雷帕霉素产生菌的菌种选育和发酵的分析

摘要雷帕霉素作为一种高效新型的免疫抑制剂近年来受到许多新药研制单位的重视。本文研究了不同诱变方法对雷帕霉素产生茵正变率的影响。（发现紫外线单一因子处理．光复活较为有效：用这一条件处理得到一变株ｕＶ一８—６ｌ，其效价是出发菌株Ｚ２７的二一三倍，其产抗生素水平经连续传代证明非常稳定。经ＴＬＣ、ＨＰＬＣ分析证明该菌株发酵一一／＾效价的提高确实是源于雷帕霉素组分）本文中还研究了茵落形态与发／酵效价以及谤变后正变率与死亡率的关系。段明孢子丰富的梅花型或面包型茵落茵株发酵效价较高．以紫外线单一因子、光复活处理死亡～＾～率在９９．９—９９．９５％时正变率较高Ｊ另外，本文从代谢角度对高产株／与原株对碳、氮源的利用及葡萄糖一６一磷酸脱氢酶的活性进行了深入研究，发现二者在生长速度，碳、氮源的利用存在显著差别．ｒ尤其是Ｌ高产株葡萄糖一６一磷酸脱氢酶的活性明显高于原株，由此推断，高产株ＵＶ一８—５ｌ雷帕霉素产量的提高有可能是由于菌体生理代谢旺盛，参与戊糖一级代谢的Ｇ一６一Ｐ脱氩酶活性提高，由此增加了作为雷帕霉、素生物合戍环己烷前体莽草酸的供给．｝／。本文还以雷帕霉素发酵培养基为基本配方，研究了ＵＶ－￥．６１在２００Ｌ发酵罐中的发酵参数，研究了葡萄糖用量、糖化淀粉及补料对，雷帕霉素发酵的影响．（由于雷帕霉素是在茵丝内产生，为了适应菌种选育工作量大的要、求，本文通过研究建立了比较简便的从菌丝体测定雷帕霉素发酵生物活性的方法，并对固体发酵，液体发酵及测定发酵上清液或茵体中雷帕霉素的效价之阀进行了直线相关性分析比较，结果表明发酵上清液与菌体中雷帕霉素的效价之间有一定相关性．在菌种选育大量筛选＿Ｔ－作中测定发酵液上清液中的效价可作为初筛的指标。Ｌ叟／ｌＡＢＳＴＲＡＣＴＲａｐａｍｙｃｉｎｉｓａｐｏｔｅｎｔａｎｄｎｅｗｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅａｇｅｎｔ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏａｃｃｅｌｅｒａｔｅｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｃｌｉｎｉｃｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｉｔｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄ．ＩｎｔｈｉｓＰａＤｅｒｖａｒｉｏｕｓｗａｙｓｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｅｒｅｃａｒｄｅｄｏｕｔｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｏｆｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓＷＹ一９３．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｒａｙｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎｗａｓｍｏｓｔｅｆｆｅｃｔｉｖｅ．ＢｙｔｈｉＳｍｅａｎ．ａｎｉｎｄｕｃｅｄｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎＵＶ．８—６１ｗａｓａｃｑｕｉｒｅｄ．ＴｈｅｒａｐａｍｙｃｉｎｐｏｔｅｎｃｙｏｆＵＶ一８—６１ＷａｓａｔｌｅａｓｔｔＷＯｏｒｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓｍｏｒｅｔｈａｌｌｔｈａｔｏｆｔｈｅｐａｒｅｎｔｓｔｒａｉｎ，ａｎｄｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｖｅｒｙｓｔａｂｌｅｄｕｒｉｎｇｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅｐａｓｓａｇｅｓ．ＴＬＣａｎｄＨＰＬＣａｎａｌｙｓｅｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｒａｐａｍｙｃｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｐｒｏｄｕｃｅｄｂｖＵＶ墙一６１ｓｔｒａｉｎＷａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ．ＴｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｃｏｌｏｎｙｗｉｔｌｌｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙｗｉｔｈｐｏｓｉｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＷａｓａｌｓｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ．ｔｈｅｓｔｕｄｉｅｓｏｎｍｅｔａｂｏｌｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉＣＳｉｎｄｉｃａｔｅｄ也ａｔｍｏｒｅｒａｐｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｒａｔｅａｎｄｈｉｇｈｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｗｉｎｌｈｉｇｈｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃａｃｔｉｖ时ｏｆｇｌｕｃｏｓｅ一６－ｐｈＯＳｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ６Ｐ－ＤＨ）ｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｆｏｒＵＶ－８－６１ｔｈａｎｐａｒｅｎｔｓｔｒａｉｎ．ＴｈｉｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｍａｙｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏＧ６Ｐ－ＤＨａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｔｈｅｐｅｎｔｏｓｅｐａｔｈｗａｙｓｕｐｐｌｙｉｎｇｍｏｒｅｐｒｅｃｕｒｓｏｒｏｆｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｍｏｉｅｔｙｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ．ｎｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｇｌｕｃｏｓｅｉＩｌｍｏｄｉｕｎｌ．ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｏｆｓｔａｒｃｈｗｉｔｈｓａｃｅｈａｒｉｆｉｅｄｓｔａｒｃｈａｎｄｆｅｅｄｈａｇｍｅｄｉｕｍｄｕｒｉｎｇｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＵＶ一８—６１Ｗｅｒｅａｌｓｏｓｔｕｄｉｅｄｉｎ２００ｌｉｔｅｒｊａｒｆｅｒｍｅｎｔｏｒ．Ｓｅｖｅｒａｌｍｅｔｈｏｄｓｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｔｈｅｍｙｃｅｌｉｕｍｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｆａｃｉｌｉｔａｔｅｉｔｓｒｅｌｅａｓｅｆｒｏｍｍｙｃｅｌｉｕｍ．ＡｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｌｙｃｏｎｖｅｈｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒｍｅａｓｕｒｉｎｇｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｔｌｅｏｆｍｐａｍｙｃｉｎＷａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．ＴｈｅｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｏｎｓｏｌｉｄａｇａｒａｎｄｉｎｌｉｑｕｉｄｗａｓｓｔｕｄｉｅｄａｎｄｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｌｌｉｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓｕｐｅｍａｔａｎｔａｎｄｉｎｔｌｌｅｍｙｃｅｌｉｕｍＷａｓｃｏｍｐａｒｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｂｉｏａｓｓａｙｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎｔｉｔｌｅｉｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｓｕｐｅｍａｔａｎｔｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｉｎｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｉｎｌａｒｇｅｓｃａｌｅｏｆｓｔｒａｉｎｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔＷＯｒｋ．２前言雷帕霉素是三烯大环内酯类抗生素，其分子主要由一个３１员的大环组成；大环与一个七碳环己烷与一个含氮杂环相连。Ｖｅｚｉｎｉａ（９等人于１９７５年发现它具有抗真菌作用，以后Ｔａｎａｋａ等人又发现它是一种极有前途的免疫抑制剂并具有抗肿瘤作用４４。Ｔａｎａｋａ等研究表明，雷帕霉素具有很强的抗移植排斥反应作用，并能与环孢菌素Ａ协同延长移植物存活时间．雷帕霉索还能逆转正在进行的移植排斥反应一。另外，雷帕霉素还有预防和治疗实验性自身溶血性贫血的作用。总之，作为一种高效新型的免疫抑制剂，雷帕霉素在临床器官移植及治疗自身免疫疾病中具有重要意义。目前，国内外对雷帕霉素的分离纯化，药理和药动学研究以及临床应用，生物合成机制和调控因子等诸多方面的研究工作，已进行得较为详尽。但是，就雷帕霉素进入工业生产和临床应用而言，在这方面的研究，尚不令人满意。虽然对于雷帕霉素的生物合成与其基因的初步阐明为从分子水平上定向提高雷帕霉素的产率创造了条件，但基于其产生菌的特殊性，难以建立对外源基因的适宜的转化系统，加之许多其它因素的影响，使得在这方面的工作尚未取得较大进展。本文使用常规诱变育种手段，研究了不同诱变条件对雷帕霉素产率的影响，总结出简便而安全的紫外线处理是较好的诱变方法。这为提高雷帕霉素的效价提供了很有意义的实验手段。另外，由于雷帕霉素只有很少一部分会分泌出细胞外，绝大部分（约８５％左右）留在细胞内，因此很有必要找到一种快速、简便的检测手段，以适应大规模选种的要求。本文在这方面进行了较为细致的研究。１综述二抗生素产生茼的分子育种和杂交育种菌种选育的基本内容包括：逐步地用高单位的菌种代替低单位的菌种：用不产生色素的菌种代替产生色素的菌种或反之：用适应沉没培养的菌种代替表面培养的菌种；以及利用杂交技术，原生质体融合技术和分子克隆技术获得新抗生素和杂合抗生素Ｉ“】。长期以来我国菌种选育的目标比较单一，即以提高单位产量为唯一的指标。进入９０年代以来，对抗生素质量的要求大大提高，相应地，菌种选育技术也得到迅速发展。菌种选育技术，包括各种检测手段，已经从常规的诱变和筛选，发展到原生质体融合技术，分子水平的育种技术和理性化的筛选【２Ｉｌ。从各种诱变的方法所依据的基础理论来分，菌种选育的方法包括造成菌种基因突变的方法和导致菌种基因重组的方法两大类ｆ２１１。使用的手段主要有：自然（发）突变，人工诱交，杂交技术，原生质体融合技术和分子育种或基因克隆技术。各种选育方法各有所长和所适，也各有其不足之处。因此在菌种选育工作中，强调将传统的育种方法和ＤＮＡ重组技术等先进的手段相结合以提高抗生素的产量和质量１２ｈ２２ｌ以及制造新的抗生素。本文将主要针对原生质体融合技术和分子克隆技术在抗生素产生菌选育工作中所起的重要作用和主要方法做一些介绍。原生质体融合技术和ＤＮＡ重组技术带来了菌种选育史上的新革命，它已经给经济和社会带来了巨大效益，促进了微生物遗传学和分子生物学的发展，在实际应用领域有着巨大的潜力１２“。１杂交育种常规的杂交育釉是把两个基因型不同的菌株通过细胞吻合（或接合）技术使遗传物质重新组合，从中分离和筛选出具有新性状的菌株，由于细胞壁的存在能影响细胞融合，进而影响遗传物质重组的机率，是使常规杂交育种的应用受到限制的重要原因之一。１９７４年Ｏｋａｎｉｓｈｉ及其它学者对微生物原生质体形成和再生研究成功，促进了微生物基因技术的发展。微生物原生质体融合技术的出现，开辟了工业微生物育种的新途径。以原生质体及其融合为基础建立的快速育种技术，正应用于许多工业生产菌种的选育。不同种属闽原生质体融合导致其基因闻的重组，结果可以导致；生成新的抗生素，产生杂合抗生素：产生具有多种新性状的菌株。１．１原生质体融合产生新的抗生素ＹａｍａｓｈｉｔａＥ等人１２３１将Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕ￥的不产生ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＳＭ）的突变株ｓＳ．１１９８（对ＳＭ具有抗性）和产ｉｓｔａｍｙｃｉｎ（ＩＳ）的Ｓ．ｔｅ，！，ｆｍａｒｉｅｎｓｉｓＳＳ．９３９（对Ｋａｎａｍｙｅｉｎ．ＫＭ具有抗性）的原生质体与聚乙二酵（ＰＥＧ）混合并进行再生培养，挑选同时对ＳＭ和ＫＭ具有抗性的菌落（形成率为１酽），这些菌落生有孢子，它们的生长特性与Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ相同。在对２０．５０ｍｇ／ｍｌＫＭ和４００ｍｇ／ｍｌＳＭ具有抗性的菌株中检测到其产生的抗生素，这一抗生素与ＳＭ和１ｓ都不同，是一种新的抗生素。ＯｒｌｏｖａＴＩ１２４１也报道由ＰＥＧ．６００介导，将两个自发形成的营养缺陷型突变株Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｈｒｙｓｏｍａｌｕｓ３０５和Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．２６－１１５（二者都产ａｃｔｉｎｏｍｙｅｉｎＣ）融合，得到一些稳定的重组子。其中一个重组子菌株需补加脯氨酸才能生长，命名为ｒｅｃＰｒｏ重组菌株，它能产生一种对革兰氏阳性细菌和清酒酵母具有抗菌活性的抗生素物质，这是其亲本菌株所不能产生的。１．２原生质体融合产生具有多重新性状的菌株周秀芬等∞ｌ报道，将抗生素产生菌ＳｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｎｓＶａｔ．ｙｉｎｇｃｈｅｎｇｅｎｅｓ括和ＳｑｌｎｇｆｅｎｇｍｙｃｅＨｃｕｓ进行种间原生质体融合（重组率为４．５×１０４），结果发现，重组菌株在孢子的颜色，药物抗性，抗微生物活性和产抗能力等方面都与其亲本菌株不同。其中两个重组菌株Ｆ１＿，－４２和ＦＬ－４８，具有同时产生其双亲菌株分别所产生的两种抗生素的能力。同时它们还能合成其亲本菌株所不能合成的、具有抗微生物活性的两种化合物。２分子育种抗生素产生菌的分子育种主要是利用基因工程技术、原理和设备在分子水平上改良或刨造新的生产抗生素的菌种，这种菌种一般称为工程菌。它们在形态或生理，甚至在分类地位上都有可能发生改变，这些改变往往是一般常规育种手段所不能达到的，或者要花很长时间和很大工作量才能达到删Ｉ。分子育种的主要手段有：１）增加生物合成基因量而增加抗生素产量；２）导入强力的启动予或抗性基因而增加抗生素的产量；３）把两种不同的生物合成基因在体外重组和再导入后，而产生杂交抗生素；４）因偶然的机会被导入的基因激活了本来是沉默着的基因，从而合成出该菌前所未产生过的生物活性物质，包括新抗生素在内；５）从一个产生某种抗生素的供体中，把合成抗生素的整套基因簇，包括调节基因、抗性基因和生物合成基因等，通过载体导入另一株本来不产生抗生素的菌株中，而使这一菌株变成能生产某种抗生素的菌株：６）此外，也可把异源基因克隆到生产抗生索的菌株中表达ｆ２１Ｉ。本文分子育种的一些主要手段与迸展作一些介绍。２．１抗生素合成相关酶基因的克隆——构建抗生素工程菌王以光等人将碳霉素产生菌中４”位异戊酰基转移酶基因克隆至螺旋霉素产生菌，该基因编码的酰化酶将螺旋霉素转化为以异戊酰螺旋霉素为主要组分的４”位酰化螺旋霉素——称之生技霉素（现称为必特螺旋霉素）。药效学研究表明生技霉素的抗菌活性及治疗效果优于乙酰螺旋霉素，麦迪霉素和红霉素ｉ２６ｌ。青霉素酰化酶能将青霉素水解为６．ＡＰＡ和相应的侧链，这种酶主要由细菌产生。杨胜利等印ｌ用ＥｃｏＲＩ．ＰｓｔＩ双酶解的ｐＢＲ３２２为载体，用鸟枪法从大肠杆菌Ｄ８１６染色体克隆了青霉素酰化酶基因，以大肠杆菌Ｃ６００为受体，所得克隆株整体细胞酶学特性与供体大肠杆菌Ｄ８１６一致，以青霉素Ｇ作为底物时，转化产物为６．ＡＰＡ，工程菌的青霉素酰化酶的活性比供体大肠杆菌Ｄ８１６高２－４倍。２．２抗生素抗性基因扩增导致抗生素产量提高ＣｒａｍｅｒｉＲ等人【２０１将Ｓ．ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ菌株Ｍ１１６４的６’一Ｎ一乙酰转移酶基因克隆到高拷贝质粒ｐＩＪ７０２上，再将该质粒导入卡那霉素产生菌Ｓｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１２８５３）和新霉素产生菌Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ（ＡＴＣＣｌ０７４５）中。结果发现，所得到的含有重组质粒的转化子对一定数量的氨基糖甙类抗生素的抗性得到增强，并且卡那霉素和新霉素的产量得到实质性提高。这表明，增加与抗生素生物合成相关的特定基因的产物是提高抗生素产量的一种有效的措施。２．３基因工程产生杂合抗生素分子克隆技术的发展使得许多抗生索产生菌的生物合成基因得到成功地分离和克隆，这使得利用链霉菌之间的生物合成基因的转移技术获得新抗生素成为可能。然而，产生杂合化合物的可能是建立在生物合成酶的底物特异性的基础上的，目前关于这方面的研究还为之甚少。ＨｏｐｗｏｏｄＤＡｐＩ等人克隆了ＳｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＡ３的ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ生物合成途径中的全套基因，通过ａｅｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ产生菌和ｇｒａｎａｔｉｃｉｎ与ｍｅｄｅｒｍｙｃｉｎ的产生菌之间的基因转移，进而得到了新化合物。抗生素的杂交育种和分子育种是继自然选育和诱变育种之后发展起来的新的育种途径。它们是育种技术发展过程中的革命，同时也是传统育种方法的强有力的补充。由于许多生物工程抗生素是在许多基因的共同作用下产生的，因此，荦ｊ用新技术提高抗生素的产量及改造抗生暴并非很直接。因此，关于抗生素生物合成克隆基因的研究提示我们应该将重组ＤＮＡ技术与经典的育种技术相结合，从而达到预期的目的阎。材料与方法【实验材料】一、菌株雷帕霉素产生菌吸水链霉菌ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＷＹ９３一Ｚ２７，本实验室来源。ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ白色念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａ二、培养基１．分离培养基（Ｂｅｎｎｅｔｔ’ｓＹｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔａｌｂｉｃａｎｓ）１０３２１，本实验室保存。ａｇａｒ．％１：０．１Ｏ．１０．２１．０１－２牛肉膏ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ葡萄糖琼脂自然ｐＨ２．斜面培养基（天门冬素培养基。％）：天门冬素Ｋ２ＨＰＯ。０．０５Ｏ．０５１．０葡萄糖琼脂１．２ｌＯ磅消毒，３．种子培养基（％）：黄豆饼粉葡萄糖淀粉（ＮＨ。ｈｓｏ。ＫＨ２Ｐ０４２．Ｏ２．５１．０Ｏ＿３０．０５０．０５０．２自然ｐＨＭｇＳ０４ＣａＣＯｌｔ６４．液体发酵培养基ｆ％）：黄豆饼粉葡萄糖州Ｈ４）２Ｓ０４ＫＨ２Ｐ０４ＣａＣｏ，３．０３．５０．５０．３０．３５．检定培养基（％）葡萄糖酵母膏鱼胨琼脂ｐＨ８．０４．０Ｏ．５Ｏ．５１．２（消前８．５）三、缓冲液１．ｐＲ６．０磷酸缓冲液Ｋ２ＨＰ０４ＫＨ２Ｐ０４２９８９Ｈ２０１０００ｍｌ２．ｐＨ７．６柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液１．０ｍＭ０．１ｍＭＥＤｌ’ＡＤＴＴ５．０ｍＭ葡萄糖０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸６．３５ｍｌ与０．２ｍｏｌ／ＬＮａ２Ｉ－ＩＰ０４５１．５ｍｌ混和。四、试剂：Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ，Ｏｘｏｉｄ公司产品；Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，Ｓｉｇｍａ公司产品：甲基磺酸乙酯ＥＭＳ（ｅｔｈｙｌＳｉｇｍａ公司产品；天门冬素，ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｄｅ），同本进口分装：酵母膏，北京海淀微生物生物培养基制品厂出品：鱼胨（Ｆ４０３），上海东海制药厂出品：ＮＡＤＰ－Ｎａ２，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ公司产品：Ｄ．Ｇｌｕｃｏｓｅ，６，Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｎａ２．Ｓｉｇｍａ公司产品。五、仪器紫外灯：波长２５３．７ｎｍ，功率３０Ｗ。超声波仪器型号为美国Ｃｏｌｅ．Ｐａｍｅｒ公司６００．Ｗ型超声波破碎仪［实验方法】１．诱变处理将＆ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｅｕｓ７＿２７新鲜斜面用２０％甘油（ｏ．１％吐温８０）洗下，过滤，制成单孢子悬浮液，经水稀释后取１０ｍｌ倒入无菌平皿，置于波长２５３．７ｎｍ，功率３０Ｗ紫外（ＵＶ）灯下３０ｃｍ处开盖振摇照射。于不同照射时间分别取样，涂布分离培养基平皿，于２５。ｃ培养１５天左右。（Ｉ）ＵＶ照射，光复活：即紫外线照射后的操作过程均在可见光照射下进行。（２）ＵＶ照射，暗修复：即ＵＶ处理后的孢子液连同对照一起放入“黑匣子”，置４。Ｃ冰箱过夜（２４ｈ），然后取出稀释涂布。（３）ＵＶ和０．８５％ＬｉＣｉ前处理：将过滤后的单孢子原液加水至１０ｍｌ，按Ｏ．８５％终浓度加入灭菌的ＬｉＣｌ水溶液，在２８０Ｃ摇床作用６小时后立即取出进行ＵＶ照射，然后稀释涂布。（４）０．５％ＬｉＣＩ后处理：单孢子悬液经ｕｖ处理后，稀释涂布于Ｏ．５％ＬｉＣＩ的分离培养基平皿上，２５０Ｃ培养２０天。（５）甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）处理：在涂有一定稀释度的雷帕霉素产生菌平皿中放一牛津杯，将不同浓度（０．０５Ｎ，０．１Ｎ，０．２Ｎ，０．３Ｎ，０．４Ｎ，Ｏ．５Ｎ和１Ｎ）的ＥＭＳ溶液分别加满牛津杯，以相同稀释度的雷帕霉素产生菌平皿为对照，２５。Ｃ培养１４．１８天。２．斜面培养：将在Ｂｅｎｎｅｔｔ’ｓａｇａｒ平皿上长好的单菌落接种在葡萄糖天门冬素培养基斜面上，于２５。ｃ培养１５天后进行液体发酵。３．摇瓶发酵：１Ｒ种子培养：于２５０ｍｌ三角瓶内装５０ｍ１种子培养基，由斜面按种后于２８。Ｃ振摇培养４８小时。发酵培养：于５００ｍｌ三角瓶内装５０－－１００ｍｌ培养基，由种子以５％接种量转种后于２５。Ｃ振摇培养９６小时。４．液体发酵生物活性测定方法：４．１Ｉ％ＳＤＳ破细胞法：取２ｍｌ发酵液于小试管内，离心后于液面水平处作刻度，倒掉上滴液。加Ｉ％ＳＤＳ至刻度处（即加至２ｒｏｔ），置６０－－，６５。Ｃ水浴保温２０分钟，取出，加２ｍｌ二甲基甲酰胺，混匀后离心，取上清液以ｐＨ６．０磷酸缓冲液稀释后以白色念珠菌作为检定菌，．以雷帕霉索ＨＰＬＣ９５％纯度样品为标准品，以杯礤法进行生物检定。４．２．超声波破碎：取发酵液５ｍ１．冰浴超声破碎。时间：８分钟（每次８”．间歇２”）取破碎后样品２ｍｌ于小试管内，加６ｍｌＮ，Ｎ二甲基甲酰胺，混匀，离心后取上清液用ｐＨ６．０磷酸缓冲液稀释后进行生物检定。４．３超声波破碎与ＳＤＳ处理：超声波处理后的样品２ｍｌ于小试管内，加２ｍｌＩ％ＳＤＳ，６０￣６５。Ｃ水浴保温２０分钟后取出，加４ｍｌ二甲基甲酰胺，混匀，离心．上清液稀释后进行生物检定。４．４甲酵或９５％乙醇漫泡处理：取２ｍｌ发酵液，离心，于液面水平处作刻度，弃上清，菌体加甲醇（或９５％乙酵）至刻度，再加２ｍｌ甲酵（９５％乙醇）混匀加塞，摇床振摇ｌ一３小时后离心，上清液稀释后进行生物检定。４．５Ｎ，Ｎ二甲基甲酰胺处理基本同４．４．只是操作中不需加橡皮塞。４．５直线相关分析相关分析是研究两个随机变量ｘ与Ｙ之间相互关联情况的常用统计学方法。此处所指的相关即直线相关，适用于Ｘ和Ｙ服从二元『Ｆ态分布的资料。两变量之间的相互关联情况用相关系数（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）ｒ来表示。ｒ的计算公式为：∑∞－－）（ｙｉ—Ｉ）ｌｘｙ＝———’。—‘——。—“。一∥ｌｘｘ·ｌｙｙ。Ｊ。’。。。。。。‘。。。。。。。－。。。。一实际工作中已采用计算机进行数据处理，ｒ的取值范围在．１＜ｒ＜ｌ之间。ｒ为负值时，两变量的关系为负相关：ｒ为正值时，两变量的变化方向一致，为正相关。”。统计学中规定ｌｒＩ＞０．７时，两变量ｘ与Ｙ的相关性较强；０．４＜ＩｒＩ＜ｏ．７时，Ｘ与Ｙ呈中等程度的相关性；ｉｒＩ＜０．４时，ｘ与ｙ的相关性较弱。这里Ｘ和Ｙ分别表示某一菌株其发酵上清液在检定平板上的抑菌圈直径与标准品抑菌圈直径之差值和该菌株菌体中雷帕霉素的效价。另外，考虑到实验中可能存在抽样误差．所以须做相关系数假设检验，常用ｔ检验的方法，这里不再作详细叙述。５．雷帕霉素产生菌菌株生物活性的固体测定法：将Ｂｅｎｎｅｔｔ’ｓａｇａｒ培养基平板上长成的单菌落分别接种在注有同样培养基的牛津杯内，２５。Ｃ培养ｌＯ天后，将长有培养物的牛津杯直接置于含有白色念珠菌平皿上测定抑菌圈。６．ＴＬＣ、ＨＰＬＣ的分析：６．Ｉ雷帕霉素的ＴＬＣ分析：发酵液离心后菌丝用三倍体积的９５％７，醇浸泡２—３小时，在硅胶板上点样，用丙酮：正已烷２：３展开，溶媒挥发后在含白色念珠菌检定平板上铺板显迹。用雷帕霉素标２ｎ准品作为对照。６．２波拉霉素（ｐｏｉｏｒａｍｙｃｉｎ）的ＴＬＣ分析：发酵液离心后菌丝加９５％乙醇至原体积，浸泡２—３小时，在硅胶板上点样。用异丁醇：水４：ｌ展开，溶媒挥发后在含枯草杆菌检定平板上铺板显迹。用波拉霉素粗品作为对照。６－３ＨＰＬＣ分析：用岛津Ｌｃ一６Ａ，Ｓｈｉｒｎａｄｚｕｓｈｉｍ－ｐａｃｋＯＤＳ柱，检测波长为２７７ｎｍ，流动相８０％甲醇，流速１ｍｌ／ｍｉｎ．７．８．９．还原糖的测定：］菖［酮比色定糖法“’。氨基氮的测定：甲醛法４”。发酵液总蛋白含量的测定：Ｆｏｌｉｎ－酚法“’。１０．葡萄糖．６．磷酸脱氢酶的活性检测：于不同时间分别取发酵液１０ｍｌ，离心，弃上清，将菌体用Ｏ．９％ＮａＣ！溶液洗两次后，加入柠檬酸－Ｎａ２ＨＰＯ。缓冲液５ｍｌ，混匀，冰浴中超声波破碎８分钟（１０ＨＺ，１００Ｗ），取出，４０Ｃ１２，ｏｏｏｒｐｌｎ离心２０ｍｉｎ，上清即为粗酶液（稀释后即可由Ｆｏｌｉｎ．酚法测定其总蛋白浓度）。将不同溶液按以下比例加入：Ｏ．５８ｍｌＨ，Ｏ，０．１０ｍｌＮＡＤＰ－－Ｎａ２溶液，Ｏ．１０ｍｌＴｒｉｓ．ＨＣＩ缓冲液，Ｏ，１０ｍｌＭｇＣｌ２溶液，Ｏ．１０ｍｌＧ．６－Ｐ－Ｎａ２溶液，０．０２ｍｌ粗酶液。加好后混匀，移入石英比色杯中，记下３３９ｎｍ的光吸收值。室温（２５。Ｃ）反应，２．３ｍｉｎ后丌始读数。每隔一分钟读～次，连续读３－５ｍｉｎ，取平均值，据ｂ＝８０９５×△Ａ／Ａｔ（Ｕ／Ｌ）计算酶活力。’。由酶活力除以相应粗酶液的总蛋白浓度即知其相对活力。１１．菌丝干重的测定：于不同时间取定量发酵液，离心，弃上清，用无菌水洗两次，置８０一１００。Ｃ烤干至恒重。２Ｉ第三部分雷帕霉素产生菌ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｌｃｕｓＷＹ一９３发酵的研究进行大规模发酵和工业化生产，是菌种选育的最终目的·本文以雷帕霉素发酵培养基为基本配方，试验了ｕ－ｖ·８·６１在２００Ｌ发酵罐中的发酵参数，研究了葡萄糖用量、淀粉液化、淀粉糖化及补料对雷帕霉素发酵的影响。上罐的培养基配方及补料情况如下：１号（％）２号（％）３号（％）黄豆饼粉３．０３．０３．０葡萄糖４．５２．５一（ＮＨ４）２ｓ０４０．５０．５Ｏ·５ＫＨ２Ｐ０４０．３０．３０．３ＣａＣＯ，０．３Ｏ．３Ｏ．３淀粉一２．０（液化）４．５（糖化）（淀粉：糖化酶３００：１）消沫剂：０．０２％，豆油：Ｏ．５％，配料体积：８０Ｌ。补料：配方同１号培养基。分别在不同时间补Ｏ．６２％葡萄糖。将不同次罐上实验中不同时间雷帕霉素的发酵效价与培养基中葡萄糖浓度的关系作图１－５（补全料图略）：４＆５伽伽３Ｅ８Ｚ５ｂ２躲隧，５毛，ｎ￥鼹崮，０与厍丽０俄俩∞∞加ｏＩ＝！二竺塑Ｉ０１１１９２７３５４３５１５９６＂１７５发酵时问帅图ｌ未补料（１号培养基）Ｅ宫２鬻匿蜊发酵时阃Ｖｈ图２添加液化淀粉（２号培养基）４５１６０４１４０３５１２０３２５１００毛２８０娄Ｅ。ｏｌ，口冁隧瞄１５６０嵌１４００５２００００１２２０２８３６４４５２６０６８７６８４发酵时间柏图３以糖化淀粉代替葡萄糖（３号培养基）４３５２∞３２５１５０Ｅｊ２蠡１５１００餐Ｅｏ＝ｏ繇曙瞄１Ｏ５Ｏ０ｉ＋ｌ萧萋｜０８１６２４３２４０４４４８５６６４７２８０８８９６发酵时间仲图４４４小时补葡萄糖３２．５１８０１６０１４０Ｅｏ２１５１２０—ｂ辩匿嘲１００｛８０囊６０４０１Ｏ．５２０仁００Ｏ１３２１２９３７４５４９５０５３６１６９７７８５９３１０１１０９发酵时间ｔ／ｈ图５４９小时补葡萄糖结果与讨论实验结果（参考图１—５）表明：Ｉ）减少葡穗糖用量，添加液化淀粉．发酵效价有一定提高．用糖化淀粉取代葡萄糖，笈群效价基本不变．２）在发酵进入稳定期初始，补加葡萄糖对发酵效价较为有利．３）补培养基基本配方的Ｉ／４对发酵效价提高没有作用．另外，ＵＶ－￥－６１在２００Ｌ发酵罐中效价可达到２＠Ｏｕ／ｍ！左右在摇瓶中效价瞥达掰２３０ｕ／ｍｌ左右．一第四部分雷帕霉素发酵生物活性的测定方法由于雷帕霉素系胞内抗生素，其分泌到细胞外的量只占其细胞产生雷帕霉素总量的一小部分（有文献报道占其总量的１５％左右，我们的实验也证实了这一点），所以在测定发酵液效价时须使其从菌体内释放出来。我们试用了一系列破碎细胞和溶菌处理的方法，发现用ＳＤＳ裂解细胞再用Ｎ，Ｎ二甲基甲酰胺溶出的方法比较简便可行。为适应大量选种的需求，我们尝试了以固体发酵取代液体发酵进行初筛和直接测定发酵上清液的生物效价的方法，经统计学分析发现后者是可取的措施。蛄果与讨论１．不同方法处理菌丝测定雷帕霉素发酵效价的比较文献“’中雷帕霉素发酵效价的测定是采用先将菌丝离心沉淀，再用甲醇或乙醇浸泡菌丝体的方法，我们在工作中发现这种方法需要较长的时间，而且由于是用湿菌体浸泡需用较大量的甲醇或乙醇，以保证甲醇或乙醇的最终浓度在８０％以上，否则浸泡不完全，这对进行育种大量筛选工作不利，为此我们研究了不同方法对菌丝进行处理以使雷帕霉素能最大限度的从茵丝中释放出来。表ｌ中列举了超声波及ＳＤＳ处理菌丝后雷帕霉素生物效价测定情况表１超声波，Ｉ％ＳＤＳ与超声波＋Ｉ％ＳＤＳ处理后雷帕霉素生物效价的比较菌株超声波破碎Ｉ％ＳＤＳ超声波编号效价百分数效价百分数＋Ｉ％ＳＤＳｆ％）．Ｃ％）效价百分数（％１１１００１００９３．６２８Ｓ．Ｏ８５．０１００３７０．０ｌｏｏ８０．０４７５．０１００９１．７５１００１００９６．９６１００８８．９９１．７７７７．４１００１００８８８．９１００８８．９９６４．４１００７０．６１０８６．１ｌｏｏ８８．９·注：此处指几种测定方法中同一菌株比较的相对效价，以效价最高的作为１００％，以下同。由表１看出。Ｉ％ＳＤＳ裂解菌丝细胞后所测效价较其它两种方法高，说明ＳＤＳ裂解细胞后抗生素释放比较完全。为了验证这一点，我们选用雷帕霉索溶解度较高的Ｎ，Ｎ二甲基甲酰胺作为溶剂，直接浸泡菌丝，并用文献上常用的甲醇、乙醇浸泡与ＳＤＳ处理菌丝进行了比较，结果见表２，３，４。表２ＳＤＳ裂解菌丝与二甲基甲酰胺直接溶出法因为已知甲醇浸泡菌丝释放雷帕霉素比较完全，所以只测四组数据供参考。实验结果表明用ＳＤＳ裂解菌丝所测得的雷帕霉素发酵效价与溶剂法接近。实际操作比较简便、省时，而且比溶剂法成本低，并可避免甲醇等溶剂的毒性，故比较适用于大量发酵样品的检测。表３甲醇溶解与ＳＤＳ裂解菌丝生物效价测定的比较菌株甲醇处理Ｉ％ＳＤＳ处理编号效价百分数效价百分数（％）（％）１１００９６．４２ｌｏｏ９０．５３１００１００４１００８８．９表４乙醇溶解与ＳＤＳ裂解菌丝生物效价测定的比较菌株９５％已醇处理ＳＤＳ处理编号效价百分数效价百分数（％）ｒ％１ｌ１００９３．８２５７．６１００３９６．９１００４８３．７１００５９２．８１００６９７．２１００７９２．８１００Ｂ１００１００９１００９６．９１０８１．８１００１ｌ８７．５ｌｏｏ１２７７．５ｌｏｏ１３１００９６．７１４８０４３。５２固体法测定雷帕霉素发酵生物活性的可行性为了适应菌种选育大量发酵工作的需要。我们比较了固体发酵与液体发酵法生物活性所得结果的平行关系，通过对大量菌株两种方法所得效价值进行的直线相关分析，测得其相关系数ｒ为一０．０９２，相关系数ｒ的ｔ检验表明在兼顾抽样误差情况下，二者没有任何正相关关系，即固体发酵法中产生抑菌圈大的菌株，其产抗生素水平并不一定高。所以，即使是初筛，也不能采用固体发酵法。３液体发酵上清液效价与菌体效价的关系由于雷帕霉素有少量是分泌于发酵液中，其分泌量的多少有可能与其菌体内的产量有ｊ下相关性。我们同样利用直线相关分析法对发酵上清液效价与菌体的效价进行线性分析，并对其相关系数ｒ进行ｔ检验以排除抽样误差因素，将不同诱变条件处理后的菌株进行发酵，４ｌ测定其上清液及菌丝体中的生物活性所得四组数据，其相关系数ｒ分别见表５。结果表明，上清液效价与菌体效价有不同程度的正相关关系。其中，ｕｖ单因子处理、光复活和ｕＶ单因子处理、暗修复两种方法中菌体效价与发酵上清液效价呈中等程度以上的正相关性。因此，在这种情况下可以用测定发酵上清液效价取代测定菌体效价来进行初筛工作，以排除大量低产型菌落。但同时也发现，ＵＶ结合０．５％１ｉＣｌ后处理与甲基磺酸乙酯处理后，发酵上清液效价与菌体效价的相关性较弱，推测可能是由于ＬｉＣＩ与ＥＭＳ等一些化学物质对细胞有一定程度的损伤作用，影响到其细胞膜的通透性，使胞内外抗生素的含量的线性关系降低。因此。在对菌株进行化学诱变处理后，以上方法不一定再适用。表５不同诱变条件处理菌种发酵上清液与菌丝效价相关性分析诱变条件相关系数１）ＵＶ＋０．５％１ｉＣｌ后处理＋０．２５３２）ｔｒｙ单因子处理（光复活）＋ｏ．５４８３）ｔｒｙ单因子处理（暗修复）＋ｏ．５４４４１甲基磺酸乙酯＋０．２２４本研究在使雷帕霉素从胞内释放的方法学方面进行了比较，认为用ＳＤＳ裂解细胞再用Ｎ、Ｎ二甲基甲酰胺溶出的方法比较省时，雷帕霉素的释放也比较完全。同时，发现测定发酵液上清液抗白色念株菌的活性与胞内雷帕霉素的含量有平行关系，用抗白色念株菌活性检测胞内雷帕霉素的含量与ＨＰＬＣ检测的雷帕霉素组分也有一定的平行关４２系（数据略）。虽然。在ｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ发酵液中也含有其他抗白色念株菌的组分，但在我们以白色念株菌作为捡定菌，用雷帕霉素标准品制作生物检定标准曲线时所选用的条件是对雷帕霉素最敏感的（中心浓度为２ｕ∥ｍ１）。在这样的条件下抗白色念株菌的活性主要反映雷帕霉素的含量，因此本研究所建立的雷帕霉素生物活性检测方法有一定的实际意义。参考文献１．ＶｅｚｉｎａＣ，ＫｕｄｅｌｓｋｉＡ，ＳｅｈｇａｌＳＮ．Ｊ＝Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９７５，２８（１０）：７２１—７２６．２．ＴａｎａｋａＨ，ＫｉｒｏｄａＨ，ＭａｒｕｓａｗａＨｅｔａ１．ＺＡｍ．Ｃｈｅｍ．ｓｏｃ．１９８７，１０９：５０３１．５０３３．３．ＣａｌｎｅＲＹＣｏｌＨｅｒＤＳｔＪ，ＬｉｍＳｅｔａｌ．Ｌａｎｃｅｔ１９８９，２２Ｚ４．ＤｏｕｒｏｓＪ，ＳｕｆｆｎｅｓｓＭ．ＣａｎｃｅｒＴｒｅａｔ．Ｒｅ＇Ｖ，１９８１，８：６３—８７．５．ＲｅｙｎｏｌｄｓＫｏｖｉｎＡａｎｄＤｅｍａｉｎＡｒｎｏｌｄＬ．ＢｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ｒｅｖｉｓｅｄａｎｄｅｘｐａｎｄｅｄ，ｅｄ．ＢｙＳｔｒｏｈｌＷｉｌｌｉａｍＲ．ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＩｎｃＮｅｗＹｏｒｋ．ＨｏｎｇＫｏｎｇ，４９７—５２０６．Ｏ’ＨａｇａｎＤ．ＴｈｅＰｏｌｙｋｅｔｉｄｅＭｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄ：ＥｌｌｉｓＨｏｒｗｏｏｄ，１９９１．７．ＰａｉｖａＮＬ，ＤｅｍａｉｎＡＬ，ＲｏｂｅｒｔｓＭＦ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆａｃｅｔａｔｅ，ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ，ａｎｄｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｉｎｔｏｒａｐａｍｙｃｉｎｂｙＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ．ＪＮａｔＰｒｏｄ１９９ｌ：５４：１６７—１７７．８．ＭｃＡｌｐｉｎｅＪＢ，ＳｗａｎｓｏｎＳＪ，ＪａｃｋｓｏｎＭ，ＷｈｉｔｌｇａｌｌＤＮ．ＲｅｖｉｓｅｄＮＭＲａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓｆｏｒｒａｐａｍｙｃｉｎＪＡｎｔｉｂｉｏｔ１９９１；４４：６８８·６９０．９．ＰａｉｖａＮＬ，ＤｅｍａｉｎＡＬ，ＲｏｂｅｒｔｓＭＦ，Ｔｈｅｉｍｍｅｄｉａｔｅｐｒｅｃｕｒｓｏｒｏｆｔｈｅｎｉｔｒｏｇｅｎ—ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｒｉｎｇｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎｉｓｆｒｅｅｐｉｐｅｅｏｌｉｃａｃｉｄ．ＥｎｚＭｉｃｒｏＴｅｃｈｎｏｌ１９９３；１５：５８１－５８５．１０．ＢｙｍｅＫＭ，ＳｈａｆｉｅｅＡ，ＮｉｅｌｓｅｎＪ，ＡｒｉｓｏｎＢ，ＭｏｎａｇｈａｎＲＬ，ＫａｐｌａｎＬ．Ｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｏｆａｎｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ，ｉｍｍｕｎｏｍｙｃｉｎ，ｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓｖａｔ．Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ．ＤｅｖＩｎｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ１９９３；３２：２９—４５．４４Ｉ１．ＰａｉｖａＮＬ，ＲｏｂｅｒｔｓＭＦ，ＤｅｍａｉｎＡＬ．ＴｈｅｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｍｏｉｅｔｙｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎｉｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｓｈｉｋｉｍｉｃａｃｉｄｉｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ．ＪＩｎｄＭｉｃｒｏｂｉｏ１９９３；１２：４２３－４２８．１２．ＳｃｈｗｅｃｋｅＴ＇ＡｐａｒｉｃｏｊＦ，Ｍｏｌｎａｒ，Ｉ，ＫｏｎｉｇＡ，ＫｈａｗＬＥ，ＨａｙｄｏｃｋＳＦ，ＯｌｉｙｎｙｋＭ，ＣａｆｆｒｒｅｙＰ，ＣｏｒｔｅｓＪ，ＬｅｓｔｅｒＪＢ，ＢｏｈｍＧＡ，ＳｔａｕｎｔｏｎＪ，ＬｅａｄＩａｙＰＥＴｈｅｂｉｏｓｙｎｌｈｅｔｉｃｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒｆｏｒｔｈｅｐｏｌｙｋｅｌｉｄｅｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔｒａｐａｍｙｃｉｎ。ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１９９５；９２：７８３９－７８４３．１３．ＣｏｒｔｅｓＪ，ＨａｙｄｏｃｋＳＦ，ＲｏｂｅｒｔｓＧＡ，ＢｅｖｉｔｔＤＪ，ＬｅａｄｙＰＦ．Ａｎｕｎｕｓｕａｌｌｙｌａｒｇｅｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｉｎｔｈｅｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅｏｆＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈｒｅａ．Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｔｉｏｎ）１９９０；３４８：１７６－１７８．１４．ＤｏｎａｄｉｏＳ．ＳｔａｙｅｒＭＪ，ＭｃＡＩｐｉｎｅ腰，ＳｗｗａｎｓｏｎＳＬＫａｔｚＬ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｇｅｒｍｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｃｏｍｐｌｅｘｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９１；２５２：６７５－６７９．１５．ＭａｃＮｅｉｌＤＪ，ＯｃｃｉＪＬ，ＧｅｗｍｎＫＭ，ＭａｅＮｅｉｌＴ＇ＧｉｂｂｏｎｓＰＨ，ＲｕｂｙＣＬ，ＤａｖｉｓＳＪ．ＣｏｍｐｌｅｘｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＳｔｍｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅａｖｅｒｍｅｃｔｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒ．Ｇｅｎｅｌ９９２；１１５：１１９－１２５．１６．ＡｐａｒｉｅｏＪＦ，ＭｏｌｎａｒＩ．ＳｃｈｗｅｃｋｅＴ’ＫｏｎｉｇＡ，ＨａｙｄｏｃｋＳＦＩＫｈａｗＬＥ，ＳｔａｕｎｔｏｎＪ，ＬｅａｄｌｅｙＰＥＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒｆｏｒｒａｐａｍｙｃｉｎｉｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｏｍａｉｎｓｉｎｔｈｅｍｏｄｕｌａｒｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ．Ｇｅｎｅ１９９６；１９６：９－１６．１７．ＳｔａｕｎｔｏｎＪ，ＣａｆｆｒｅｙＰ，ＡｐａｒｉｃｏＪＦ，ＲｏｂｅｒｔｓＧＡ，ＢｅｔｅｌＳＳ，ＬｅａｄｌｃｙＰＦ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒａｄｏｕｂｌｅ－ｈｅｌｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｆｏｒｍｏｄｕｌａｒｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅＳｙｎｔｈ鹳ｅｓ．ＮａｔＳｔｒｕｃｔＢｉｏ１９９６；３：１８８－１９２．１８．ＷａｌｌａｃｅＫＫ，ＲｅｙｎｏｌｄｓＫＡ。Ｋｏｃｈｋｅｔａ１．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓｔｕｄｉｅｓｏｆａｓｃｏｍｙｃｉｎ（ＦＫ５２０）：Ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ（１Ｒ，３Ｒ，４Ｒ）一３，４一ｄｉｈｙｄｍｘｙｃｙｅｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ—ｄｅｒｉｖｅｄｍｏｉｅｔｙ．ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃｌ９９４；１１６：１１６００一１１６０１．４５１９．ＭｏｌｎａｒＩ，ＡｐａｒｉｃｏＪＦ，ＨａｙｄｏｃｋＳＦ，ｅｔａ１．ＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒｆｏｒｒａｐａｍｙｃｉｎｉｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｇｅｎｅｆｌａｎｋｉｎｇｔｈｅｐｏｉｙｋｅｔｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ．Ｇｅｎｅ１９９６；１９６：９－１６．２０．ＮｉｓｈｉｄａＨ，ＳａｋａｋｉｂａｒａＴ，ＡｏｋｉＦ＇ｅｔａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｎｏｖｅｌｒａｐａｍｙｅｉｎｓｔｘｕｃｔｕｒｃｓｂｙｍｉｃｒｏｂｉａｌｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ．ＪＡｎｔｉｂｉｏｔ１９９５；４８：６５７—６６６．２１．刘颐屏，周光分，贺秉坤‘抗生素菌种选育的理论和技术》１９９２．２２．ＣｈｍｅｒＫＥＴｈｅｉｍｐｒｏｖｉｎｇｐｍｓｐｅｅｔｓｆｏｒｙｉｅｌｄｉｎｃｒｅａｓｅｂｙｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｉｎａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．Ｂｉｏｔｏｃｈ（ＮＹ）１９９０；８（２）：１１５－２１０．２３．ＹａｍａｓｈｉｔａＦ＇ＨｏｔｔａＫ，ＫｕｒａｓａｗａＳ，ｅｔａ１．Ｎｅｗａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＳｔｒｅｐｔｏｍｙｅｅｔｅｓ，ｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｓａｍａｒｋｅｒ．１．ＮｅｗａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｇｅｎｅｒａｔｅｄｂｙｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｆｕｓｉｏｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｂｅｔｗｅｅｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓａｎｄＳ．ｔｅｎｊｉｍａｒｉｅｎｓｉｓ．ＪＡｎｔｉｂｉｏｒ（Ｔｏｋｙｏ）１９８５；３８（１）：５８－６３．２４．ＯｒｌｏｖａＴＩ，Ｆｕｓｉｏｎｏｆｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ０ｆｉｎａｃｆｉｖｅｖａｒｉａｎｔｓｏｆ２ｐｒｏｄｕｃｅｒｓｏｆａｃｔｉｎｏｍｙｅｉｎＣａｎｄｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆａｎａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｏｆｎｏｎ－ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎｎａｔｕｒｅ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｋｈｉｍｉｏｔｅｒ１９９１；３６（４）：３一ｉ２５．ＺｈｏｕＸＦ，ＺｈｏｕＱ，ＩｎｔｅｒｓｐｅｅｉｆｉｃｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｆｕｓｉｏｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓｖａｒ．ｙｉｎｇｃｈｅｎｇｅｎｅｓｉｓｗｉｔｈＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｑｉｎｇｆｅｎｇｒｎｙｃｅｔｉｃｕｓａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｒｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ．ＣｈｉｎＪＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１９８９；５（３）：１６ｔ．２６．尚广‘东，戴剑漉，王以光，生技霉素稳定型基因工程菌的构建，生物工程学报，１９９９，１５（２）：１７ｌ。２７杨胜利等：青霉素酰化酶基因的克隆与表达【：青霉素酰化酶基因的克隆，生物ｌ：程学报１９８５：ｌ（１）：２５～３５。２８．ｒａｍｅｒｉＲＤａｖｉｅｓＪＥ，Ｉｎｃｒｅａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈａｍｐｌｉｆｉｅｓｄａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｙｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓ．２９．ＨｏｐｗｏｏｄＤＡ，ＭａｌｐａｒｔｉｄａＦ＇ＫｉａｓｅｒＨＭ，ｅｔａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ‘Ｈｙｂｒｉｄ’４６ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｂｙｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ１９８５；１８－２４；３１４（６０１２）：６４２－４３０．倪宗瓒等，《医学统计学》，１９９６，１０４３１．生物化学实验指导，北京大学生物系，１９８３，３０．３１，７３—７５，９３．９４３２．ＪＱｇｅｎＢｅｒｇｍｅｙｅｒａｎｄＭａｒｉａｎｎｅＧｒａＢｌ．ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍａｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ，ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ｖ０１．ＩＩＩ，１９８３，１９０－１９７４７结语本论文研究工作取得以下结果ｔ１、通过研究不同诱变方法对雷帕霉素产生菌正变率的影响，总结出紫外线处理、光复活为较有效的处理手段。用这一条件处理得到一变珠ＵＶ－８．６１，其效价是出发菌璩的二倍以上，其产挽水平经连续传代证明非常稳定．ＴＣＬ、ＨＰＬＣ分析还表明，ＵＶ－８－６１的组分与原株和大多数其它菌株相比较得到很大改普．发酵效价的提高主要为冒帕霉素。２、通过对ｕｖ．８．６１和原株的生理代谢的研究，发现二者在生长速度，碳、氮源的利用及葡萄糖．６－磷酸脱氢酶的活性方面存在明显差别。由此对ＵＶ－８．６１霄帕霉素产量的提高作了合理推断。３、对ｕｖ．８－６１发酵放大的研究表明。减少葡萄糖用量，添加液化淀粉。发酵效价有一定提高ｌ在发酵进入稳定期初始，朴加适量葡萄糖对发醇效价提高较为有利．４、对胃帕霉素固体和液体发酵的统计学分析表明，不能以固体发尊法来检测臂帕的生物活性，但在大量选种工作中可以用测量液体发酵上清液的抑曹圈大小来代替破碎菌体的复杂±多骤．５、通过研究不同的溶菌和破碎菌体的方法中置帕霉素的释放情况，发现用ＳＤＳ裂解细胞再用Ｎ。Ｎ二甲基甲耽胺涪出是比较简便、安全和经济的检测方法。