棉花黄萎病生防芽孢杆菌z-5菌株发酵培养基的优化
2023-02-03
来源:步旅网
棉花学报 Co ̄on Science 2014,26(1):10-17 棉花黄萎病生防芽孢杆菌z.5菌株发酵培养基的优化 张冬冬。姜军坡,朱宝成 (河北农业大学生命科学学院,河北保定071001) 摘要:在农用微生物菌剂中芽孢杆菌菌剂产品多采用芽孢作为有效成分,因此产芽孢条件的优化对棉花黄萎 病生防细菌的工业生产有着重要意义。本文通过单因素试验分析了8种碳源、8种氮源和6种无机盐对 BacillusmalacitensisZ.5菌株芽孢产量的影响.采用PlackeR—Burman试验设计确定了影响芽孢产量的主要因 素,用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,利用Box.Behnken试验设计及响应面分析法确定主要影响因素的最 佳条件。结果表明,单因素试验筛选出3种碳源(玉米粉、麸皮、葡萄糖)、3种氮源(豆饼粉、花生饼粉、酵母粉) 和2种无机盐(MnSO4・H20、CaC12);PlackeR.Burman试验确定z 5菌株生产芽孢最适碳源、无机盐和氮源分别 为玉米粉、MnSO ・H:O和豆饼粉,最陡爬坡路径法获得此3种因子的最适浓度范围为:玉米粉1.0%一2.O%、 MnSO4・H2O 0.05%一0.09%、豆饼粉为1.0%~2.0%。响应面法得到芽孢产量与玉米粉、MnSO ・H20和豆饼粉含 量的回归方程。最终确定优化培养基组合为玉米粉1.66%、豆饼粉1.30%、MnSO ・H20 0.07%、NaH2PO ・2H20 0.2%、Na2HPO4・2H:O 0.4%,优化后芽孢产量达到1.97xl0 mL~,与理论值基本相符。 关键词:响应面法;棉花黄萎病;生物防治;芽孢杆菌;发酵 中图分类号:¥435.621 文献标志码:A 文章编号:1002.7807(2014)01.0010.08 Optimization of Fermentation Conditions of a Biocontrol Bacterial Isolate Bacillus Z-5 against Cotton Verticillium Wilt Zhang Dongdong,Jiang Junpo,Zhu Baocheng (College ofLi ̄Science,Agricultural University ofHebei,Baoding,Hebei 071001,China) Abstract:The spore was usually used as the active ingredient for most Bacillus products in agncultural microorganism prepara- tion,so optimization of spores producing conditions of Bacillus malacitensis Z一5,a biocontrol bacterial isolate against coRon verticillium wilt,was of great significance in industialr production.The effects of eight kinds of carbon sources,eight kinds of nirtogen sources and six inorganic salts on the yield of spores produced by Bacillus malacitensis Z--5 were studied by single fac-・ tor analysis in order to gain the optimum carbon,nirtogen and inorganic salt.Placke ̄-Burman(PB)experimental design was used to determine the main factors affecting spore production.The pass of steepest ascent was unde ̄aken to approach the opti— mal response region of the three signiifcant factors.Box—Behnken design and response surface analysis were adopted to further investigate the mutual interaction between the variables and identify optimal values that bring maximum spore yield.The result showed that com flour,bran and glucose were the three most suitable carbon sources according to single factorial experiments, while soybean meal,peanut meal and yeast were the three best nitrogen sources,and MnSO4・H20 and CaC12 were he bestt inor— ganic salt.It’s also showed in PB design that com flour,MnSO4・H2O and soybean meal were he optitmum carbon sources,inor- ganic salt and nitrogen sources,respectively.The path of steepest ascent experiment was employed to approach the optimal re— gion ofthe medium concentration ofcorn flour 1.0%一2.0%,MnSO4・H2O O.05%-0.09%and soybean meal 1.0%一2.0%.The re- gression equation between the spore production of Bacillus malacitensis Z一5 and the variables from carbon source,inorganic salt and nirogen tsources content by the response surface method were computed.The final optimal cultre mediuum was as followed: corn flour 1.66%,soybean meal 1.30%,MnSO4・H20 0.07%,NaH2PO4・2H2O 0.2%,Na2HPO4・2H20 0.4%.The spore yield 收稿日期:2013.09 25 作者简介:张冬冬(1981一),男,在读博士,讲师,zhangdongcumt@163.corn; 通讯作者,朱宝成,zhu2222@126.com 基金项目:保定市科学研究与发展计划项目(10ZC004);河北省自然科学基金项目(C2014204027) 1期 张冬冬等:棉花黄萎病生防芽孢杆菌Z一5菌株发酵培养基的优化 11 reached 1.97x 1 0 mL。 after fermentation experiment under optimal condition and basically consistent with the theoretical value Key words:response surface method;cotton Verticillium wilt;biocontrol;Bacillus spp.;fermentation 棉花黄萎病(CottonVerticilliumWilt)是由大 丽轮枝菌(Verticillium dahliaeK1eb.)引起的危害 极大的维管束病害.是棉花生长过程中重要的病 害之一【”。目前防治棉花黄萎病的主要方法是应 用抗病品种、化学防治和农业措施防治等,但防 病效果都不理想[2- 。生物防治因对人畜安全无毒、 无污染、无残留,具有不易使病原菌产生耐药性、 生产工艺较简单、且有些生防微生物还具有促进 作物生长的特点而受到研究者的青睐 。 芽孢杆菌(Bacillus spp.)是一类好氧或兼性 厌氧、产芽孢的细菌的总称,其突出特征是能够 产生抗逆耐热的芽孢,这有利于生防菌的生产、 剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖。田间应 用研究已经证实.芽孢杆菌生防菌剂在稳定性、 与化学农药相容性和在不同植物不同年份防效 的一致性等方面。明显优于不产芽孢的细菌生防 菌和真菌生防菌【∞】。 芽孢杆菌菌剂产品多采用芽孢为有效活性 成分,多以活菌含量和芽孢产率为主要指标 】, 因而具有对不良环境抵抗力强、可长期贮存等优 势。产芽孢条件的优化对工业生产有着重要意 义.通过发酵优化可以提高活菌产量和芽孢产 率.降低生产成本。 在相关的前期工作中,本项目组分离了1株 对棉花黄萎病有较高防治效果的Bacillus malacitensisZ一5菌株,能在棉花根系土壤、根内、 茎和叶片成功定殖,具备产业化潜力[12-131。因此, 本研究以Z.5菌株为材料,利用DesignExpert软 件、采用Plackett—Burman(PB)试验设计和响应面 分析法 ],优化z.5菌株的发酵条件。为棉花黄 萎病生防菌剂的工业化生产奠定基础。 1 材料和方法 1.1菌株和培养基 芽孢杆菌Z一5菌株由河北农业大学生命科学 学院制药工程系从棉田土壤中分离,通过对该菌 株的形态特征观察、生理生化鉴定和16S rDNA 的序列分析,确定Z.5菌株为Bacillus malaciten. sjs,对棉花黄萎病有明显的防治作用[ 。 营养琼脂(NA)培养基:蛋白胨1.0%、牛肉膏 0.3%、氯化钠0.5%、琼脂1.5%,pH 7.2~7.4。 种子培养基:蛋白胨1.0%、葡萄糖1.0%、 NaH2PO4’21-120 0.2%、MgSO4・7/-120 0.05%.pH 7.2~7.4。 基础发酵培养基:葡萄糖2.0%、蛋白胨 1.0%、Na2HPO4・2H2O 0.4%、NaH2PO4・2H2O 0.2%、 MgSO4・7H20 0.05%、CaC12・2H20 0.02%.pH 7.2~7.4。 1.2芽孢杆菌的培养方法 菌种的活化:将保存的菌株接种于NA斜面 培养基上。37℃恒温培养24h。 液态种子培养:250 mL三角瓶装液量为50 mL种子培养基,灭菌后冷却至室温,220 r・min~、 37℃恒温振荡培养12 h。 1.3 生长曲线的测定 将Bacillus malacitensis Z.5菌株种子液以 2%的接种量,接入50 mL基础发酵培养基中 (250 mL三角瓶),220 r・min~、37℃恒温振荡培 养。每隔2 h取发酵液测吸光度(0D鲫),绘制生 长曲线。 1.4生物量和芽孢产量的检测 生物量测定采用细菌计数板计数。芽孢产量 测定采用染色法.利用孔雀石绿初染和沙黄复 染。在100x物镜显微镜下观察。芽孢为绿色,菌体 为红色。每处理选择5个不同的视野,分别统计 芽孢和菌体数量。每处理重复3次。芽孢产率即 芽孢数与总菌数的比值。 1.5培养基成分单因素试验 为了确定Bacillus malacitensis Z.5菌株最适 碳源、氮源及无机盐,选取8种碳源(葡萄糖、乳 糖、麦芽糖、蔗糖、糊精、玉米粉、甘露醇、淀粉)、8 种氮源(尿素、硫酸铵、花生饼粉、蛋白胨、大豆蛋 白胨、豆饼粉、牛肉膏、酵母粉)及6种无机盐(Fe. SO4、ZnSO4、CuSO4・5H2O、CaC12、MnSO4・H20、M- gSO ・7H 0),在基础发酵培养基的基础上,单因 素变化碳源、氮源或无机盐的种类,配制各种发 Cotton Science 12 棉 花学报 26卷 酵培养基。将培养12 h的种子液接入发酵培养基 中,接种量为2.0%,250 mL的三角瓶装液量为 2 结果与分析 50 rnL,220 r-min~、37℃振荡培养48 h。以发酵 2.1 Z一5菌株的生长曲线测定 液活菌含量和芽孢产率为指标,依次优化碳源、 Bacillus malacitensis Z一5的生长曲线显示, 氮源、无机盐。每次优化后的结果进入随后的条 0--4 h为生长延滞期,4~14 h为对数生长期, 件优化试验。 14 h后进入稳定期。因此,通过该研究结果可以 1.6培养基配方优化试验设计 确定种龄12 h的培养液可作为种子液。此时培 在基础发酵培养基基础上,采用单因子法筛 养液既保持着旺盛的增殖能力.又达到了较高的 选合适的碳源、氮源、无机盐,综合各单因素试验 菌体浓度,且细胞大小比较一致,生长活力强。 结果,选择确定的碳源、氮源和无机盐,利用 2.2碳源对z_5菌株发酵性能的影响 Plackett—Burman试验设计方案筛选确定对活菌 以蛋白胨1.0%、Na2HPO4 0.4%、NaH2PO4 含量和芽孢产率影响较大的因子。再通过爬坡试 0.2%、MgSO4・7H2O 0.05%、CaC12・2H2O 0.02%为 验确定因子的浓度范围,利用响应面分析法(Re. 基础培养基,分别加入2.0%的8种不同碳源,进 sponse surface methodology)中的Box—Behnken试 行发酵试验 比较不同碳源对Z一5菌株发酵液活 验方案进行设计,通过实验数据拟合得到二阶响应 菌含量和芽孢产率的影响。结果(表1)表明,以玉 面模型,最终确定最优试验条件,并进行验证[ 。使 米粉为碳源时活菌含量和芽孢产率最高,活菌含 用统计分析软件Design—Expert v8.0.6.1对Plack— 量为2.9x10 mL~,芽孢产率为86.6%;其次为麸 ett—Burman试验和响应面优化设计结果进行处理 皮和葡萄糖。因此选择玉米粉、麸皮和葡萄糖为 分析 Placke ̄一Burman试验的考察因子。 表1 8种碳源对Bacillus malacitensis z-5菌株发酵性能的影响 Table 1 Influence of eight carbon soumes on fermentation performance of Bacillus malacitensis Z-5 2-3氮源对Z一5菌株发酵性能的影响 胨>尿素:对芽孢产率的影响依次为:豆饼粉> 以玉米粉2.0%、Na2HPO4 0.4%、NaH2PO4 花生饼粉>酵母粉>蛋白胨>大豆蛋白胨:硫 0.2%、MgSO4・7H20 0.05%、CaCI2・2H20 0.02%为 酸铵>牛肉膏>尿素:豆饼粉为氮源时活菌含量 基础培养基,分别加入1.0%的8种不同氮源,进 和芽孢产率最高,分别达到6.74xlO mL 和 行发酵试验。结果(表2)表明,8种氮源对Z.5菌 91.5%,因此豆饼粉为最佳氮源;其次为花生饼粉 株活菌含量的影响依次为:豆饼粉>花生饼粉> 和酵母粉。因此选择豆饼粉、花生饼粉和酵母粉 酵母粉>硫酸铵>大豆蛋白胨>牛肉膏>蛋白 为Placke ̄.Burman试验氮源的考察因子。 表2 8种氮源对Bacillus malacitensis Z一5菌株发酵-眭能的影响 Table 2 Influence of eight nitrogen sources on fermentation performance of Bacillus malacitensisstrain l期 张冬冬等:棉花黄萎病生防芽孢杆菌Z一5菌株发酵培养基的优化 13 2.4无机盐对Z一5菌株发酵性能的影响 明,MnSO4・H2O对Z一5菌株发酵的促进作用最 以玉米粉2.0%、豆饼粉1.O%、Na2HPO 强,活菌含量达1.03xl0 mL~,芽孢产率达 0.4%、NaH2PO 0。2%作为摇瓶发酵基础培养基, 95.7%;其次为CaC12。因此,以MnSO4.H20和 分别加入0.02%的6种不同无机盐.比较不同无 CaCI2为Placke ̄.Burman试验无机盐成分的考察 机盐对z一5菌株发酵性能的影响。结果(表3)表 因子。 表3 6种无机盐对Bac ̄us malacitensis Z一5菌株发酵性能的影响 Table 3 Influence of six inorganic salts on fermentation performance of Bacillus malacitensis Z一5 2.5 Plackett-Burman试验设计 水平“1”,2个水平见表4。通过不同的组合,检测 根据已经确定的碳源、氮源和无机盐单因素 发酵液的活菌含量和芽孢产率。试验设计方案及 试验确定的初始发酵培养基中的8种营养成分 结果见表5。 作为影响因素进行考察。分别为玉米粉、麸皮、葡 通过Design Expert软件对芽孢产量测定结 萄糖、豆饼粉、花生饼粉、酵母粉、MnSO -H20和 果进行统计分析,获得多元一次回归方程:rl= CaC1 ,选用8因子2水平试验次数N=12的设 0.95+0.17a一0.24b+0.11c-0.20e-0.012f+0.069g-0.22 计,表4和表5中A、B、C、E、F、G、J和K分别代 j+o.1lk,式中r】为芽孢产量的预测值,a、b、c、e、f、 表麸皮、玉米粉、葡萄糖、豆饼粉、花生饼粉、酵母 g、f、k分别为麸皮、玉米粉、葡萄糖、豆饼粉、花生 粉、MnSO4.H2O和CaC12,用D、H、L代表虚拟因 饼粉、酵母粉、MnSO ・H O和CaCI 含量的编码 子以考察试验误差。每个因子取低水平“.1”和高 水平。 表4 Plackett—Burman试验因素及水平设置 Table 4 Factors and levels design of Plackett—-Burman experiment 14 棉花学报 26卷 2 3 4 5 6 7 8 9 m¨ 由芽孢产量影响因素主效应分析结果可知, malacitensis Z.5菌株芽孢产量的主要因素,利用 回归模型的P值为0.0277(P<0.05),说明该模型 爬坡路径法和响应面分析法对培养基的这3个 显著,即该模型在被研究的整个回归区域拟合很 组分进行更深入研究。 好。培养基中各因素对BacillusmalacitensisZ一5 2.6响应面分析的试验设计及结果 菌株芽孢产量的影响效应大/] ̄JJbil序依次为:玉米 根据最陡爬坡试验的结果,采用Box— 粉>M_nSO4・H20>豆饼粉>麸皮>CaC12>葡萄 Behnken设计法。在培养基中玉米粉为1.5%、Mn. 糖>酵母粉>花生饼粉,其中玉米粉(P= SO ・H20为0.07%、豆饼粉为1.5%的条件下,进 0.0093)、MnSO4・H20(P=-0.0128)、豆饼粉( 行3因素(玉米粉、MnSO ・H O、豆饼粉)3水平 0.0164)是主要的影响因子。因此,本试验结果确 (编码为.1,0,1)的响应面分析实验。芽孢产量的 定玉米粉、MnSO4・H20、豆饼粉为影响Bacillus 测定结果见表6。 L L二=L C;表6 Box—Behnken响应面优化试验结果 L c; 诣 躔&} Table 6 Box-Behnken values by Response surface design Cotton Science 1期 张冬冬等:棉花黄萎病生防芽孢杆菌Z一5菌株发酵培养基的优化 17 Huazhong Agricultural University,200 1,2O(5):422—425. [13J张冬冬,刘涛,高同国,等.棉花黄萎病拮抗细菌Z一5菌株的 【4]陈旭升,陈永萱,黄骏麒.棉花黄萎病菌致病性生理生化研究 进展[J】.棉花学报,2001,13(3):183—187. Chen Xusheng,Chen Yongxuan,Huang Junqi.Advances ofsmd— ies on physiological and biochemical properties of pathogenesis 定殖能力检测[J].棉花学报,2013,25(5):510—516. Zhang Dongdong,Liu Tao,Gao Tongguo,et a1.Detection of colonization ability of ntaagonistic bacteria Z-5 strain against coRon Verticillium wilt[J].Cotton Science,2013,25(5):510— 516. caused by Verticillium dahliae in cotton[J]l Co ̄on Science, 2001,l3(3):183—187. [14]赵颖,罗璇,钟晓凌,等.响应面法优化产类胡萝 素红酵母 [5]张洪涛,于频频,艾山江・阿布都拉,等.棉花黄萎病高效拮抗 液体发酵培养基的研究【J].化学与生物工程,2007,24(12): 菌XJUL一6的筛选鉴定及其特性研翘J].微生物学报,2007,47 (6):1084—1087. Zhang Hongtao,Yu Pinpin,Abudula H,et a1.Characteristics and identification of an antagonistic XJ1Ⅱ 一6 against co ̄on verticilli— um wilt[J].Acta Microbiologica Sinica,2007,47(6):1084—1087. [6】李社增,鹿秀云,马平,等.防治棉花黄萎病的生防细菌NCD.2 的田间效果评价及其鉴定[J].植物病理学报,2005,35(5): 451—455. 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