍生产物在Ｃ　柱上的分离效果好，　干扰峰极少，谱图干净，如图ｌ所示。　０．６　０．４　Ｏ－２　０．０　０　５　１０　１５　２Ｏ　２５　３０　时间／ｍｉｎ　图１　４ＯＯ旭，ｍＬ羟脯氨酸标准样品的高效液相色谱图　Ｆｉｇ．１　ＨＰＬＣ　ｅｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　Ｈｙｐ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｔ　４ＯＯ　ｌＩｇ／ｍｌＬ　峰形和分离度。甲醇、四氢呋喃和乙酸钠溶液体积比为　１：１５：８４时，经过梯度洗脱可以有效的调节保留时间且拥　有良好的检测限。　实验中为选择最佳洗脱梯度，分别设置了不同的洗　脱程序进行测定。结果发现流动相Ａ的比例越小物质分离　越完全，并且可以将杂质很好的分离，在不断增加甲醇　比例时０．６　ｍＬ／ｍｉｎ的增加速率为最佳，最终选择梯度洗脱　程序如表１所示。　为选择最佳检测波长，本实验采用三波长模式　（２４０、２５４　ｎｍ和２６０　ｎｍ）同时检测羟脯氨酸含量，如图　２所示。结果表明，羟脯氨酸在波长２５４　ｎｍ处有最大吸收　峰，且在波长２５４　ｎｍ处基线稳定，因此将检测波长设为　２５４ｎｍ。　本实验还考察温度、流速对羟脯氨酸在Ｃ　。柱上的　保留行为的影响，二者对羟脯氨酸的保留时间有一定影　响，但对检测灵敏度影响不大，最终将温度设为４０℃，　流速１．０　ｍＬ／ｍｉｎ。在设定的色谱条件下，羟脯氨酸保留时　间约２７．１　ｍｉｎ，如图２所示。　羟　酸　Ａ　ｌ一一　八　Ｂ　ｌＩ　八　ｃ【ｌ　八　４　６　８　１Ｏ　ｌ２　１４　ｌ６　１８　２Ｏ　２２　２４　２６　２８　时间／ｍｉｎ　Ａ．２４０ｎｌＴｌ；Ｂ．２５４ｎｍ；Ｃ．２６０ｎｌＴｌ。　图２　样品在不同波长条件下的高效液相色谱图　Ｆｉｇ．２　ＨＰＬＣ　ｅｈｒｏｍａｔｏｇｒａｎｍ　ｏｆｓａｍｐｌｅ　ａｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓ　２－４　线性范围及最低检测限　按照３倍信噪比计算最低检测限，得出方法的最低　检测限为０．１８　＿／ｇ。　取标准贮备液，分别用水配制质量浓度为２Ｏ、５Ｏ、　１００、２００、４００　ｇｇ／ｍＬ的羟脯氨酸系列标准工作溶液。　取１　ｍＬ上述系列标准溶液于１０　ｍＬ具塞离心管中，分别　按１．３．３节方法衍生，其中衍生后羟脯氨酸的质量浓度依　次为６．６７、１６．６７、３３．３４、６６．６７、１３３．３３￣ｔｇ／ｍＬ。在波长　６８　２０１５，Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．１４　艮晶科学　※成分分析　２５４　ｎｍ处进行高效液相色谱测定分析，以羟脯氨酸衍生后　质量浓度（ｖｅｄｍＬ）为横坐标　以对应峰面积为纵坐标ｙ’　绘制标准曲线。回归方程ｙ＿１．３５×ｌ０　卜８．５６Ｘ　１０３，相关　系数　为０．９９９　８。由此可见在质量浓度２０￣４００￣ｇ／ｍＬ范　围内，羟脯氨酸质量浓度与峰面积有良好的线性关系。　２．５　精密度　配制ｌ００、２００、３００　ｌａｇ／ｍＬ羟脯氨酸标准溶液，　取１　ｍＬ上述标准溶液于１０　ｍＬ具塞离心管中，分别按　１．３．３节方法衍生，其中衍生后质量浓度分别为３３．３４、　６６．６７、１００　Ｉｘｇ／ｍＬ，按照１．３．４节色谱条件进行分析，每　个质量浓度重复操作３次，记录峰面积，得１００、２００、　３００￣ｔｇ／ｍＬ的羟脯氨酸标准溶液峰面积的ＲＳＤ分别为　１．３４％、０．３１％、１．８４％，结果表明本实验建立的方法具有　良好的精密度。　２．６　回收率　分别取鲫鱼不同部位鱼皮、鱼肉、鱼鳔、鱼鳞的组　织样品测定羟脯氨酸，计算回收率，结果见表２。　表２　鲫鱼不同组织样品羟脯氨酸添加水平回收率测定结果（ｎ－－－３）　Ｔａｂｌｅ２　ＲｅｃｏｖｅｒｉｅｓｏｆＨｙｐ　ｓｐｉｋｅｄａｔｄｉｆｅｒｅｎｔｌｅｖｅｌｓ（一＝３）　由表２可以看出，样品回收率在７２．６７％￣９１．００％之　间，鱼皮、鱼肉、鱼鳔、鱼鳞样品中平均回收率分别为　８０．２２％、８３．３３％、８０．７２％、８０．６７％，可满足鲫鱼不同组　织中胶原蛋白分析研究的需要。　２．７　实际样品分析　表３　实际样品分析结果（ｎ－－３）　Ｔａｂｌｅ３　ＣｏｎｔｅｎｔｓｏｆＨｙｐｉｎｒｅａｌｓａｍｐｌｅｓ　＝３）　分别分析了鲫鱼不同部位鱼皮、鱼肉、鱼鳔、鱼鳞　的组织样品中羟脯氨酸的含量，结果见表３。鲫鱼４个部　分中鱼鳞胶原蛋白含量最多为１６６．９４ｍｇ／ｇ，鱼肉胶原蛋白　含量最少为２４．７５　ｍ！　，各组织样品的ＲｓＤ在０．５２％￣３．００％　之间。曾名勇等　用氨基酸自动分析仪测得鲫鱼鱼皮中羟　脯氨酸含量为８．１２　ｍｇ／ｇ，鲈鱼鱼皮胶原含量为８．７５　ｍｇ／ｇ，　鳙鱼鱼皮胶原含量为８．３４　ｍｇ／ｇ；詹永献【２　用分光光度法　测得的草鱼鱼鳔中羟脯氨酸含量为４９．７　ｍｇ／ｇ；潘杨　’　根据Ｗｏｅｓｓｎｅｒ　Ｊ法计算鲢鱼鱼鳞中羟脯氨酸的含量为　４１．６　ｍｇ／ｇ。含量有所差异可能和测量方法、组织来源、　部位不同有关，但羟脯氨酸在胶原蛋白中含量稳定，约　占９％，胶原蛋白含量高，其羟脯氨酸含量也高，将测得　的羟脯氨酸含量乘以相关系数１１．１即为胶原蛋白的含量。　３　结论　本实验通过样品水解条件确定、衍生试剂选择和色　谱条件的优化，建立了鲫鱼鱼皮、鱼肉、鱼鳞、鱼鳔组　织中羟脯氨酸的高效液相色谱检测方法，从而计算出相　应的胶原蛋白含量。鲫鱼组织经盐酸１　１０℃水解１８　ｈ，　Ｄｎｓ　Ｃ１衍生，然后以甲醇和四氢呋喃一甲醇一０．０５　ｍｏｌ／Ｌ　乙酸钠（１：１５：８４，　）溶液为流动相、在反相Ｃ，８柱　上进行分离。在２０￣４００￣ｔｇ／ｍＬ范围内关系良好（Ｒ　为０．９９９　８），最低检测限为０．１８￣ｔｇ／ｇ，平均回收率为　８０．２２％～８３．３３％，ＲＳＤ范围为０Ｉ３１％～１．８４％，同时检测　出鲫鱼鱼皮、鱼肉、鱼鳞、鱼鳔组织中胶原蛋白含量分　别为１０６．６２、２４．７５、１６６．９４、１　１５．０５　ｍｇ／ｇ。　本实验建立的鲫鱼不同组织中羟脯氨酸的高效液　相色谱检测方法，操作简便、具有良好的灵敏度和准确　性。鉴于鲫鱼汤是家庭中最为普遍的食用方法、以及家　庭鲫鱼汤制作耗时较长，后续研究将围绕以胶原蛋白含　量多的组织为原料，进行处理后（如鱼鳞胶）加入鲫鱼　汤中，制作天然营养的固体凝胶型鱼汤。　参考文献：　【１】　于美娟，马美湖，李高阳．畜禽汤类产品加工技术研究进展【Ｊ】＿肉类　研究。２０１２，２６（１２）：６１—６６．　【２】　王丽娜，黄素珍．胶原蛋白的研究进展【Ｊ］．肉类研究，２０１０，２４（１）：　１６－２２．　【３】　夏启泉，许慧卿．鲫鱼浓汤的制作工艺及营养分析［Ｊ】．扬州大学烹　饪学报，２００５，２２（３）：２４．２６．　【４】　万春燕，王英华，邬元娟，等．胶原蛋白在食品中的应用现状及其发　展前景【　．中国食物与营养，２００８，ｌ４（９）：２４－２６．　［５］５　周倩，罗志刚，何小维．胶原蛋白的应用研究【Ｊ】．现代食品科技，　２００８，２４（３）：２８５・２８９．　［６】　连喜军，鲁晓翔，刘勤生．鱼类胶原蛋白研究进展【Ｊ】．肉类研究，　２００７，２ｌ（１）：４６—４９．　［７】　杨树奇，曾少葵，周春霞，等．３种鱼皮的基本成分及氨基酸组成分　析［Ｊ】．广东海洋大学学报，２０１０，３０（１）：９７—１００．　【８】　ＮＡＧＡＩ　Ｔ，ＳＵＺＵＫＩ　Ｎ，ＮＡＧＡＳＨＩＭＡ　Ｔ．Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｆｒｏｍ　ｃｏｍｍｏｎ　ｍｉｎｋｅ　ｗｈａｌｅ（Ｂａｌａｅｎｏｐｔｅｒａ　ａｃｕｔｏｒｏｓｔｒａｔａ）ｕｎｅｓｕ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｃ￣ｓｔｒｙ，　２００８。１１１（２）：２９６—３０１．　※成分分析　食品科学　２ｏ１５，ＶｏＬ３６，Ｎｏ．１４　６９　申锋，杨莉莉，熊善柏，等．胃蛋白酶水解草鱼鱼鳞制备胶原肽的工　艺优化［Ｊ】．华中农业大学学报，２０１０，２９（３）：３８７—３９１．　张俊杰，段蕊，曾庆孝．鲤鱼鳞中羟脯氨酸测定的影响因素［Ｊ］．食品　科学，２００５，２６（１）：１９１—１９５．　ＮＡＧＡＩＴ，ＡＲＡＫＩＹ，ＳＵＺＵＫＩＮ．Ｃｏｌｌａｇｅｎｏｆｔｈｅ　ｓｋｉｎｏｆｏｃｅｌｌａｔｅｐｕｆｆｅｒ　ｉｆｓｈ（　搬“ｒｕｂｎ＇ｐｅｓ）［Ｊ］．ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｌｒｙ，２ＯＯ２，７８Ｃ　：１７３－１７７．　ＢＬＡＣＨＩＥＲ　Ｆ，ＷＵ　Ｇｕｏｙａｏ，ＹＩＮ　Ｙｕｌｏｎｇ，ｅｔ　ａ１．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｐｉｇｓ［Ｍ］．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１３：　２１７—２２９．　ＱＩＵ　Ｂｉｎｇ，ＷＥＩ　Ｆｅｎｇｘｉａｎｇ，ＳＵＮ　Ｘｉｎｚｈｉ。ｅｔ　ａ１．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ　ｉｎ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｗｉｎｌ　ｔｈｒｅｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｃｅｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，ｌ０（２）：１　１５７－１　１６３．　ＧＢ／Ｔ　９６９５．２３－－２００８肉与肉制品：羟脯氨酸含量测定【ｓ】．北京：中　国标准出版社。２００８　ＳＡＮＫＡＲ　Ｓ，ＳＥＫＡＲ　Ｓ，ＭＯＨＡＮ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐａｒｔｉａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｏＨａｇｅｎ　ｓｈｅｅｔｆｒｏｍｆｉｓｈ（Ｌａｒｅｓｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）ｓｃａｌｅｓ［Ｊ］．　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏ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