一、牛外周血单核细胞的分离
1、采血袋采集200ml血液
2、首先在15ml离心管加3ml分离液（室温）
3、轻轻的将3ml全血加到3ml分离液中
4、400g室温离心30min
5、离心后，吸取白膜层（0.5cm）转移到新的离心管
6、加10ml的PBS或是培养基，进行混匀（枪轻轻吹打）
7、250g室温离心10min
8、加5ml的PBS或是培养基，进行混匀（枪轻轻吹打）
9、250g室温离心10min
10、重复8、9，加0.5ml培养液悬浮，
二、磁珠分选
11、将分离得到的 PBMCs 进行细胞计数。
12、离心细胞悬液，300×g，10 分钟。吸去上清。
13、将细胞沉淀用 buffer（含 0.5％BSA 的 PBS）悬浮，按每 107个细胞加 80μL buffer 和20μL 抗 CD14 磁珠，充分混匀，2-8℃孵育 15 分钟。
14、300×g，10 分钟。吸去上清。用 500μL buffer 重悬细胞。
15、将柱子放在磁珠分离器上，吸取细胞悬液加到柱子中，用 500μL buffer 清洗三遍柱子。
16、待清洗三遍后，将柱子从磁珠分选器上取下来，加入 1mL buffer，用助推器快速推动柱子中的洗脱 buffer，收集单核细胞，计数。
17、单核细胞 300×g 离心，10 分钟，用含 10％的胎牛血清、100U/mL 青链霉素、PH7.2-7.4 的 1640（IMDM） 全培养液调整细胞浓度为按 1×106单核细胞铺入 10cm培养皿，37℃5%CO2温箱中培养。
三、磁珠分选注意事项
1、柱容量：1×107 磁性标记细胞可上达2×108细胞总量。
注意：当分选的细胞比淋巴细胞大时，柱容量需减少。
2、建议白细胞样本大小：在106—2×108细胞总量中有104—107标记细胞
3、典型富集率：50fold至1000fold,取决于磁性标记的活力和特性，达到10000fold
富集量就可以分装两柱。
4、柱流动停止，不要干涸
5、Void容积:60ul.贮液器容积3.5ml
6、PBS典型的流量包含0.5%BSA：0.35-0.5ml/min。
7、MS柱不可重复使用。
MS柱的准备：
1、准备用buffer漂洗的MS柱：取500ul degassde buffer 到柱的上部，并使buffer流过全柱。MS 柱流动停止，不要干涸。
2、弃掉废液更换收集管。此时的MS 柱可用于磁珠分选。
注意：装满之后快速使用，避免温度升高产生气泡。用buffer装满柱的时间取决于贮存环境，温度和湿度。因此，时间可能从几秒到变到几分钟。这个时间并不影响分选质量。
用MS柱进行磁珠分选：
在进行下一步之前要等到柱子的贮液器是空的。
1、在500ul的degassed buffer中重悬上达108的细胞总量。
注意：细胞数目增加，按比例增加buffer体积。当新鲜抗凝血剂的血液或白膜层一起作用时，分选之前用buffer稀释为1：2。除去团块使细胞通过预分选过滤器。
2、将分选的细胞放至准备好的MS 柱上，收集流动的未被标记的细胞。
3、用3×500ul的degassed buffer清洗MS 柱。收集未标记的细胞使其与步骤2获得的结合。
注意：执行清洗步骤，柱子储液器一旦空了就要添加buffer
4、从分选器上取下MS柱，更换新的收集管
5、吸取1ml buffer至MS柱，快速驱赶片段伴有磁性标记细胞....（不懂）
6、为增加磁性标记细胞的纯度，经过第二个MS柱洗提片段可以增加其纯度。用一个新的柱子重复磁珠分选流程步骤2-5。
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