猪源新城疫病毒HN基因的克隆及序列分析

35

猪源新城疫病毒HN基因的克隆及序列分析

郑　腾1　程龙飞2　张俊明3

(1福建出入境检验检疫局　福州　350001;2福建省农业科学院畜牧兽医研究所　福州　350013;

3福建农林大学动物科学学院　福州　350002)

摘　要　本试验采用RT-PCR方法对猪源新城疫病毒(NDV)SP13株的HN基因进行了扩增与克隆,测定出HN基因的核苷酸序列,发现其包含一个1734bp的开放阅读框,编码包含577个氨基酸的HN蛋白,该蛋白有5个潜在的糖基化位点和12个Cys残基。通过比较分析表明SP13的HN基因与LaSota、Clone30和源自印度鹦鹉的NDV毒株有着较高的同源性。关键词　猪源　新城疫病毒　HN基因　克隆　序列分析　系统发育分析

中图分类号:S852165+915　　　　　　　　　文献标识码:A　　　　　　　　　　　　文章编号:1003-4331(2007)07-0035-06

　　新城疫(NewcastleDisease,ND)是由新城疫病毒

(NewcastleDiseaseVirus,NDV)引起的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型症状的高度接触性急性败血性传染病,1926年首先发现于印度尼西亚的爪哇和英国的纽卡斯尔,我国于1935年首次发现该病,但直到1948年才得以最后证实[1]。由于ND给世界养禽业造成巨大的损失,从而成为当今全球范围内最严重的家禽传染病之一,被国际兽疫局(OIE)列为A类传染病。NDV是属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、腮腺炎病毒属的一种有囊膜的负链RNA病毒,只有一种血清型。NDV对不同宿主的致病性差别很大,鸡最为敏感,野鸡(雉)次之,火鸡、珍珠鸡、鹌鹑、鸽等禽类也能感染发病,而鸭和鹅等水禽可能被感染,但很少表现出严重的临床症状[2]。试验感染时,NDV可使仓鼠和小鼠发生传染性脑炎,脑内接种恒河猴和猪可以引起脑膜炎,NDV甚至可在爬行动物和角鲨体内存活一定时间。NDV能感染人类,也能适应诸如牛和猪的肾单层细胞等哺乳动物细胞,并可以使用这些哺乳动物细胞培育弱毒后备株和生产减毒疫苗[3-4]。

NDV的基因组由15586个核苷酸组成,包括6个基因,分别编码核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素-神经氨酸酶和聚合酶共6种蛋白,其中两个囊膜蛋白即融合(F)蛋白和血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白在细胞感染中起十分重要的作用。F蛋白介导病毒与宿主细胞之间的细胞融合,而HN蛋白至少有3种功能,分别是:介导病毒颗粒吸附于靶细胞表面含有叶酸的受体,从而启动感染过程[5];神经氨酸酶活性是病毒复制周期中加强病毒颗粒的移动和促进从感染的细胞中释放的重要因素[6];HN蛋白还具有促进F蛋白细胞融合的作用,而且这种

基金项目:福建省自然科学基金(Z0516088)资助。

作用具有极强的特异性[7-8]。在促细胞融合作用期间,同源性HN蛋白和F蛋白之间有一种特异性的信息交流,HN蛋白的头部负责受体识别和神经氨酸酶活性,而促细胞融合作用则由膜穿入部分和躯干的大部分来完成[9]。

笔者于2003年7月从表现呼吸道症状猪只的上呼吸道中分离到1株病毒SP13株,经电镜负染观察,发现其具典型的副粘病毒特征,随后经血凝及血凝抑制试验证实SP13株为新城疫病毒。通过对鸡胚平均致死时间、鸡胚半数致死量、对鸭胚和鸡鸭的致死性测定以及荧光RT-PCR检测,表明SP13株为温和型毒株[10]。随后,笔者对猪源NDVSP13株的F基因进行了克隆和序列分析,发现其编码F蛋白裂解位点的氨基酸组成为112G-R-Q-G-R-L117,符合弱毒株的特点,从分子水平上证实了该毒株为弱毒株。此外,F基因的序列分析表明,其与常用的疫苗株LaSota和Clone30极为相似,还与阿根廷火烈鸟中分离出的NDV毒株以及从印度鹦鹉中分离出的NDV毒株亲缘关系较近[11]。由于HN蛋白在病毒侵染过程中起识别细胞受体的作用,为了探寻SP13株感染哺乳动物细胞的原因以及与其它禽源NDV的相互关系,笔者对该毒株的HN基因进行了进一步的研究。1　材料与方法

111　病毒　猪源NDVSP13株由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病室分离、鉴定和保存。112　病毒的增殖与收获　将SP13株接种10日龄SPF鸡胚,弃去24h内的死胚,收集24～96h后死亡的尿囊液,冻融1次后,5000r/min离心10min,取上清液-20℃保存备用。113　引物设计与合成　设计两对引物分别对HN基因进行分段扩增,引物序列如下:Y1:5′-GACCTTGCTATG2GCTTGGGAAATA-3′;Y2:5′-ACTGGGTGAATTGGGTTT

36

福建畜牧兽医　　增　刊　　2007年

GA-3′;W1:5′-TGACAGCCGCGTATGGTT-3′;W2:5′-AGCACTGGCTGATTGTGGTC-3′。

114　病毒RNA的提取　取250μL尿囊液8000r/

min离心5min后,取上清液加入750μLTrizol,吹打混匀,加入200μL氯仿,混匀。4℃,12000r/min离心15min,取上清液600μL,加入预冷的异丙醇500μL,混匀。4℃12000r/min离心15min,弃上清液,倒置吸干,加入用DEPC水配置的70%(v/v)乙醇700μL。4℃12000r/min离心15min,弃上清,倒置吸干,加入6μLDEPC水后即进行RT-PCR反应。115　RT-PCR　采用两步法,参考宝生物工程(大连)有限公司生产RNAPCRKit(AMV)Ver1310的说明并进行适当的改进。反转录时采用Random9mers为引物,按试剂盒的要求进行,约10μL的反应体系中含有418μL的病毒RNA、2μL的MgCl2、1μLdNTP、1μL10×RTBuffer、015μLRandom9mers、015μLAMVReverseTranscriptase和015μLRNaseIn2hibitor。反转录后分别加入引物Y1和Y2以及W1和W2各1μL对HN基因进行分段扩增,此外39μL的反应体系中含有10μL5×RTBuffer、28175μL灭菌蒸馏水和0125μLTaKaRaExTaqTMHS,反应条件为94℃预变性3min,94℃变性30s,56℃退火40s,72℃延伸45s,循环36次,最后72℃延伸8min。取6μLPCR产物,以WideRangeDNAMarker(500～15000)为Marker,用10g/L琼脂糖凝胶电泳分析,余者保存于-80℃。

116　HN基因RT-PCR产物的克隆与鉴定　参照宝生物工程(大连)有限公司生产的AgaroseGelDNAPurificationKit的说明将扩增产物分别切胶回收纯化,再按pMD18-TVector的说明进行连接,转化DH5

α感受态细胞,经含AMP的LB平板筛选后,挑取菌落扩大培养,碱裂解法提取质粒,用HindⅢ和XbaⅠ双酶切进行鉴定。

117　序列测定与分析　将经HindⅢ和XbaⅠ双酶切鉴定为阳性的克隆菌株送宝生物工程(大连)有限公司,使用ABIPRISMTM377XLDNASequencer测序仪进行序列测定,采用DNASTAR软件和NetNGlyc110Server进行比较和分析。2　结果

211　SP13株HN基因的RT-PCR扩增　以SP13株病毒的基因组RNA为模板,采用两对引物对HN基因分A、B两个节段分别进行扩增,经琼脂糖电泳分析结果表明,A节段PCR产物的大小约为1200bp(见图1中第2泳道),B节段PCR产物的大小约为

1000bp(见图1中第1泳道),与预期设计的扩增产物片段大小基本相符。

图1　NDVSP13株HN基因的RT-PCR产物电泳图

11B节段PCR扩增产物　21A节段PCR扩增产物　31线性DNA

分子量标准-DL2000

212　重组质粒的酶切鉴定　A和B两个扩增片段经切胶回收并与pMD18-TVector相连后,转化DH5

α感受态细胞,经AMP平板筛选及质粒电泳鉴定,可见两个电泳条带(见图2中的泳道1和泳道2),表明获得了重组质粒pMD-A和重组质粒pMD-B。随后,采用HindⅢ和XbaⅠ进行双酶切,重组质粒pMD-A经双酶切后出现了大小分别约为1200bp和2700bp的两个电泳条带(见图2中的泳道3),重组质粒pMD-B经双酶切后出现了大小约分别为1000bp和2700bp的两个电泳条带(见图2中的泳道4),结果表明HN基因的A片段和B片段已成功克隆进入重组质粒pMD-A和重组质粒pMD-B中。

图2　NDVSP13株HN基因阳性重组质粒鉴定电泳图

11A片段重组质粒pMD-A　21B片段重组质粒pMD-B　31重

组质粒pMD-A双酶切结果　41重组质粒pMD-B双酶切结果　51线性DNA分子质量标准-WideRangeDNAMarker(500-15000)

213　SP13株HN基因的测序结果　pMD-A和pMD-B的测序结果经分析后获得NDVSP13株的HN基因全长,其中包含一个1734bp的开放阅读框

(ORF),能编码577个氨基酸。

214　SP13株HN基因序列同源性比较　选用从

福建畜牧兽医　　增　刊　　2007年

37

GeneBank中查到的Australia-Victoria、F48E9、Herts33、Italien、Miyadera、Mukteswar、U.S.Largo71、B1、BeaudetteC、Clone30、Lasota、TexasG.B、D26、Ulster67

和V4(UPM)等共15株国内外常见NDV毒株,与

1

12345678910111213141516

71261761441961011101213111712151215111881871081912.71293129168197178171214121912171218121812171013913101513.12393179112119712813919131512151316131612171015918111013.934931991179811617717915131412161314131412171011912101213.64595129218931293166171110111911121119111911148147108.612.1569413921092129218931612151311121913131313131210108149.913.767901088189019911289198818161315131613161315191318121714.016.67888198814871988108912881285173130190193141015101311.01.289

NDVSP13的HN基因编码区的1734个核苷酸进行同源性比较分析(见表1)。结果可见,NDVSP13与这些常见毒株的同源性在8514%～9917%之间,其中与LaSota和Clone30的同源性高达9917%。

108818881587188719891288118517991196180103141110101611.50.310118818881587188719891288118517991196181003141110101611.50.31112891388168815881589168812861196179910961796171018101011.43.812139119901690139017921290188717901490129010901090114142.411.3131493139115911091169315921288169016901990139013901895174.710.914159117901389189014911990178715891889168914891489159717951511.815168816881287158718891087188514981896149917991796138917901189.11612345678910111213141516

表1　16个NDV毒株HN基因核苷酸同源性比较

8914

8816881788168917881486169618313313110101791911.23.79　　11Australia

-Victoria;21F48E9;31Herts33;41Italien;51Miyadera;61Mukteswar;71U.S.Largo71;81B1;91BeaudetteC;101Clone30;111Lasota;

121TexasG1B;131D26;141Ulster67;151V4(UPM);161SwineChinaSP13

215　SP13与Clone30、Lasota、NDVCUL97株HN蛋白的氨基酸序列比较分析　采用DNASTAR软件进行

分析,SP13的HN蛋白含有52个强碱性氨基酸、54个强酸性氨基酸、186个疏水氨基酸和193个极性氨基酸。氨基酸序列分析结果显示,SP13株与Clone30、Lasota株的HN蛋白仅有2个氨基酸的差异,SP13株HN蛋白的256位和568位的氨基酸分别为Lys(K)和Glu(E),而Clone30和Lasota在这两个位置上分别为Glu(E)和Asp(D);同时,SP13株的HN蛋白共有12个Cys残基(分别位于172、186、196、238、247、251、344、455、461、465、531和542位),与Clone30和Lasota高度一致。此外,由于印度鹦鹉中分离出的NDV毒株NDVCUL97的F基因与SP13株的亲缘关系较近,经比较两者的HN蛋白氨基酸序列,发现其同源性高达9816%,仅有8个氨基酸有所不同,分别位于2、3、4、9、130、256、464和568位(见图3)。采用NetNGlyc110Server分析后发现,编码的蛋白中有5个潜在的糖基化位点,分别位于第119位、341位、433位、481位和538位残基处,与Clone30、Lasota和NDVCUL97完全一致。

216　系统发育树　应用MegAlign软件,选用从Gen2Bank中查到的包括鹅、鸡、鹦鹉、火鸡、企鹅、番鸭、鸭、鸽等不同畜禽品种在内共41株NDV毒株以及15株国内外常见毒株,与SP13就HN基因编码区的核苷酸序列进行比较后,绘制了系统发育树(见图4)。

图3　SP13与LaSota、clone30和

NDVCUL97HN蛋白氨基酸序列的比较

注:潜在的糖基化位点用线框表示

38

福建畜牧兽医　　增　刊　　2007年

图4　NDVHN基因核苷酸序列绘制的系统发育树

217　SP13的HN蛋白氨基酸序列疏水性和抗原表位预测　图5显示了SP13株HN蛋白氨基酸序列疏水性和抗原表位预测结果,主要的疏水区接近N

端,与Clone30和Lasota的HN蛋白氨基酸序列疏水性和抗原表位预测结果基本相同。

图5　SP13株HN蛋白氨基酸序列疏水性和抗原表位预测

福建畜牧兽医　　增　刊　　2007年

39

3　讨　论

HN蛋白能够介导病毒粒子对细胞受体的吸附并促进病毒与细胞的融合,HN蛋白翻译的起始密码子都在第91～94个核苷酸,但不同毒株蛋白翻译的

终止密码子位置却有所不同,有第1805～1807、第1823～1825和第1940～1942位核苷酸三种类型,因此其长度也相应为1713bp、1731bp和1848bp,分别编码571、577、和616个氨基酸。HN多肽长571个氨基酸的毒株全是经典的强毒株,如Herts33、I2talien等;HN多肽长577个氨基酸的毒株既有弱毒株(如Lasota)也有强毒株(如TexasG1B);HN多肽长616个氨基酸的毒株为无毒株,如D26、Ulster67[12]。SP13株HN的基因开放阅读框的长度为1734bp,编码577个氨基酸,而且编码的HN蛋白与Clone30和Lasota的同源性高达9917%,从而进一步证明了该毒株是一个弱毒株,这个结果与前期所进行的病原分离鉴定以及F基因的克隆和序列分析的研究结果是相符合的。

通过对HN基因核苷酸序列以及推导出的HN蛋白的同源性研究表明,猪源NDVSP13株与疫苗株LaSota和Clone30具有较高的同源性,而且与糖蛋白结构和功能有着重要关系的潜在糖基化位点和Cys残基的位置完全一致。除此之外,猪源NDVSP13株的HN基因还与从印度鹦鹉种分离出的NDV毒株NDVCUL97有较高的同源性,其部分序列与从GenBank中查到的源自阿根廷火烈鸟的NDV毒株88T100的部分序列(约210bp)比较后发现,同源性高达9816%,仅有3个核苷酸的不同,这些研究结果与前期对该毒株的F基因的研究结果完全相符。

虽然目前尚无明确的猪感染新城疫病毒并发病的报道,但由于通过试验感染新城疫病毒能够适应猪肾单层细胞,并可以用其培育弱毒后备株和生产减毒疫苗,因此应存在理论上的可能性。从猪体上分离出新城疫病毒的原因之一,可能是由于我国猪、鸡混养的模式,造成使用在家禽上的疫苗株感染并适应猪细胞造成的结果。此外,有报道我国一些地区临床上采用新城疫Ⅰ系苗预防或治疗新生仔猪流行性腹泻,诱导其产生干扰素,并取得较好的效果[13];还有资料显示,可以采用新城疫Ⅲ系苗诱导猪血白细胞和猪脾细胞产生有效价干扰素的试验报道,因此也不排除有的地区临床上滥用新城疫疫苗防治猪病而造成新城疫疫苗株适应猪细胞的可能性[14]。其中,有一点尤其必须引起我们注意的是,经对猪源NDVSP13株与我国常用的LaSota和Clone

30两株疫苗株在HN蛋白的氨基酸序列的比较和分析发现,三者具有高度的同源性,由于HN蛋白能够介导病毒粒子对细胞受体的吸附并促进病毒与细胞

的融合,再加上LaSota的毒力是弱毒疫苗中毒力最强的,说明这些疫苗株完全有可能感染哺乳动物细胞。那么,以一种能够适应哺乳动物细胞的毒株作为常用的疫苗株加以广泛使用,是否合适值得我们探讨。

对猪源NDVSP13株的病毒分离鉴定以及F基因和HN基因的系列研究表明,新城疫病毒的感染谱正在不断扩大,其感染方向逐步向哺乳动物(猪)跨进,与新城疫病毒同属于副粘病毒科的尼帕病毒和梅那哥病毒都曾给人类带来灾难,因此新城疫病毒感染谱的变化值得我们关注。由于猪源新城疫病毒SP13的HN基因与一些新城疫毒株的高同源性,是否能说明候鸟、鸡、水禽与猪之间新城疫的传播具有一定的必然联系。猪源的新城疫病毒能否变异为强毒株,从而通过猪作为中间宿主使人发生损害性感染,还需进一步研究,但应注意LaSota疫苗株的使用可能是新城疫病毒感染谱扩大的根源之一。由于属于正粘病毒科的禽流感病毒与属于副粘病毒科的新城疫病毒有着许多相似的特性,新城疫病毒感染谱的扩大,或许可以为禽流感病毒感染人事件的发生提供一些值得借鉴的东西。

参考文献:

[1]　CalnekBW,JohnBH,CharlesBW,etal.Diseaseofpoultry

[M].Tenthedition.Ames:LowastateUniversitypress,1997:541-5421

[2]　单松华,邹键,姚龙涛,等.鹅副粘病毒上海株的分子鉴

定[J].上海农业学报,2002,18(4):70-731

[3]　殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版

社,1997:743-7501

[4]　SaifYM.禽病学[M].11版.苏敬良,高福,索勋,主译.

北京:中国农业出版社,2005:66-921

[5]　ChoppinPW,ScheidA.Theroleofviralglycoprpteinsin

adaorption,penetrationandpathogenicityofviruses[J].RevInfectDis,1980(2):40-611

[6]　HubermanK,PelusoRW,MosconaA.Hemagglutinin-neu2

raminidaseofhumanparainfluenza3:roleoftheneuraminidaseinthevirallifecycle[J].Virology,1995,214:294-3001[7]　DengR,WangZ,MirzaAM,etal.Localizationofadomain

ontheparamyxovirusattachmentproteinrequiredforthepro2motionofcellularfusionbyitshonologousfusionproteinspike[J].Virology,1995,209:457-4691

[8]　王志玉.副粘病毒表面糖蛋白的表到及其相互作用的

研究[J].山东医科大学学报,1999,37(2):117-1191

40

福建畜牧兽医　　增　刊　　2007年

AA+种鸡产蛋率、受精率、孵化率的相关分析

张艳艳1　李　昂1　温　俊1　华绍桂2　王光瑛1

(1福建农林大学动物科学学院　福州　350002;2森宝(龙岩)实业有限公司　福建龙岩　364000)

摘　要　对AA+肉用种鸡产蛋周(1～35周)的产蛋率、受精率、孵化率进行跟踪观测并对3个指标进行相关性分析。结果表明:产蛋率与受精率相关系数为01864(P<0101);产蛋率与孵化率相关系数为01900(P<0101);受精率与孵化率相关系数为

01992(P<0101),产蛋率与受精率,产蛋率与孵化率,受精率与孵化率三者都呈较强正相关。其中受精率与孵化率相关性最

强,产蛋率与孵化率相关性次之,产蛋率与受精率相关性较弱。关键词　AA种鸡　产蛋率　受精率　孵化率　相关性分析

中图分类号:S83113　　　　　　　　文献标识码:A　　　　　　　　　　文章编号:1003-4331(2007)07-0040-03

CorrelationAnalysisofLayingRate,FertilizationRate,HatchabilityRateinAA+Chicken

ZhangYanyan1　LiAng1　WenJun1　HuaShaogui2　WangGuangying1

(1CollegeofAnimalScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou　350002;

2Sumpo(Longyan)IndustryCo.Ltd.,Longyan　364000)

Abstract　ThisexperimentobservedtheAA+meatchicken’slayingrate,fertilizationrate,hatchingratefromfirsttothirty-fifthweek,andan2alyzedthecorrelationofthreeparameters.Theresultsshowedthatthecorrelationcoefficientoflayingrateandfertilizationratewas0.864(P<0.01),thecorrelationcoefficientoflayingandhatchingratewas0.900(P<0.01),fertilizationandhatchingrates’correlationcoefficientwas0.992(P<0.01),layingratewithfertilizationrateandhatchingrate,fertilizationrateandhatchingratehadstronglypositivecorrelation.Thecorrelationbetweenfertilizationandhatchingratewassignificant(P<0.01)andweakerwaslayingrateandhatchingrate.Thecorrelationbe2tweenlayingrateandfertilizationratewastheweakest.

Keywords　AA+chicken　layingrate　fertilizationrate　hatchingrate　correlationanalysis

　　AA+肉用种鸡是安伟捷家禽育种有限公司培育的新品种。我国于2003年初引进AA+肉种鸡,和原AA肉用种鸡相比,AA+肉种鸡的优点:父系由普通型提升为宽胸型,母系则由快羽型育成慢羽型[1]。AA+肉用种鸡具有较高的生产性能和良好的抗病力,但对饲养环境条件要求高,种鸡易超重而影响种用性能[2]。

产蛋率、受精率和孵化率是衡量种鸡繁殖性能

日粮类型产蛋料Ⅰ(1～20周)

产蛋料Ⅱ(21～35周)公鸡料(24～59周)

代谢能(MJ/Kg)

218721872187

优劣的重要指标,也直接影响种鸡场的饲养效益。本研究重点对AA+鸡的产蛋率、受精率及孵化率的相关性进行分析,拟为进一步提高AA+肉种鸡的繁殖性能、科学饲养管理提供理论依据。

1　材料与方法

111　试验动物及日粮营养水平　试验在龙岩森宝种鸡场和孵化场进行,AA+肉用种鸡由龙岩市森宝种鸡场提供。种鸡日粮营养水平见表1。

　%

有效磷

014001370135

表1　种鸡日粮营养水平

粗蛋白

161001515012100

钙

311031300180

赖氨酸

017201700155

蛋氨酸+胱氨酸

016201580145

[9]　DengR,MirzaAM,SheebanJP,etal.Structureandfunction

ofamembraneanchor-lessformofthehemagglutinin-neu2raminidaseglycoprpteinofNewcastlediseasevirus[J].JBiolChem,1993,268:21425-214311

[10]　程龙飞,柯美峰,郑腾,等.猪源新城疫病毒的分离鉴

[12]　SakaguchiT,ToyodaT,GotohB,etal.Newcastledisease

virusevolutionⅠ.Multiplelineagesdefinedbysequencevariabilityofthehemagglutinin-neuraminidasegene[J].Virology,1989,169:260-2721

[13]　覃德鑫,邓绍基.鸡新城疫Ⅰ系苗防治新生仔猪流行

定[J].中国兽医科技,2004,34(12):66-681

[11]　郑腾,程龙飞,李志方,等.猪源新城疫病毒SP13株的

F基因克隆及序列分析[J].福建农林大学学报:自然

性腹泻疗效观察[J].广西农业科学,1995(2):86-871

[14]　曾仕康,刘晓颖,黄大明,等.猪血、猪脾白细胞的培养

及干扰素的诱生[J].中国生化药物杂志,1996,17(3):

116-1181

科学版,2007,36(3):259-2631