四株猪伪狂犬病毒株的分离鉴定与主要毒力基因分析

1429 -1436-htty ：//+ww. zjnyxb. a易可可，阴文奇,周远成，等•四株猪伪狂犬病毒株的分离鉴定与主要毒力基因分析％ J].浙江农业学报,2019,31 (9 )：

DOC 10. 3969/j. issn. 1004-1524. 2019. 09. 05四株猪伪狂犬病毒株的分离鉴定与主要毒力基因分析易可可S阴文奇2,周远成3,蒋金蓁S张白玉S李中银'，颜其贵1!**

（1-四川农业大学动物医学院，四川成都611130 ;2-四川省畜牧科学研究院，四川成都610066 ;3-四川华神兽用生物制品有限公司，四 川成都610200 ；4-四川伊禾动物药品有限公司，四川成都610066）摘 要潴伪狂犬病毒（PRV）的流行对中国养猪业造成巨大损失，而2011年后许多已免疫PRV疫苗的猪场

频繁岀现g抗体转为阳性现象，感染猪岀现PRV的临床症状，并岀现所谓的“流产风暴”，学者们怀疑PRV

的重新流行与病毒毒力增强和基因变异有关。为了解PRV变异情况，从各地疑似PRV阳性病料中，通过

PK-15细胞分离岀4个毒株，对毒株传代培养，进行TCIC5占LD50测定，对主要毒力基因g6gCgE*和TK进

行扩增测序后分析,确定该4株病毒为PRV株，分别命名为FJ01株、FJ03株、YK株和MS2018株，滴度分别 为 10_ 6-63 * 10 - 7-08 * 10 - 8-10 * 10 - 7-18 TCID50u - 0. 1mL_1,对 BWb// 小鼠的 LD50 分别为 10217*10272、10344、10351

TCIC50u,可见FJ01株的毒力最强。对4个毒株的毒力基因与其他PRV毒株进行同源性比对并建立进化化，

FJ01株、FJ03株、MS2018株与中国近几年流行的变异毒株如HNX株、HNB株、JS-2012株等在一个大进化分

支上，亲缘性较近，而与疫苗株BwthwK61、SA215等,国际经典毒株Becker*Kaplan等亲缘性较远，变异较大。

YK株与国际毒株亲缘性更近，其原因有待进一步探索。关键词潴伪狂犬病毒）分离鉴定）毒力基因）序列分析中图分类号:S858.28

文献标志码:A 文章编号：1004-1524 （2019 ）09-1429-08Isolation and ideetification of 4 strains of porcine pseedorabies virrs and analysis of main

virrleece genesYI Keke1 , YIN Wenqi2, ZHOU Yuancheng3, JIANG Jinzhen1 , ZHANG BWyu1 , L【Zhongyin4 , YAN Qigui1，*（1. College cf Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China ； 2. Sichuan Academy

of' Animal Sciences, Chengdu 610066, China ； 3. Sichuan Huashee Veterinary Biological ProOucts Co. , Lt#. , Cheng­

du 610200, China ； 4. Sichuan Yihe Animal Pharmaceutical Co. , Ltd. , Chengdu 610066, China）Abstract: Pseudorabies virus（ PRV）'s preralence brings huge economic losses to the domestic pig industrg, howee-

er, many large-scale itmunized pig herds broke out pseudorabies, and gE antybodies turned from negative to positive since 2011, causing PRV clinical symptoms infected pigs, and then resulting in “abortion storm\". Most scholars be­

lieved that national outbreak of PRV might be related to factors such as viral virulence and genetic variation. In this study, four pseudorabies viruses were successfully isolated from suspected PRV infected pigs by PK-15 cells, moreo­

ver, their TCID50 and LD50 were determined. Their main immunoaenic genes and virulence-related genes gB, gC, gE

and TK were amplified, sequenced and analyzed. The 4 pseudorabies viruses were affirmed, named as FJ01, FJ03 ,

收稿日期：2019-02-7作者简介:易可可（1994—），女,湖南岳阳人,硕士,研究方向为兽医微生物与免疫学。E-mWl： kkky1024@163.com* 通信作者,颜其贵,E-mail： yanqigui@126.com-1430 -浙江农业学报第31卷第9期YK and MS2018 strain, respectively, whoso titers were 10 _6'63, 10 _7'08, 10 _8'10, 10 _7'18 TCID5q-・0. 1mL _1 , re­

spectively ,and the results of virulence test in Balb/c mice showed as 102'17 , 10292 , 103'44 , 103'51 TCID50s , respec-

tiveg. The virulence of FJ01 strain was the strongest. Their nucmotide and amino acid homolories were analyzed and

IeoeueionaeyeeIIswIe IseabeishId.ThIesueesshowId ehaeehIgInIsofFJ01 , FJ03 and MS2018 seeainshad highIe

homoeogywieh ehImueanessuch asHNX, HNBand JS-2012 seeainswhich wIe isoeaed in ecIneyIaes.In Ieoeueion- aeyeIeaeionship, ehIybIeongId eoaeaegIbeanch, howIeIe, ehIybIeongId eodifeneIeoeueionaeybeanchIsfeom

vaccine Bartha-K61, SA215 , and foreign strains Becket and Kaplan with evident vvriations. YK had the closes affini­

ty with foreign strains in evolutionaiy relationship, but the reason remained to be furthev explored.Key words: pseudorabies virus ； isolation and identification ； virulence gene ； sequence analysis猪伪狂犬病（posing pseudorabms, PR）是由

猪伪狂犬病病毒（ porcino pseudorabias viais, PRV）引起的一种由疱疹病毒感染的高度接触性 传染病\"，能引起猪发热、奇痒、繁殖障碍、脑

脊髓炎等症状。PRV能感染反刍动物、啮齿动 物、食肉动物等哺乳动物和鸟类，有高致病

率［3'5］，但猪是PRV唯一的传播和贮存宿主［6］,

能隐性感染,长期带毒，曾经给欧洲和美洲带来 巨大经济影响［7\"10］（ PRV主要侵害猪神经系统 及生殖系统，各个阶段猪只均可感染，可引起妊

娠母猪繁殖障碍病毒终身潜伏、流产、产死胎和 呼吸道症状;新生仔猪出现神经症状、腹泻、呕 吐、生长不良等表现，死亡率极高［11］, 一旦感染

该病，难以清除［12］，其传播速度快、范围广、途径

多，国际动物卫生组织（OIE）已将其列为二类传 染病⑷。20世纪%E基因缺失的Bagha-K61疫

苗传入中国，从90年代开始广泛应用于我国的 各大猪场，使PRV得到了有效的控制［13］o 2011 年年来，许多接种了 Bartha-K61疫苗的猪场大规

模暴发PRV,对我国养猪业和农业经济造成了巨

大损失，通过近年来的分离毒株分析,PRV变异 是暴发伪狂犬病的最主要原因［14-15］（由此可

见,Bartha-K61疫苗不能对变异PRV毒株起到全 面和有效保护作用叫本实验从2016—2017年疑似感染伪狂犬病

的猪病料中分离出4株PRV毒株,通过生物学特 性研究分析,并收集2011年至今的主要变异毒 株和国内外经典毒株进行毒力基因gB、gC、gE和 TK序列比对,进行同同性测定并构建进化树，分

析变异株的基因间差异。1材料与方法1.1材料1.1.1病料与实验动物从福建和四川某猪场疑似PRV感染仔猪中 分别采集脑、扁桃体、肺脏、脾脏等组织，-20 b

保存备用。6周龄Balb/c小白鼠购于成都达硕 实验动物有限公司。1.1.2主要试剂DMEM细胞培养液、胰酶购自HycUne公司,

胎牛血清购自AusGeneX公司；LA Taq聚合酶、

T4 DNA 连接酶、pMD18-T 载体、GC BuffegdNTP、

大肠埃希菌DH5!感受态细胞购自宝生物工程 （大连）有限公司;血液/组织/细胞基因组提取试

剂盒购自TIANGEN生化科技有限公司；胶回收

试剂盒和质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；猪 肾细胞（PK-15细胞）由四川农业大学微生物与 免疫实验室保存。1-2方法1.2.1 病猪的病理解剖与病料处理对采集的病猪病变组织进行研磨,加入适量

PBS制成匀浆，反复冻融3次,10 000 g离心5

m2,将上清液分装置于-20 b保存备用。1.2.2引物设计与合成根据 GenBank 中发表的 PRV gB、gC、gE、TK

（登录号为KM189912. 1）全基因序列，使用Prim­ov Premiav 5. 0软件设计gE检测引物和4对引物

扩增该4个基因的全长，引物序列见表1,引物由

成都擎科有限公司合成。1.2.3 病毒DNA的提取对采集的组织病料提取DNA,使用TIAN­

GEN 的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒，具体

操作参照试剂盒说明书。1.2.4病料PCR鉴定以提取的病料DNA作为模板，反应体系为易可可，等•四株猪伪狂犬病毒株的分离鉴定与主要毒力基因分析・1431・表1引物序列信息Table 1 Prites sequence information引物名称Primes name引物序列Sequence\" 5'-3 SACCTGAGCGTCCTGCGG长度Length cbp5532877退火温度Annealing tempemtum/bGCBu eee引物用途UsayePgE-F61.451.055.056.062.0Bu eeeIBu eee$Bu eeeIBu eee$Bu eeeI鉴定 PRV Identification of PRVgB 基因 gB genePgE-RgB-FCCGTTGTGGGTCATCACGAGTCTTCAGGTCCGTCTTCCACAACGGCATCTTTATTTTTTTCCATCTgB-RgC-FTGTGTGCCACTAGCATTAAATCCGGAGAGGAGAGTGGAGTGGGAC17022057gC 基因 gC genegC-RgE-FgE-RTK-FTK-RGCCACCATCGCAGAAGAACAATCTCGCTGTAGTAGCAGTCCGATGCGCATCCTCCGGATCTACCTCGgE 基因 gE geneTK 基因 TK gene963TCACACCCCCATCTCCGACGTGAAG25 （jlL, LA Taq 酶 0. 25 L,2 t GC Buffer I / 12.5 L,上下游引物各1 L,模板2 L,dNTP1

#L,灭菌去离子水补足25

#####$

1.2.7 小鼠LD50测定每株准备50只6周龄雌性SPF级Bai/c小

鼠，随机分成5组，每组10只。将病毒10倍梯度

鉴定PRV gE基因反应条件为94 b 5 min;94 b 1 min,61. 4 b 1 min,72 b 40 s,35 个循环;72 b 延伸 10 min,温

稀释成104 - 100比①亦，每个稀释度一组,接种

0.1 mL于小鼠大腿肌肉；同时设立一组空白对

度降至 4 °C ,加入 2. 5 L 10 t Loadiny Buffer 终 止反应;取10.0 L PCR产物加入1.0%琼脂糖 胶孔中电泳，于凝胶成像系统下观察结果并

#照,相同剂量和部位注射DMEM培养液，在相同

条件下隔离饲养。每6h观察并记录小鼠精神状

况、临床症状和死亡时间，结果根据Reed-Muench

拍照。1.2.5病毒分离培养法计算病毒对Balb/c小鼠的半数致死量\"LD50 ）（

1.2. 8 gB、gC、gE和TK全基因测序将PCR鉴定为阳性的PRV病料处理成悬

液,4 b 4 000 r- min\"1离心10 min,取上清液用

0.22 m过滤器过滤后，加适量双抗孵育过夜,

#50 L,LA Taq 酶 0. 5 L,2 t GC Buffer #I / $ 25

#L,上下游引物各2 #L,模板2 #L, dNTP 4 #L #（根据目的条带长度添加，每1 000 bp添加1

#L），灭菌去离子水补足50 #L。94 b 5 min；94

病毒液抽提DNA后作为模板，反应体系为

保存至-20 b。待PK-15细胞长成单层铺至 80%时，取1 mL滤液接种细胞，轻轻混匀,37 b 5% CO?培养箱中放置1 h,倒去滤液加入2% DMEM维持液，同时设立对照细胞组，每天观察

b 1 min,51 b （根据不同引物选择退火温度）1

min,72 b 1 min （根据目的条带大小选择，每

细胞状况，并记录病变情况，待病变达到70%时

1 000 bp延长1 min） ,35个循环;72 b延伸10 mid,温度降至4 b,PCR产物加入1.0%琼脂糖

收毒，盲传5代后进行PCR鉴定。1.2.6 病毒TCID50测定胶孔中电泳，回收目的片段，连接pMD18-T载体

转入大肠埃希菌DH5感受态细胞，在LB氨苄

将收集的病毒液反复冻融3次,12 000 - min\"1离心1 min,取上清液。PK-15细胞在96孔

!固体培养基上筛选出阳性菌后，提取质粒，送往 成都擎科生物有限公司测序。1.2.9毒力基因全基因序列分析中培养至单层，将分离的病毒液用DMEM培养液 按10倍梯度稀释，从10-1 ~10-10，按照每个稀释

度分别加1列8孔，每孔加入100 L,最后两列

只加入DMEM培养液作阴性对照,置于细胞培养

#参考多株国内外经典和变异PRV毒株，利用 Mega7. 0和MeyAliyn软件将测序结果的gB、gC、

gE和:TK基因序列进行对比和建立进化树。箱放1 h后吸去每孔中的液体，用PBS洗两次后

加入100 L 2% DMEM培养液，继续培养,72 h 后开始观察并每天记录病变孔数情况，按Reed-

Muench 法计算病毒TCID50（#2结果与分析-1432 -浙江农业学报第31卷第9期bpM 1

2.1 PRV的分离鉴定2 3 4 5 62-1. 1 病理剖检结果患病仔猪剖检后发现所有仔猪均出现脑出

血，扁桃体坏死,肺脏和肾脏有出血点，肝脏和肺

2 0001 000750500250脏表面有白色坏死灶等症状。2.1.2病料检测结果100病料组织进行gE基因PCR扩增后，在检测

的脑部、扁桃体、肾脏、肺脏等均扩增出553 bp较 目勺条带。2.1.3病毒的分离处理的组织悬液接种到长满单层的PK-15

细胞上，第1代均出现病变，盲传几代后时间和

CPE稳定,接毒后24 h后细胞变圆变亮，聚集，拉

网并形成合胞体（图1-A），而对照组没有病变

（图 1-T）o2.1.4 病毒液的PCR鉴定对病毒液提取的核酸进行PRV gE PCR鉴

定,结果能扩增出目的条带（图2 ）（2.1.5病毒滴度测定病毒在PK-15细胞上传第1代和第5代的

都收毒进行滴度测定，按照Reed-Muench法计算

PRV的滴度，单位为每0.1 mL病毒液中含多少

TCID50s的病毒粒子，结果如表2 o2-1. 6 小鼠LD50测定PRV FJ01 株、FJ03 株、YK 株和 MS2018 株分

别攻毒Balb/c小鼠后，临床症状为局部严重瘙 痒、呼吸急促、被毛蓬乱、频繁舔咬注射部位并裸

露出皮肤，死亡时间平均为54〜96 h，高剂量小

鼠全部死亡，对照组小鼠精神状态正常° PRV各A，PRV感染细胞；B，正常细胞对照°A，Vies infected cell ； B，Normal cell control -图1 病料悬液上清液感染PK-15细胞病变图# 100 x)Fig. 1

Cytopathic effect oS PK-15 cells infected by epi­

demic tissue suspension supernatant (100 x )M，DL 2000 DNA markos； 1，病毒 FJ01 ； 2，病毒 FJ03 ； 3，病毒

YK；4，病毒MS2018 ；5 ；阳性对照；6，阴性对照。M，DL 2000 DNA markos； 1，Virus FJ01 ； 2，Virus FJ03 ； 3，Vi­

rus YK； 4，Virus MS2018 ； 5，PRV positiva control； 6，PRV

neyativa control -图2 病毒液PRV gE基因PCR检测结果Fig. 2 PCR results oS PRV gE gene oS virus suspension表2不同代次PRV毒株滴度测定Table 2Titers identification oS dbferent passage PRVstrains毒株滴度 Titers/\"TCIP50s -0. 1 mL-1 )StrainF1F5FJ0110-6-310-6-63FJ0310 一6610-7-08YK10-7-710-8-10MS201810_6.710-7-18毒株对Btb/c小鼠的半数致死量LD50分别为 102. 17、102. 72、103. 44、103. 51 TCID50s（表 3 ）°2.2 PRV分离株的gB、gC）gE和7K基因的序

列分析2.2.1 gB 基因PRV FJ01 株、PRV FJ03 株、PRV YK 株和 PRV MS2018株的gB基因核苷序列与2011龄

以来国内流行的PRV变异株HNB、ZJ01、JS-

2012、TJ株等的同源性为98. 5%〜100%，与疫苗

株Ea、Fa和Bartha株同源性为98. 2%〜99. 8%，

与国内外PRV经典毒株KapUn、Kolchis、NIA3、

Becker等同源性为97.7%〜99. 6% ； 4个分离 PRV毒株的gB基因编码的氨基酸与近年流行的

变异株同源性为97.0%〜100%，与疫苗株同源

性为96.3%〜99. 7%，与经典毒株同源性为

95. 3% 〜99. 1% ° PRV FJ01、FJ03 和 MS2018 株

在进化树上与近几年国内分离的PRV变异株 HN1201、HNX、HNB等在同一大分支;YK株与国

外经典毒株亲缘性更近（图3-T）°易可可，等•四株猪伪狂犬病毒株的分离鉴定与主要毒力基因分析表3 PRV毒株对Bablb/c小鼠LD50测定Table 3 LD50 measurement oO PRV strains on Balb/c mice-1433 -毒株StrainFJ01

分组Geoup感染剂量Dose/TCID50s104103小鼠数量Mice number10101010死亡数Mofalitp1010存活数Survival number半数致死量LD50/TCID50S102.17A4A3006101 0A21021011 004A1A0FJ0300

1 010101010B4B310410397131 0\"72B2B11021011 00100

9101 0\" B0 \"\"\"MS20181 010101010C4C372

381 03. 51C2C1\" C0 \"\"\"10089101 01 0

1 0410101010YKD4D3281039441032

D2102100

9101 0D1101\" D0\"\"\"1 001 010对照组ControlEPK15010―“―”表示无数据。\"一” represented no data.(A)(B)60j— AFJ01 -gB1-------▲MS2018_gBKP257591.1 JS-2012KP722022.1 HN1201KU360259.1 DL14/08KU057086.1 HB120184KT824771.1 HLJ8—KM061380.1 ZJ01▲ FJ03-gBKM189912.1 HNX100KM189914.3 HNBKP098534.1 HeN1KJ789182.1 TJKC981239.1 BJ/YT■ KM189913.1 FaKT809429.1 SCI— KU315430.1 Ea100|— KU900059.1 NIA3——JF797219.1 Becker

qqi JQ809329.1 DUL34gfp qr-^-JQ809330.1 DUL34Pass 帘 1 JF797218.1 Kaplan 66AYK-gB------------------------------------KU198433.1 ADV32751/ltaly201491--------JF797217.1 BarthaKT983811.1 Kolchis' KT983810.1 Hercules-------KT809429.1 SC100| KU900059.1 NIA342l LjF797219.i Becker-- --------------------------KU198433.1 ADV32751/ltaly201499—JF797217 Bartha99i KT983810.1 Hereules27-1 KT983811.1 KolchisKJ717942.1 KaplanJQ809330.1 DUL34PassJQ809329.1 DUL34gfp67i AFJ01-gC1 AMS2018-gCKM189912.1 HNX▲ FJ03-gCKT824771.1 HLJ8-60KU360259.1 DL14/08KU057086.1 HB1201KP722022.1 HN120179KM189914.3 HNBKP098534.1 HeN1KJ789182.1 TJ92KC981239.1 BJ/YT-KM061380.1 ZJ01100KU315430.1 EaKM189913.1 Fa-----KP257591.1 JS-201243----------EU719635.1 SA2150.00200.0050图3 PRV分离株gB、gC基因的核昔酸遗传进化树Fig. 3 Phyloaenetic tree oO PRV gB and gC gene between PRV strains and other reference strains2.2.2 gC 基因PRV FJ01 株、FJ03 株和 MS2018 株 gC 基因

91. 8% 〜99. 9%，与 Ea、Fa、Bartha 和 SA215 疫苗

株同源性为91.9% -99.9%,与国内外经典毒株

的核苷序列与近年流行变异PRV株同源性为 同源性为89.3%〜98. 7%,同源性较低;gC基因

・1434・浙江农业学报第31卷第9期编码的氨基酸与变异毒株，除YK株外同源性为 97.0% - 100% , YK 株为 89.5% 〜89. 7% ,同源

2.2.4 7K 基因4个分离PRV毒株的7K基因核苷序列与

性较低；与PRV疫苗株同源性为88.4%〜

99. 4% ,与国内外经典毒株同源性为86.0%〜 96.9%。在进化分支上,PRV FJ01株、FJ03株、 MS2018株与国内毒株亲缘性更近，与近年的变

国内近几年流行分离HNX、JS-1201、HB1201、BJ/ YT等变异毒株同源性为98. 4%〜100% ,与Bam

tha、Fa、Ea等疫苗株同源性为98.6%〜100% ,与

国外经典毒株Kaplan、Becker等同源性在97. 9% -99.7%,各毒株间遗传变异不大，同源性都很

异株在同一大进化分支上,而YK株与国外经典

毒株在同一进化分支上，与国内毒株亲缘性远 （图 3-）。2.2.3 gE 基因PRV FJ01株、F0J3株和MS2018株 准 基因

高，说明TK基因较为保守。TK编码的氨基酸序

列与近年变异株同源性为99.7%〜100%,与疫 苗株同源性为99.0% -99.9%,与国外经典毒株

同源性为98.3%〜99. 9%,同源性较高。FJ01

的核苷序列与近年流行变异PRV株同源性为 95. 9%〜99. 5%，与Ea、Fa、Bartha疫苗株的同源

株、FJ03株与MS2018株的7K基因序列在进化

树上与国内分离的各PRV毒株在同一进化分支

性为 96. 4% ~ 99. 5%，与 Kaplan、Bec]er、Kolchis、 Hemules等国外经典毒株同源性为96.1%〜 98. 8% ；gE基因编码的氨基酸与近年变异PRV 株同源性为90.6%〜100%；与疫苗毒株同源性 为95.8%〜99. 4%,与国外经典毒株同源性为 95.6% 〜100%。FJ01 株、FJ03 株、MS2018 株在

进化树上与国内2011年后分离出的PRV毒株如

HNX 株、HLJ8 株、HB1201 株、HN1201 株等在同

上，与国内毒株亲缘性较近;YK株的7K基因与

国内和国外均亲缘性较远，在单独一个分支上

（图 4-）。3讨论自2011年以来，中国许多地区免疫过Bam tha-K61疫苗的猪场大规模暴发PRV% 17& ,且在国

一大进化分支上，与疫苗毒株和国内外经典毒株 内广泛流行，有研究已经确定了是由PRV变异毒

亲缘性较远;YK株与国外经典毒株在同一进化 分支上，亲缘性较近（图4-A）。(A)株引起%18& ,意味着Bartha-K61疫苗已不能全面 提供保护%19& ,疑似暴发PRV猪场的猪表现为高

(B)KP098534.1 HeN1—KM061380.1 ZJ01KM189914.3 HNB61KP722022.1 HN1201-KU057086.1 HB1201KM189912.1 HNX 50KP2575591.1 JS-2012—AFJ01-gE63▲ MS2018-gEKT824771.1 HLJ862-------▲FJ03一 gE87KU360259.1 DL14/08KC981239.1 BJ/YT99一 KJ789182.1 strain TJ68i— KU315430.1 strain Ea KM189913.1 strain Fa 'KT809429.1 isolate SC-----------KU198433.1 ADV32751/ltaly2014

911— JF797219.1 Becker'-----------KU900059.1 NIA380991 KT983811.1 Kolchis

KT983810.1 Hercules99AYK-gE93KJ717942.1 KaplanJQ809330.1 DUL34PassJQ809329.1 DUL34gfp1164AYK-TKI JQ809330.1 DUL34Pass------JQ809329.1 DUL34gfpI JF797218.1 KaplanI KT809429.1 SC----冷 JF797219.1 Seeker1 JF797217.1 Bartha-----------KU900059.1 NIA395| KT983811.1 Kolchis1 KT983810.1 Hercules---------------------------------KU198433.1 ADY32751/ltaly2014----------AFJ01-TKKM189912.1 HNXKT824771.1 HLJ8----------KU360259.1 DL14/08KU057086.1 HB1201KP257591.1 JS-2012----------KU315430.1 Ea87KM189913.1 FaKP098534.1 HeN1----------KM061380.1 ZJ01AMS2018-TKKP722022.1 HN1201AFJ03-TKKM189914.3 HNBKJ789182.1 TJKC981239.1 BJ/YT0.00200.0010图4 PRV分离株gE、TK基因的核昔酸遗传进化树Fig・ 4 Phyloaene/c Wee of PRV gE and TK gene between PRV strains and other reference strains易可可，等.四株猪伪狂犬病毒株的分离鉴定与主要毒力基因分析-1435 -烧、严重呼吸道疾病、厌食、震颤等精神症状［18］(

gB核苷序列与国内外PRV参考株的同同性为 97.7% ~100%；gC核苷序列与国内外PRV的

本研究对各地猪场有疑似PRV的病料进行抗原

检测和病毒分离，得到4株PRV病毒，初步鉴定 为野毒感染,并深入研究是否为变异毒株以及生

同同性为89.3% -99.9% ；gE与国内外PRV的

核苷同同性为96.1% -99.8%； TK基因与国

物学特性探究。内外PRV的核昔酸同源性为97.9%〜100%。

分析各个毒株分别与2011年至今流行的PRV的

本实验采用猪肾PK-15细胞分离病毒,4个

病毒分别命名为PRV FJ01株、PRV FJ03株、PRV YK株和PRV MS2018株。将病毒盲传至5代，

毒力基因同同性，发现同同性较高，说明2011后

的流行毒株间变异较小。通过分离出来的4个毒株与国内市面上主

同时与第一代病毒做TCID50,发现滴度随着代数 增多而增加。用第5代毒攻毒Balb/c小鼠计算

半数致死量，毒力最强的毒株为PRV FJ01株， LD50为 102-17 TCID50s-0. 1-L-1，而我国在 2011 年

前就分离得到的Fa、Ea和S经典毒株LD50分别

是 100'7、1020 和 10383 TCID50s,2011 年后分离出 的 HNX、HNB、TJ、HeN1 和 JS-2012 株的 LD50 分

别为 1020、102.、102.、102.7和 102'37 TCID50s，可以

看出Fa毒力是最高的，由此可以得知，中国变异

株的毒力没有增强,猪群暴发伪狂犬病且高死亡

率与毒力增强无关，但从小鼠实验结果可以发

现，变异株能让小鼠产生更为严重的瘙痒症状。gB是PRV必需糖蛋白,也是主要的免疫相

关蛋白，是最保守的蛋白之，是病毒感染所必

需的，与病毒入侵细胞和在细胞间传播密切相 关%20& ,产生中和病毒的抗体%21&。gC参与病毒研 侵细胞过程，是PRV最主要的保护性抗原之一，

能诱导细胞免疫,产生中和抗体［19］,gB和gC的 变异性，是伪狂犬病毒的特征;gE不是病毒复制 必需的蛋白，但它是主要的毒力因子之一，呈现 出嗜神经性，在病毒释放与传播中使PRV接触临

近的神经元，从而进入中枢神经系统，促进病毒 在内转运和扩散［22］，有研究表明,gE缺失株与其

他蛋白缺失株相比亲神经性更弱，因此gE可能

在侵蚀和传播神经系统中有更重要的作用［23］( %也是主要毒力基因，与建立和激活神经潜伏

状态，在中枢神经中增殖有关［24］,当缺失％时， 病毒增殖不受到影响，但毒力和侵染力大幅度降 低%25&,因此在基因缺失苗研发中常使用缺失TK 的PRV毒株。通过gB、gC、gE和TK全基因的遗

传进化分析建立进化树,PRV FJ01株、PRV FJ03 株和PRV MS2018株与2011年后分离的变异株

亲缘性相近，而YK株与国外毒株在同一一化分

支上，与国内毒株亲缘性较远。4株分离PRV的

要流通的疫苗毒株如Bartha-K61株和SA215株 进行基因序列比对有一些变异,虽然目前流行病 学数据显示我国猪场加强疫苗免疫可以大部分

防控PRV,但不能完全清除，这与我国还有许多

散户，养殖环境等有关，这可能也是PRV仍在流 行变异的原因之个为了防控新变异PRV,

以近年流行的PRV为亲本研发新型疫苗可能对 猪起免疫保护作用更加有效;且随着全基因组测

序的普及，关于PRV遗传变异的研究越来越多, 数据库越来越大，发现PRV虽然GC含量高，结

构稳定，但仍出现变异,YK毒株分离于近年感染

伪狂犬病的病料，其免疫原性基因gB、gC和gE

与国外毒株相近，TK在进化树上位于独立分支 上,TK毒株是否出现基因重组，需要从全基因组

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