甘油含量测定

嗯。你都问到这个问题了，具体仪器、操作什么的我就不说了。就说⼀下思路。

强碱条件下⽢油和⼆价铜的络合物显绛蓝⾊，所以利⽤⽢油的这个特性就可以轻松搞定。主要试剂是AR级的⽢油、氢氧化钠、硫酸铜。

向氢氧化钠碱化的⽢油溶液⾥加硫酸铜，⼀定要保证⽢油被完全络合，并且保证多余的⼆价铜都以氢氧化铜沉淀形式存在，但是氢氧化钠也不要加太多。

⽢油铜可见区最⼤吸收波长是在630nm。

先作个标准系列，绘出吸光度-浓度曲线，然后把待测试样吸光度测出来在标准曲线上⼀算，浓度就得到了。氢氧化铜解离出来的铜离⼦在630nm处也有吸收，好在它是⼀个定值，测出来后从每个⽢油的A⾥⾯扣掉就⾏了。

⽢油含量化学⽅法有很多，⽐⾊法，滴定法．⽢油在强碱性条件下，与Cu2+定量形成绛蓝⾊的⽢油铜溶液。根据朗伯-⽐尔定律，溶液吸光度A与吸光物质浓度C成正⽐：A=kC。⽢油配制浓度C1与衍⽣的分析⽢油铜浓度C有如下关系：C=k1C1，k1为稀释系数，则吸光度值与⽢油配制浓度有如下正⽐关系：A=kk1C1+ε，k、k1为常数，ε为系统误差。

先根据吸光度与⽢油配制浓度C1做出关系曲线:，然后确定最佳线性拟合范围，最终得出拟合线性⽅程，程序化后，⽤于⽢油含量的快速测定。[供应] 拜发⽢油检测试剂盒发布⽇期：2010-9-21截⽌⽇期：2009-5-9拜发⽢油检测试剂盒（酶学试剂盒）订货号： 10148270035产品名称：⽢油（Glycerol ）产品英⽂名称： Glycerol包装： Ca.3 x 11 tests产品介绍：如下

产品说明： Glycerol （⽤于检测⾷品中的⽢油）酶法分析试剂盒（紫外分光光度法）

RIDASCREEN（产品编号：0 414 433） 30次检测1. 简介

酶法分析试剂盒（紫外分光光度法）此法适⽤于检测⾷品（啤酒、葡萄汁、醋、蜂蜜、酒精、果酒）、化妆品、药品（溶液、栓剂）、纸板、烟草及⽣物制品中的⽢油。2. 原理

⽢油在⽢油激酶的催化下可被ATP磷酸化为3-磷酸⽢油酯，ATP转化为ADP；反应式为GK

Glycerol﹢ATP L-glycerol-3-phosphate﹢ADP

上式中形成的ADP在丙酮酸激酶的催化下可与PEP作⽤下⽣成ATP及丙酮酸酯；反应式为PK

ADP﹢PEP ATP﹢Pyruvate

丙酮酸酯在L-乳酸酯脱氢酶的作⽤下可被NADH还原为L-乳酸酯，NADH被氧化为NAD；反应式为L-LDH

Pyruvate﹢NADH﹢H﹢ L-lactate﹢NAD﹢

被氧化的NADH的量取决于⽢油的量，NADH的吸光度值可在334，340及365nm下测量。3. 试剂盒内容物

－－－－瓶1共有3瓶，每瓶约有2g辅酶及缓冲液的混和物，包括：⽢氨酰⽢氨酸缓冲液， PH约7.4； N ADH约7mg；ATP约22mg；PEP-CHA约11mg；硫酸镁－－－－瓶2约0.4ml悬浮物，包括：

丙酮酸激酶，约240U； L-乳酸酯脱氢酶，约220U－－－－瓶3约0.4ml⽢油激酶悬浮物，约34U

－－－－瓶4为⽢油检测对照溶液（⽢油检测对照溶液可不需要计算结果），此溶液使⽤时不需稀释。（效期见标签）4. 检测溶液的制备（10次）

－－－－取出1瓶瓶1，⽤11ml重蒸⽔溶解，使⽤时此溶液需在20-25℃持续回温约10分钟－－－－瓶 2不需稀释－－－－瓶 3不需稀释5. 操作者应该注意之事项

使⽤前请仔细阅读，中⽂翻译件仅供参考

－－－－瓶1约含500mg碳酸钠，应避免接触⽪肤和呼吸器官，其他⽤于⽢油检测的试剂不具有危险性－－－－实验之后，⽤过的试剂可作为实验室废料处理，但必须在当地法规允许的前提下6. 储存条件

－－－－瓶 1在2-8℃下保存（见标签），溶液1在2-8℃下可保存4天，溶液1使⽤前需回温⾄20-2 5℃－－－－瓶2及3在2-8℃下保存（见标签）7. 样品处理

－－－－直接取⽤⽆⾊，透明，中性的溶液或按稀释表格稀释后进⾏检测，体积为2.000ml－－－－过滤混浊溶液

－－－－除去样品溶液中的⼆氧化碳⽓体

－－－－加⼊氢氧化钠或氢氧化钾来调节酸溶液的PH值约为8

－－－－对于深颜⾊的样品溶液可不需稀释或者⽤PVPP或酰胺配成较⾼浓度的溶液如：1g/100ml

－－－－粉碎或均质固体和半固体样品，⽤⽔抽提或溶解，⽽后过滤，通过Carrez澄清液可脱去其中的混浊物或⾊素－－－－⽤Carrez试剂可脱去样品中的蛋⽩质

－－－－⽤热⽔抽提样品中的脂肪（抽提温度需在脂肪的溶解度之上），冷却后可分离出脂肪，将余下物质转移⾄容量瓶中并加⽔⾄刻度，冰浴15分钟⽽后过滤，热⽔抽提后⽤Carrez溶液澄清8. 过程

1. 波长：340nm，Hg365nm或Hg334nm2. ⽐⾊杯：光径1.0cm3. 温度：20-25℃

4. 最终体积：3.020ml

5. 对照空⽓（光路上⽆⽐⾊杯）或对照⽔读取读数

6. 样品溶液：1-40ug⽢油/检测（体积为0.100-2.000ml样品体积）7. 具体操作见如下表格移液空⽩（ml）样品（ml）溶液1样品溶液重蒸⽔悬浮物2 1.000-2.0000.010 1.0000.1001.9000.010

混和，直⾄前反应完全反应后，约5-7分钟，读取吸光度值A1，⽽后加⼊下列物质：悬浮物3 0.010 0.010

混和，等反应进⾏完全后（约5-10分钟），⽴即读取样品和空⽩的吸光度值A2

如果在15分钟后反应尚未停⽌，则在2分钟的间隔内继续读取读数，直⾄此值不再变化。分别测样品与空⽩的吸光度值差，⽽后⽤样品吸光度值差减去空⽩吸光度值差可以得到如下公式△A=（A1 ―A2）Sample―（A1 ―A2）blank

若想得到⼀个⾜够精确的结果，则测得的吸光度的单位⾄少为0.100单位。

如果吸光度值差△A在334及340nm下测得的值⾼于1.000或在365nm下测得的值⾼于0.500，如此则表明样品溶液中⽢油的浓度较⾼。需根据稀释表格进⾏样品的稀释9. 计算

根据以下公式计算浓度V×MW

C=－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－-×△A（g/l）ε×d×v×1000V=最终体积（ml）V=样品体积（ml）

MW=被检测物质的摩尔质量D=光径（cm）ε=NADH的消光系数

340nm=6.3（1×mmol-1×cm-1）Hg365nm=3.4（1×mmol-1×cm-1）Hg334nm=6.18（1×mmol-1×cm-1）⽢油含量计算遵循如下公式3.020×92.1

C=－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－×△Aε×1.00×0.100×10002.781

=－－－－－－－－－－－－－－－－×△A（g⽢油/l样品溶液）ε

如果样品溶液是稀释使⽤的，在计算结果时需乘以稀释系数F。

当分析固体或半固体时，测量前需称⼀定重量配制样品溶液，其结果需按下式计算C ⽢油（g/l样品溶液）

C⽢油 =－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－×100（g/100g）W ⽢油（在样品溶液中）10. 检测操作说明

被检样品中⽢油含量在1ug⾄40ug之间。

为了得到⼀个⾜够的吸光度值差，样品溶液的浓度最好稀释在0.04g/L⾄0.4g/L之间。稀释表格每升样品溶液中⽢油估计量⽤⽔稀释稀释倍数﹤0.4g0.4-4g4.0-40g﹥40g -1﹢91﹢991﹢999 1101001000

如果测得的吸光度值△A较低，例如低于0.100，则样品溶液需重新配制，可由下列⼏种解决⽅法1. 可多称出些样品或不要过分稀释。

2. 加⼊到⽐⾊杯中的溶液体积可增加⾄2.000ml，当然为了得到相同的最终体积（样品和空⽩），加⼊的⽔的体积就要相应减少。所加⼊的新溶液的体积在计算时是要考虑进去的。11. 技术信息

加⼊悬浮物2（PK/L-LDH）后等待前反应进⾏完全后是⾮常必要的。12. 特性

此法特异性适于⽢油的检测。13. 灵敏度和检测限

1. 最⼩的吸光分辨率为0.005个吸光单位，相应的最⼤样品体积为

2.000ml，340nm下测量，则样品的⽢油浓度为0.1mg/L；若样品体积为0.100ml，则样品的⽢油浓度为2mg/L。2. 340nm下，吸光度值差为0.020可导出检测限为0.4mg/L，相应的最⼤体积为2.000ml。14. 线性

从1ug⽢油/检品（0.4mg⽢油 /L样品溶液，样品溶液V=2.000ml）到40ug⽢油/检品（0.4g⽢油/L样品溶液，样品V=0.100ml）15. 精确性

⽤同⼀样品溶液做平⾏测定时，其吸光度值差会有0.005⾄0.010的差异，样品体积为0.100ml，340nm 下测量，相应的⽢油浓度约为2-5mg/L；若样品是经过稀释的，则在计算结果时需乘以稀释倍数。16. ⼲扰\\\\信息来源

ATP和PEP的缓慢⽔解同NADH的缓慢氧化均可导致缓慢的蠕变反应；空⽩和样品的吸光度值可不必逐⼀⽴即检测。17. 检测过程中的⼲扰

1. 根据过程中所给定的时间⽢油若能转化完全，则可断定没有⼲扰发⽣。

2. 反应结束后，可加⼊⼀些⽢油重新检测（定性或定量）：如果加⼊标准物质后，吸光度值会随之改变，则可断定没有⼲扰发⽣。

3. 操作过程中的错误和⼲扰可通过两个样品体积的平⾏实验测得（如0.100ml和0.200ml）：测得的吸光度值差应与样品体积成⽐例关系。

当测定固体样品时，可称取不同质量（如1g和2g）于同⼀100ml容量瓶中，测得的吸光度值差及样品的质量应与样品的体积成⽐例关系。

4. 样品所含物质带来的可能⼲扰可通过加⼊内标来控制：除去样品、空⽩及标准的检测外，样品加检测对照溶液也要检测的，测得的吸光度值差可计算⼲扰。

5. 通过回收试验可测定可能的损失：分别测定加⼊标准与不加⼊标准的样品，在误差范围之内可定量测定附加物。18. Carrez试剂的澄清作⽤

－－－－移取液体样品于盛有60ml重蒸⽔的100ml容量瓶中或称取⾜够重量的样品于100ml容量瓶中－－－－加⼊60ml重蒸⽔

－－－－仔细加⼊5mlCarrez-Ⅰ-溶液（85mM，3.60gK4Fe（CN）6*3H2O/100ml）和5ml Carrez-Ⅱ-溶液（250mM，7.20gZNSO4*7H2O/100ml）

－－－－⽤氢氧化钠调节溶液PH于7.5-8.5，加⼊每⼀溶液后需充分混和，加⽔⾄容量瓶刻度，混和并过滤19. 应⽤举例1.果汁中⽢油的检测

－－－－稀释样品其浓度约在0.4g/L 以下（见稀释表格）－－－－过滤混浊果汁，取⽤透明或淡⾊溶液⽤于检测当分析深⾊果汁时（如：草莓汁和红葡萄汁）需要先脱⾊具体操作

－－－－在10ml 果汁中加⼊0.1g 酰胺粉末或PVPP－－－－搅拌1分钟后过滤

－－－－取透明溶液⽤于检测，该溶液可带有轻微颜⾊2.酒中⽢油的检测

－－－－根据稀释表格将样品进⾏稀释－－－－实际上红酒不需脱⾊也可进⾏检测3.啤酒中⽢油的检测

－－－－取5-10ml 啤酒⽤玻璃棒搅拌约1分钟，除去其中的⼆氧化碳⽓体－－－－根据稀释表格稀释脱去⼆氧化碳⽓体后的样品4.烟草制品中⽢油的检测－－－－充分混合并绞碎样品

－－－－精确称取1g 样品于100ml 容量瓶中

－－－－加⼊约70mL ⽔磁⼒搅拌约1⼩时20-25℃下，⽽后加⽔⾄刻度，混和并过滤－－－－移取25ml 滤液于50ml 容量瓶中

－－－－加⼊5mlCarrez-Ⅰ-溶液，5ml Carrez-Ⅱ-溶液及10ml 氢氧化钠溶液，在加⼊每⼀溶液后均需充⼈混和－－－－加⽔⾄刻度混和并过滤，取滤液⽤于检（0.100ml-0.500ml ）5.化妆品中⽢油的检测

6.发酵产品及⽣物培养基中⽢油的检测

－－－－置样品（可先经过离⼼）于80℃⽔浴中15分钟以停⽌酶的反应－－－－离⼼并取上层溶液（可根据稀释表格稀释）⽤于检测－－－－另外可⽤⾼氯酸或Carrez 溶液脱除蛋⽩质琼脂培养基需先均质，⽽后按以上⽅法进⾏操作。

名称：⽢油检测试剂盒编号：EK-GCROL货号：100001001Cas No ：70购买：

Glycerol Assay Kit(70 次测定)简介:

⽢油是⼀种⾮常重要的物质，⼴泛的应⽤于⼯业⽣产中，在⾷品⼯业中，常被作为保湿剂、增⾹剂和增⾊剂等使⽤，以改良⾷品的质量。⽢油是酿酒酵母发酵过程中的副产物,也是灰质葡萄孢新陈代谢过程中的⼀个重要产物，⽢油是⾼品质果酒的⼀个成分，⾼品质的葡萄汁中不含有(或只含有痕量或微量)⽢油，浓度⼤约为1%(v/v)，若葡萄汁中含有⽢油则意味着产品中使⽤了品质不好的原料。⽢油也常常作为润滑剂⽤在洗涤液、乳酪和⽛膏中，在制烟⼯业中，通过通常是预先向烟叶上喷洒⽢油以保障不会粉碎的⽬的。原理:

⽢油在⽢油激酶(GK)的作⽤下被磷酸化，消耗ATP转化成L-3磷酸⽢油（L-glycerol-3-phosphate）。(1) Glycerol + ATP (GK) L-glycerol-3-phosphate + ADP

上式中形成的ADP在丙酮酸激酶(PK)的催化下可与PEP作⽤，⽣成ATP及丙酮酸酯(2) ADP + PEP (PK) ATP + pyruvate

丙酮酸酯在L-乳酸酯脱氢酶(L-LDH)的作⽤下可被NADH还原为L-乳酸酯，NADH被氧化为NAD(3) Pyruvate + NADH + H+ (L-LDH) L-lactate + NAD+

被氧化的NADH的量取决于⽢油的量，NADH的吸光度值可在340下测量。特异性, 灵敏度, 测量范围和精确度:

该实验⽅法是专门⽤于测定⽢油含量的，对于纯⽢油（⽔中的游离⽢油）⼏乎可以100%检测到。

最⼩可调吸光光度为0.010个吸光单位，样品体积为2.00 mL，若在340nm下检测,此时的⽢油浓度为0.171 mg/L。如果最⼩可调吸光光度为0.020吸光光度，样品体积为2.00 mL，在340nm下检测,此时的⽢油检测线为0.342 mg/L。

该实验的测量范围为0.8ug-35ug⽢油，同⼀样品分别进⾏两次测定，其吸光度值会有0.005-0.010吸光单位的变化，对于样品体积为2.00 mL，此时的⽢油浓度⼤约在0.086-0.171 mg/L之间，如果样品是经过稀释的，在计算结果时候需要乘以相应的稀释系数（F）,如果在样品制备阶段，样品的重量是被称量的，如：10g/L,0.02-0.05g/100g的细微差别能够被分辨。⼲扰:

如果⽢油在试验规定的时间内（⼤约5分钟）完成转化过程，通常认为没有⼲扰发⽣，然⽽，通过向已完成反应的试管中添加⽢油（0.1mL中添加20ug），进⼀步的实验表明，吸光度值还会进⼀步降低。

利⽤附带的内部的标准质控可以对⼲扰物质进⾏鉴定。定量回收试验：通过向样品中添加标准质控，计算样品在处理和提取时的损失。如：在最初的提取步骤时添加⼀定量的⽢油。安全性:

⽢油测定所使⽤的试剂没有有毒物质。然⽽浓缩缓冲液中含有作为防腐剂⽤的叠氮化钠(0.02 % w/v)，需要按照实验室安全操作规程进⾏试验。试剂盒:

Megazyme⽢油含量测定试剂盒可以进⾏70次的测定试验，并提供有全部的试验⽅法：瓶1: Tris/HCl 缓冲液 (30 mL, 1.0 M, pH 7.4) +氯化镁(30 mM)+叠氮化钠(0.02 % w/v)稳定性> 2年，4°C保存。

瓶2: 药⽚(14个) 含有NADH+ATP +PEP稳定性> 2年，4°C保存。

瓶3: 丙酮酸激酶(600 U/mL)+L-乳酸酯脱氢酶(550 U/mL)悬浮液1.5mL稳定性> 2年，4°C保存。

瓶4: ⽢油激酶悬浮液(1.5 mL, 85 U/mL)稳定性> 2年，4°C保存。

瓶5: ⽢油质控标准液(5 mL, 0.20 mg/mL)+ 0.02 % (w/v)叠氮化钠稳定性> 2年，4°C保存。试剂制备:

1. 使⽤瓶1作为稀释液。

2. 1.1 mL Tris/HCl缓冲液溶解瓶2中1⽚药⽚，⼤约1-2分钟，⾜够进⾏5次试验。⼀旦药⽚溶解，NADH 吸光度会随着时间的延长⽽降低，不过溶解的药⽚保存在4°C下⼤约可以使⽤4天，或保存于-20°C下⼤约可以使⽤4周的时间。

注意: 在打开瓶⼦前，⾸先需要将瓶⼦中的药⽚恢复到室温，避免潮⽓可能吸附到药⽚上，⽽影响药⽚的稳定性。

3 & 4. 准备瓶3和瓶4种的溶液，第⼀次打开前，需要充分晃动瓶⼦，不要让酶吸附在橡⽪塞上，然后垂直存放好瓶⼦。每次使⽤前还需要充分混合其中的内溶物。5. 准备瓶5溶液。

注意:当您怀疑分光光度计的准确性或怀疑样品中的物质抑制了试验，再使⽤⽢油标准质控溶液进⾏测定，通过测量NADH的消光系数⽽计算⽢油的浓度。实验需要的设备:

1. 容量瓶(50 mL, 100 mL和500 mL).2. ⽐⾊杯 (1 cm,3.0 mL).3. 微量移液器4. 连续分配器5. 分析天平

6. 分光光度计 340 nm.7. 漩涡混合器8. 定时钟

9. Whatman No.1 (9 cm)滤纸操作步骤:波长: 340 nm

⽐⾊杯: 1 cm light path (玻璃或塑料)温度: 25°C最终体积: 2.34 mL

样品溶液: 每个⽐⾊杯中含有0.8-35ug⽢油（存在于0.10-2.0 mL样品溶液中）空⽩调 0：相对于空⽓或者⽔溶液空⽩管样品管蒸馏⽔(~ 25°C)样品

溶液2(NADH/ATP/PEP/Tris/HCl)悬浮液3(PK/L-LDH) 2.10 mL—0.20 mL0.02 mL 2.00 mL0.10 mL0.20 mL0.02 mL

混合*，在反应⼤约4分钟后读取溶液(A1)的吸光度值（前反应完成**），在添加下列试剂后继续进⾏试验悬浮液4(GK) 0.02 mL0.02 mL

混合*，在停⽌反应后（⼤约5分钟）读取溶液(A2)的吸光度值，如果反应没停⽌，在间隔2分钟后，再次测量，直到最终的吸光度值不再变化。

* ⽤塑料棒搅拌或⽤试管塞封闭严实后轻轻颠倒** 必须在等到前反应完成后再添加悬浮液3(PK/L-LDH)计算:

分别对空⽩管和样品管两次测得的吸光度值进⾏相减(A1-A2)，这样就获得了ΔAglycerol，按照常规ΔAglycerol 的数值⾄少要在0.100个吸光单位，才能获得满意的试验结果。⽢油的含量可以依照下列公式计算:C = V x MW x 󰀀ΔAglycerol [g/L]εx d x v注释:

V = 最终体积 [mL]MW = ⽢油分⼦量 [g/mol]ε = NADH在340 nm下的消光系数= 6300 [l x mol-1 x cm-1]d = ⽐⾊管管径 [cm]v = 样品体积 [mL]简化公式:

C = 2.34 x 92.1 x 󰀀ΔAglycerol [g/L]6300 x 1 x 0.10

= 0.3421 x 󰀀ΔAglycerol [g/L]

如果样品在制备过程中被稀释了，计算结果还必须乘以稀释系数F。当被分析的物质为固体或半固体时，⽢油含量(g/100 g)依照下列公式计算：⽢油含量

= C⽢油 [g/L 样品溶液] x 100 [g/100 g]样品重量 [g/L 样品溶液]

注意: 使⽤Mega-CalcTM，该计算⽅法可以被简化。制备样品:1. 稀释样品.

⽐⾊杯中（如：分析0.1 mL的样品）的⽢油总含量必须在0.8-25ug之间，因此样品溶液必须被充分的稀释到浓度在0.008 -0.35g/L之间。

估计浓度(g/L) 蒸馏⽔稀释稀释系数F< 0.350.35-3.53.5-35> 35 不⽤稀释1 + 9

1 + 991 + 999 1101001000

如果ΔAglycerol 的数值太低(如< 0.100)，可以增加称量的样品量或不要进⾏过分稀释，也可以增加⽐⾊管中的样品量到2.00mL，只要确保样品和蒸馏⽔的总量在2.10 mL即可。2. 净化样品.a. 溶液:

Carrez I溶液：溶解3.60 g亚铁氰化钾{K4[Fe(CN)6].3H2O} (Sigma cat. no. P-9387)到100 mL的蒸馏⽔中，室温保存。Carrez II溶液：溶解7.20 g硫酸锌(ZnSO4.7H2O) (Sigma cat. no. Z-4750) 到100 mL的蒸馏⽔中，室温保存。氢氧化钠(NaOH, 100 mM)：溶解4 g NaOH到1 mL的蒸馏⽔中，室温保存。b. 步骤:

吸取液体样品到含有⼤约60 mL蒸馏⽔的100 mL容量瓶中，或称取⾜够量的样品到含有⼤约60 mL蒸馏⽔的100 mL容量瓶中，缓慢的加⼊5mL Carrez I 溶液和10mL NaOH溶液(100 mM)，然后充分混合，补液⾄刻度线，混合并过滤。3. 总则.

(a) 液体样品: 清澈的或稍有些颜⾊的，pH⼤约为中性的液体样品可以直接检测。

(b) 酸性样品: 如果样品为> 0.1 mL的未被稀释的酸性样品（如葡萄酒或果汁），必须⽤2 M NaOH调节pH到⼤约7.4，然后在室温中孵育30分钟。

(c) 含⼆氧化碳样品: 样品中含有⼤量的⼆氧化碳，如：啤酒，必须⽤2 M NaOH调节pH到⼤约7.4，并缓慢的⽤玻璃棒搅拌。(d) 有颜⾊的样品: 测试中附加样品空⽩，如：样品中不含有GK，在这种情况下，样品必须附加样品空⽩。

(e) 重颜⾊的样品: 如果未经稀释的样品颜⾊⾮常深，需要向每10mL的样品中加⼊0.2g聚⼄烯聚吡咯烷酮（PVPP），充分混合5分钟，然后⽤Whatman No. 1滤纸过滤。

(f) 固体样品: 均质或粉碎固体样品，然后加⼊到蒸馏⽔中，并过滤。

(g) 样品含有脂肪: 需要⽤超过脂肪沸点的⽔进⾏提取，如：将100mL容量瓶加热到60°C，然后恢复⾄室温，并补液⾄刻度线，放置冷藏箱中15-30分钟，过滤，弃去最初的⼏mL滤液，选择澄清的或稍有些乳⽩⾊的悬浮液进⾏测试。也可以选择使⽤Carrez 溶液进⾏澄清。

(h) 样品中含有蛋⽩: 使⽤Carrez 溶液去除样品中的蛋⽩。样品处理事例:

(a) 测定葡萄酒中的⽢油.

通常情况下，测定⽩/红葡萄酒中的⽢油含量都不需要对样品进⾏处理，只需要依照稀释表格进⾏稀释即可。如：按照1:20倍稀释0.1mL的样品。(b) 测定啤酒中的⽢油含量.

使⽤玻璃棒进⾏充分的搅拌，去除样品中的⼆氧化碳，然后进⾏稀释即可测定。如：按照1:5倍稀释0.1mL 的样品。(c) 测定果汁和相关饮料中的⽢油含量

稀释样品中的⽢油含量⾄少到0.35 g/L，澄清的、中性的样液可以直接进⾏测试，不需要进⾏特殊处理。浑浊的液体稀释前⾸先需要进⾏过滤。

有颜⾊的样品溶液通常在稀释到适当的⽢油浓度即可测定。然⽽，如果要测定不经稀释的样品液中的⽢油浓度，需要依照下列步骤进⾏脱⾊：

⽤1 M NaOH调节25mL样品溶液的pH⼤约⾄7.4，然后⽤蒸馏⽔补液⾄50 mL，加⼊0.5g PVPP，充分搅拌5分钟，然后⽤Whatman No. 1滤纸过滤。使⽤澄清的或稍有些颜⾊的提取液进⾏测试。没有必要进⼀步稀释，可以直接进⾏测定。(d) 测定烟草制品中的⽢油含量.

将样品粉碎成⼤约0.2 mm的⼩颗粒，准确的称量1g样品，放⼊到100 mL容量瓶中，加⼊⼤约60 mL蒸馏⽔，⽤磁⼒搅拌器在20-25°C下充分搅拌1⼩时，然后⽤蒸馏⽔补液⾄刻度线，混合并过滤。移取25 mL 滤液到50mL容量瓶中，继续加⼊5 mLCarrez I 溶液、5 mL Carrez II 溶液和10 mL NaOH溶液(100 mM)，每加⼀种溶液都要充分混合，然后补液⾄刻度线，混合并⽤Whatman GF/A玻璃纤维滤纸过滤，没有必要进⼀步稀释，可以直接进⾏测定。(e) 测定肥皂中的⽢油含量.

准确称取1 g粉碎的肥皂粉末，加⼊50mL 0.1M HCl ，⽤热磁⼒搅拌器充分搅拌⾄沸腾，将溶液转移⾄100 mL容量瓶中，然后添加30mL 0.1M HCl继续搅拌提取，待温度降⾄20-25°C后⽤蒸馏⽔补液⾄刻度线，

将容量瓶放置于冷藏室15分钟，⽤Whatman GF/A玻璃纤维滤纸过滤，取25 mL滤液，加⼊2 mL 2 M Tris/HCl 缓冲液（pH7.4，⾃备），⽤1M NaOH调解pH⼤约⾄7.4，补液⾄50 mL，直接对该溶液（或进⼀步稀释）进⾏测定。(f) 测定⽛膏中的⽢油含量.

准确称取1 g⽛膏样品，加⼊70 mL蒸馏⽔，在70°C下充分搅拌30分钟，然后离⼼(~ 3,000g 10分钟)，再次洗涤悬浮液中的⼩球2次—加⼊50 mL蒸馏⽔，重复搅拌和离⼼步骤，补液⾄250 mL并过滤，可以按照1:3倍稀释0.1 mL滤液，进⾏测定。参考⽂献:

1. Spinella, C. I. (1966). Modified enzymatic procedure for the routine determination of glycerol and triglycerides in plasma. J.Lipid Res. 7,167-169.

2. Klopper,W. J.,Angelino, S.A. G. F.,Tuning, B. & Vermeire, H.A. (1986). Organic acids and glycerol in beer. J. Inst. Brew. 92,225-228.

3. Michal, G. (1976). Enzymatische analyse in der pharmazie. Acta Pharmaceutica Technologica, Suppl. 1,S, 151-162.4. Pfandl,A. & Menschig, D. (1984). Ein beitrag zur enzymatischen glycerinund ethanol-bestimmung. Pharm. Ind. 46, 403-407.

5. Wieland, O. H. (1988). Glycerol. In Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.), 3rd ed., Vol.VI, pp. 504-510,VCH Publishers (UK) Ltd., Cambridge, UK.