兔眼虹膜色素上皮细胞的组织培养与超微结构观察

中华眼底病杂志２００２年３月第ｌ８卷第１期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｏｃｕｌ　Ｆｕｎｄｕｓ　Ｄｉｓ，Ｍａｒ　２００２，Ｖｏ１　１８…Ｎ　１　６１　・实验研究・　兔眼虹膜色素上皮细胞的组织培养与　超微结构观察　王兆艳惠延年　【摘要】　目的　建立一种虹膜色素上皮（ｉｒｉｓ　ｐｉｇｍｅｎｔ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，ＩＰＥ）细胞培养方法。　方法　使用　酶消化加机械分离的方法培养ＩＰＥ细胞并进行组织学观察。　结果用该方法可成功培养ＩＰＥ细胞．培养　的ＩＰＥ细胞在原代及传代生长过程中同视同膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌ　ｐｉｇｍｅｎｔ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｍｎ，ＲＰＥ）细胞没有明显　区别。　结论酶消化加机械分离的方法是培养ＩＰＥ的理想方法　【关链词】色素上皮，眼／超微结构；虹膜；组织培养　中国分类号：Ｒ３２９．２—３３２　Ｒ２９　Ｚ４　Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｂｂｉｔ　ｉｒｉｓ　ｐｉｇｍｅｎｔ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｕｌｔｒａ．ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ＡＮＧ　Ｚｈａｏｙａｎ，　ＨＵＩ　Ｙａｎｎｉａｎ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｐｈｔｈａｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ　Ｆｏｕｒｔｈ　ＭｉｌｉｔａＧｖ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｘｉａｎ　７１００３２　Ｃｈ　ｚｉ，ｌ￣　【Ａｓｂｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ｛ｏｒ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ　０ｆ　ｉｒｉｓ　ｐｉｇｍｅｎｔ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　（ＩＰＥ）．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｅ—Ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｍｉ㈣ｄｌｓｓｅｃｎ０ｎ％ｖｓｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　Ｉｓｏ［ａｔｅ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅ　ｔｈｅ　ＩＰＥ　ｃｅｌｌｓ　Ａｎ　ｉ－　ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｍａｄｅ　ｗｉｔｈ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ　ａｎｄ　ｌｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｅｈｅｍ［ｃａｌ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＩＰＥ　ｗｅｒｅ　ｓｕｃ—　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｃｅｓｓ｛ｕｌｌｙ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ａｎｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｗｉｔｈ　ＲＰＥ　１ｎ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｅｕｈ　Ｌｉｆｅ　ａｎｄ　ｓｕｂｃｕｈｕｒｅ　Ｅｎｚｙｍｅ—Ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　ｌｓ　ａ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ａｎｄ　ｑｕｉｃｋ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＰＥ　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］Ｐｉｇｍｅｎｔ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ　０ｆ　ｅｙｅ／ｕ［ｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；Ｉｒｉｓ；Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　虹膜色素上皮（ＩＰＥ）细胞与视网膜色素上皮　（ＲＰＥ）细胞在解剖上具有连续性，在胚胎起源上具有　同源性，因而ＩＰＥ细胞具有替代ＲＰＥ细胞移植到视网　膜神经上皮下的可能一胜　。过去２０年已成功分离并培　复器轻轻将ＩＰＥ细胞自基质分离．使ＩＰＥ细胞脱落，　继续消化２０　ｍｉｎ后，将细胞收集到含有血清的改良依　格培养液（Ｄｕｌｂｅｅｏ　ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ，　ＤＭＥＭ）液中．终止消化，１　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ，弃　上清，再用ＤＭＥＭ液洗涤ＩＰＥ细胞２次．血球计数板　计数，并用０　４　锥虫蓝染色测定细胞存活率，然后将　细胞混悬于含１５　新生牛血清（ｎｅｏｎａｔａｌ　ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ，　ＮＣＳ）的ＤＭＥＭ中．接种于培养瓶中，置３７　Ｃ，５　ＣＯ　孵箱中培养，３　ｄ后倒置显微镜下观察，更换培养　养了ＲＰＥ细胞，然而对于ＩＰＥ细胞培养仅Ｈｕ等　作　了一些工作。我们进行了ＩＰＥ细胞原代及传代培养技　术的实验研究，现将结果报告如下。　１材料和方法　１　１兔ＩＰＥ、ＲＰＥ细胞的提取　选出生后１个月杂色家兔（第四军医大学动物研　液，以后每日观察细胞生长状态，２～３　ｄ换液至细胞　近融合状态。眼后节则置于眼托上，弃去玻璃体及视网　膜感觉部，用ＢＳＳ液轻漂洗２～３遍，继以终浓度为　０．２５　胰蛋白酶、１００　Ｕ／ｍｌ透明质酸酶、０．０１　究中心提供），雄雌兼用。耳缘静脉注射空气５　ｍｌ处死　后即刻摘出眼球，用含庆大霉素的平衡盐溶液（ｂａｌ　ａｎｅｅｄ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＢＳＳ）彻底冲洗，无菌条件下沿眼　球赤道部环形剪开，将眼球分成眼前部和后部。去除角　膜、晶状体、玻璃体，仔细从根部分离虹膜，将虹膜后表　面向上置于培养皿内，用ＢＳＳ液轻轻冲洗２～３遍，然　后用０．２５　胰蛋酶和２００　Ｕ／ｍｌ胶原酶及０　０１　依　地酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｏｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ，ＥＤＴＡ）的混合　消化液消化１　５～２　０　ｈ，再在解剖显微镜下用虹膜恢　作者单位：７１００３ｚ西安，第四军医大学西京医院眼科［王兆艳（博士研究　生，现在解放军总医院眼科）］　ＥＤＴＡ混合消化液消化３０　ｍｉｎ，用吸管轻轻反复吹打，　使ＲＰＥ细胞脱落，将ＲＰＥ收集，离心等方法同ＩＰＥ细　胞处理方法。　１．２兔ＩＰＥ、ＲＰＥ细胞传代培养及形态学观察　１　２　１　细胞传代及培养　待原代培养的ＩＰＥ、ＲＰＥ　细胞近融合时，０　２５　胰蛋白酶消化，加入含１０　ＮＣＳ的ＤＭＥＭ液制成细胞悬液，按１：３～１：４接种　于培养瓶内．按１：３～１：４传代，２～３　ｄ换液，倒置显　微镜下观察，照相。　维普资讯 http://www.cqvip.com

６２　中华跟底病杂志２００２年３月第ｌ８卷第ｉ朝Ｃｈｉｎ】Ｏｃｕ【Ｆｕｎｄｕｓ　Ｄｉｓ．Ｍａｒ　２００２，Ｖ。ｌ　１８　Ｎ。．１　ｌ＿２．２传代ＩＰＥ、ＲＰＥ细胞的透射电镜观察将第２　次传代的ＩＰＥ细胞接种于置有层粘连蛋白的培养瓶　内，细胞增生达到融合状态后，弃去瓶中培养液，用　１：１００的链霉亲和素生物素化过氧化物酶复合物　（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　ｂｉｏｔｉｎ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ，ＳＡＢＣ）液加　至玻片上．室温下孵育３０　ｍｉｎ，然后加二氧基联苯胺　（ｄｌｉａｍｉｎｏｂｅｚｉｄｉｎ．ＤＡＢ）在室温下显色，光学显微镜下　０．２５　胰蛋白酶消化１０　ｍｉｎ，吸管反复吹打瓶壁，将　脱落细胞移人１０　ｍｌ尖底离心管中，加４　ｃ预冷的磷　观察，适时用自来水冲洗，终止显色反应。用苏木素复　ｌ＿　．　酸盐缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｔｔｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）至１　０　染６０　ｓ．显微镜检查并照相。胞浆呈棕黄色为阳性，阴　ｍｌ并用吸管轻轻吹打均匀．然后以２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心　眭对照组的第二抗体用ＰＢＳ取代。　１　５～２０　ｍｉｎ，吸弃上清液，将离心管倾斜一定角度，用　①　吸管沿管壁缓缓加人４　Ｃ预冷的２　戊二醛４　ｍ１．在　２结果　４℃状态下固定３０　ｍｉｎ～２　ｈ．然后用针拔离细胞团　２．１兔ＩＰＥ、ＲＰＥ细胞体外生长状态下的形态观察　块．穆人青霉素小瓶中，ＰＢＳ冲洗３遍．１　四氧化饿后　原代分离的ＩＰＥ细胞，细胞存活率为７２０４，ＲＰＥ　固定，丙酮系列脱水，浸透包埋，制备超薄切片．醋酸双　细胞存活率为７８　。２种细胞分离后悬浮于培养液中，　氧铀加枸椽酸铅染色后置电镜下观察细胞超微结构　呈含黑色素粒的球形外观。３　ｄ后观察，太部分细胞附　１．３细胞生长曲线测定　壁，呈扁平多角形或不规则圆形，富含黑色素粒，细胞　取对数生长期细胞．制成浓度为１×１０　／ｍｌ的细　核呈圆形或卵圆形，部分细胞开始生长，可见双棱细胞　胞悬液，将其接种于３Ｏ个２５　ｍｌ玻璃培养瓶中．每瓶　（图１）。原代培养的ＩＰＥ细胞在１　０～１４　ｄ时融合，融　接种５　ｍｌ，每天取出３瓶进行细胞计数，计算均值，连　合后的细胞多呈多角形或增大呈梭形，此时细胞中的　续观察１０　ｄ，每３天换１次液。以培养时问为横轴．细　黑色素粒仍很丰富。细胞传代１次后，细胞附壁，形态　胞数为纵轴．描绘该细胞的生长曲线　不规则，有些细胞伸出伪足．变长为长梭形，５～７　ｄ细　１．４免ＩＰＥ、ＲＰＥ细胞的鉴定　胞增生即达到融合状态　第３次传代后的细胞内黑色　将细胞接种于预先置有１８　ｔｉｌｍ×１　８　ｍｍ玻片的６　素粒明显减少．但仍可见细胞核被完全遮盖的黑色细　Ｌ板中，５　ｄ时取出玻片　冰丙酮固定１０　ｍｉｎ，用台３　胞（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ　ｃｅｌ１）（图２）。第３次传代的ＩＰＥ细胞电镜　Ｈ　Ｏｚ的甲醇在室温下作用３０　ｍｉｎ．以封闭内源性酶．　下观察，可见细胞表面有丰富的微绒毛，可在部分细胞　将抗体滴度为１：５０鼠抗兔角蛋白克隆抗体，滴加于　基底部发现半桥粒样结构，胞质内可见有丰富的糖原颗　细胞片上，于湿盒内４℃过夜，３７℃水浴中复温１　ｈ，滴　粒、线粒体、粗面内质冈、溶酶体及脂质体，部分细胞内　加１：１０Ｏ羊抗鼠生物素化二抗．作用３０　ｍｉｎ．以　仍可见到有黑色素粒，细胞内有丰富的微丝（图３）。　营　．譬　－　’　ｊ　田ｌ碾代培养４　ｄ的兔ＩＰＥ细胞倒置显微镜像　ＩＰＥ细胞附壁良好，多呈多角形　仍富古黑色素粒ｔ黑莆），可见双棱细胞（黑箭圭）×ＺＯＯ　图２传代１敬，接种７２　ｂ的兔１ＰＥ细晦倒置显微镜像　细胞形态不规则，多呈梭形，色素粒明显碱少，但有的仉富古黑色素粒（黑箭头）　×２００圈３传代３欢后兔ＩＰＥ细胞电镜像。细胞具有极性，基底部有伴桥粒样结构（黑箭），顶部有微绒毛（黑箭头）　醋酸双氧铀一枸橼酸　铅姿色×３　０００圈５第３搬传代的免ＩＰＥ细胞抗角蛋白船色像　昕有细胞都呈明显的　胞装内棕黄色阳性染色，胞棱呈蓝紫色ＳＡｇＣ　×４００　Ｆｉｇ　１　Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈ　ｏｆ　ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｐｈａｓｅ　ＣＯｎｔｒ￣ｓ［ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｏｆ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｒｕｅｄ　ｒａｂｂｉｔ　ｉｒｉｓ　ｐｉｇｍｅｒｉｔ　ｅｐｉｔｈｅｔｉｕｍ（ＩＰＥ）Ｃｅｌｌｓ　ａｔｔａｃｈｅｄ　ｗａｔｔ　ａｎｄ　ｅ　ｐｏｌｙｇｏｎａｌ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｌａｒｇｅ　Ｐ　Ｌ　ｉ／ｌｅｎｔ　ｇｒａⅡｕｌｅｓ（ｂｌａｃｋ　ｎｒｒｕｗ），ｓｏｍｅｗｅＹｅ　ｄｏｕｂｋ　ＲＵＣｌｅｕｓ（ｂｌａｃｋ　ａｒｒｏｗｈｅａｄｊ　×２Ｏ０　Ｆｉｇ．２　Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈ　０　ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｐｈａｓｅ　ｅｏｎｎ∞ｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｒａｂｂｉｔ　ＩＰＥ　ｃｅｌｌｓ　ｓｅｅｄｅｄ　７２　ｂ，ＩＰＥ　ｃｅｌｔｓ　ｗｅＴｅ　ｓｐｉｎｄｔｏ—ｓｈａｐｅｄ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｌｅｓｓ　ｐｉｇ　ｍｅｍ　ｇｒａｎｕｔｏｓ　ｂｕｔ…ｅ　ｓｔｉＵ　ｃ０∞！ａ　ｎｍｇ　ｍｕｃｈ　ｐｉｇＪｎｅｎｔ　ｇｒａｎｕｌｅｓ（ｂ【　ｋ　ｂｅａｄ）　ｘ２００　Ｆ衄　３　Ｔｒａｎ　…帅ｅｌｅｃｔｒｏＪ￣ｍＪｃｒｏｇｒａｐｂ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｉｒｄ　ｓｕｂｃｕ［ｔｕｒｅｄ　ｒａｂｂｉｔ　ＩＰＥ　ｃｅｌｔｓ　ｄｌｓｐｔａｙｅｄ　ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｈｅｍｉｄｅｓｍｏｓｏｍｅ—ｈｋｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｔ　ｂａｓｅ（ｂｌａｃｋ　ａｒｒｏｗ）ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｖｌｔｔｉ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｕｐｐｅｒ　ｓｕｒｆ一【ｂｌａｃｋ　ＲＵｒＯＷｈｅａｄ）　Ｕｒａｎｙｌ　ａｃｅｔａｔｅ　ａｎｄ【ｅａｄ　ｃｉｔｒａｔｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　×３　０００　Ｆｉｇ．Ｓ　Ｐｏｓｋｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｏｂｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａ［ｓｔａｉｎ［ｎｇ　ｏｆ　ａｎｔｉｃＹ　ｔｏｋｅｒａｔｌｎ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　ｓｕｂｃｕｔｔｕｒｅｄ　ＩＰＥ　ｗｉｔｈ　ｄａｒｋ　ｙｅｌｌｏｗ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｔｏｃａｒｅｄ　ｉｎ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍ　ａｎｄ　ｄａｒｋ　ｐｕｒｐｌｅ　ｉｎ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ＳＡＢＣ　×４００　维普资讯 http://www.cqvip.com

中华跟底病杂志２０Ｏ２年３月第ｉ８卷第１胡Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｏｃｕｌ　Ｆｕｎｄｕｓ　Ｉ）Ｌｓ．Ｍａｒ　２ｕ０２．Ｖｏｌ　ｉ８～Ｎ　ｉ　２．２兔ＩＰＥ、ＲＰＥ细胞体外培养时的生长状态　原代培养时，细胞生长缓慢．１０～１４　ｄ方达到融合　状态，传代后，细胞生长迅速，５～７　ｄ即可达到融合　从　兔ＩＰＥ、ＲＰＥ二者的细胞生长曲线来看，第１天细胞数　的排斥反应及材料来源问题。ＲＰＥ细胞的分离与体外　培养已有２０多年的历史．其技术已臻成熟。而ＩＰＥ细　胞分离则较困难　这是固为ＩＰＥ细胞与虹膜基质形成　牢固的连接，ＩＰＥ细胞之间细胞连接亦较ＲＰＥ细胞之　均略有减少，但ＩＰＥ细胞在第１．８５天、ＲＰＥ细胞在第　２．１天数量分别增加１倍，在第３～６天．细胞生长最为　显著，在第７～１０天二者生长均表现得较为稳定（图　４）。　间更牢固，单纯用胰酶消化时，所需时间较长，消化下　来的细胞连成片状，活性较差；用机械分离的方法所需　时间少，但机械分离对细胞造成的损伤更大，而且细胞　亦多连成片状　］　为此我们采用酶辅助　机械分离法　（ｅｎｚｙｍｅ—ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｍｉｃｒ０ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）获得ＩＰＥ细胞。胶　原酶专门作用于基质，在胶原酶和机械力的共同作用　下，ＩＰＥ细胞从虹膜基质上呈片状脱落，再在胰酶和　２．３兔ＩＰＥ、ＲＰＥ细胞的抗角蛋白免疫细胞化学染　色　显微镜下观察，ＩＰＥ、ＲＰＥ细胞抗角蛋白阳性染色　位于胞浆内，为棕黄色．细网状，在胞浆内的分布欠均　匀，细胞核淡染，呈浅蓝灰色（图５），２种细胞阳性率均　可达１００　。　ＥＤＴＡ的共同作用下，消化成单个细胞，采用此种方　法，收获的细胞数较多且活性较强。　生长曲线是观察细胞系细胞和非建系细胞生长特　性及基本规律的重要方法　本实验中，兔ＩＰＥ细胞体　外培养呈单层生长，呈致密排列的圆形或多角形，细胞　顶部有微绒毛，基底部有内褶，表明细胞具有极性；细　胞染色角蛋白阳性，表明所培养的细胞为纯ＩＰＥ细　胞。传代培养后，细胞生长速度加快，如原代培养兔　ＩＰＥ细胞约需ｌ０ｂ１　５　ｄ才达到融合状态，而第３代仅　需５～７　ｄ　传代过程中细胞内色素逐渐减少，随着细胞　景　传代细胞增大，细胞形态逐渐由圆形或多角形向梭形　转变。兔ＩＰＥ细胞与ＲＰＥ细胞的原代、传代后的细胞　的大小、形态、生长特性并无明显区别，二者在原代培　时　（ｄ）　赫　一器～　ｍ　养后传代，细胞生长迅速，细胞倍增时间仅在２　ｄ左　右，而且保留上皮特性，这就为ＩＰＥ细胞自体移植提　供了较可靠的细胞来源　４参考文献　图４第３捉传代的免１ＰＥ　ＲＰＥ细胞生长曲线　兔１ＰＥ细　胞在第ｌ天略有减步，ＩＰＥ细胞在第１．８ｊ天．ＲＰＥ细胞存　第２　１天数量分别增加１倍．在第３～６天细胞生长最为迅　速ｌ在第Ｔ～１０天，细胞生长壮志较为稳定　Ｆｉｇ．４　Ｇｍｗｔｈ　ｃｕｒｖｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｉｒｄ　ｐａｓｓａｇｅ　ＩＰＥ　ｃｅｌｌｓ　０　ｔ０ｅ　ｒａｂｂｉｔ　Ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｄａｙ　ｔｈｅ￣ｍｏｕｎｔ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ａ　ｌｉｔｔｌｅ　ｌ　ｔｈｅ　１ＰＥ　ａｎｄ　ＲＰＥ　ｃｅｌｌｓ　ｄｏｕｂｌｅ　ａ　Ｎｕｍ　０ｎ１　８５　ｄ　ａｎｄ　２　１　ｄ　ｒ　ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｇｒｏｗｉｎｇ　ｆａｓｔ　ｉｎ　３～６　ｄ．ａｎｄ　ｔｉｍｉｎｔａｉｎｉｎｇ　ｓｔａｂｌｅ　ｌｎ　７～ｌ０　ｄ　３讨论　鉴于ＲＰＥ细胞移植存在的诸多问题，Ｇｏｕｒａｓ　等　于１　９９７年提出用自体ＩＰＥ细胞代替ＲＰＥ细胞移　植到视网膜神经上皮下，以解决ＲＰＥ细胞移植中存在　广株式会社拓普康・中国（封２）　山东正大福瑞达制药有限公司（插页）　美国博士伦眼科手术产品公司（插页）　苏州六六视觉科技股份有限公司　（原苏州医疗器械总厂）（插页）　告目次　美国科　＾激光公司（插页）　温州新视广科技有限公司（插页）　北京高视远望科技有限责任公司（插页）　福州福达光电设备有限公司（插页）　爱尔康（中国　眼科产品有限公司（封３）　重庆泰克医电仪器产业有限公司（封底）