大鼠视网膜M_ller细胞的培养与鉴定

　2007Apr;24(2)

JOURNALOFGUANGXIMEDICALUNIVERSITY

・223・

大鼠视网膜Müller细胞的培养与鉴定3

黄敏丽　陈维平1　何少健1　陈　芳1　罗国容1△

(广西医科大学第一附属医院眼科　南宁　530021)

摘要　目的:仿照前人建立的方法,优化SD大鼠视网膜Müller细胞体外培养的技术和方法,为后续相关研究建立实验室条

件。方法:使用胰蛋白酶消化的方法分离新生SD大鼠视网膜Müller细胞,以DMEM为培养基体外培养,光镜观察。采用电镜观察及荧光免疫组织化学染色的方法进行鉴定。结果:培养的细胞贴壁生长,原代细胞胞体狭长,细胞质丰富,折光性好。电镜下可见特征性的中间丝(直径8～10nm),细胞器丰富;荧光免疫组织化学显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和谷氨酰胺合成酶(GS)阳性。结论:酶消化法培养SD大鼠视网膜Müller细胞是一种稳定、可靠的方法。关键词　视网膜;Müller细胞;细胞培养中国图书资料分类法分类号　R77411

　　视网膜Müller细胞是一种特化的神经胶质细胞,也是视网膜内最主要的胶质细胞,它贯穿整个视网膜,同时具有星形胶质细胞和少突胶质细胞的功能。它不仅具有维持视网膜的正常结构和功能、调节视网膜神经元活动的作用,还可能参与多种病理过程如增殖性玻璃体视网膜病变、增殖性糖尿病视网膜病变,在视网膜的病理、生理过程中起着重要的

[1]

作用。Müller细胞的体外培养技术可为视网膜病变的细胞生物学、发育学和电生理学的研究提供一个重要的平台。在本研究中,我们参考国内外有关文献,在本实验室探索、优化体外培养Müller细胞的技术和方法,为后续研究建立实验室条件,现报告如下。

两遍,剪去眼睑,用弯头镊将眼球取出,过酒精,浸入D2Hanks液中,冲洗3遍,在解剖显微镜下从后极部撕开眼球,分离视网膜,吸取视网膜放于离心管中,加0125%胰蛋白酶,吹打消化10min,150目筛网过滤,然后常温下1000r/min,离心5min,收集细胞沉淀,弃上清,用含20%胎牛血清的DMEM重悬细胞沉淀,吹打分散为单细胞悬液,调整细胞密度按3×105接种于置于50ml培养瓶中。置于37℃、5%CO2的培养箱孵育,细胞贴壁后换液。2～3周后,细胞到80%以上融合,此时可进行消化传代。11212　Müller细胞的传代培养:将瓶内培养液吸出,D2Hanks液冲洗贴壁细胞后,加入0125%的胰蛋白酶115ml,37℃消化约3～5min,当细胞周边收缩,加入含血清的培养液终止消化,轻轻吹打贴壁细胞使之从瓶底脱离,收集细胞悬液,1000r/min,离心5min,弃上清液,用含20%胎牛血清的DMEM吹打重悬细胞,按1∶2传代于培养瓶中,置于37℃、5%CO2的培养箱孵育。11213　Müller细胞的鉴定:细胞传至第三代进行鉴定。在培养皿中预置盖玻片,将要鉴定的细胞消化下来,种于盖玻片上,待传代细胞生长接近融合时取出,用D2Hanks液清洗,4%多聚甲醛固定20min,用011%Triton处理15min,013%H2O2阻断内源性过氧化物酶20min,正常山羊血清封闭20min,加小鼠抗GFAP(稀释度1∶200)或兔抗GS(稀释度1∶1000),对照组加PBS(0101mol/L,pH712),4℃保湿过夜,PBS洗脱,加荧光(Cy3)标记羊抗小鼠IgG,荧光(Cy3)标记羊抗兔IgG作为二抗,PBS洗脱后再加Hoechest染核。荧光倒置相差显微镜下观察、摄片,在可见光下观察细胞,然后关掉可见光,打开荧光光源,在CY3的激发波长下拍摄细胞,再更换为适合Hoechest激发的滤光片,在同一位置、倍数及焦距下拍摄细胞核。11214　透射电镜观察视网膜Müller细胞:要鉴定的细胞经0125%胰酶消化,待细胞变圆、收缩时,从培养瓶壁吹打下来,1000r/min,离心10min。细胞团用215%戊二醛固定,1%锇酸后固定,乙醇、丙酮系列脱水,还氧树脂618包埋,LKB2型超薄切片机(瑞典LKB公司)切片,醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色,日本日立H2500型透射电镜观察、摄片。

1　材料和方法

111　材料

11111　动物:出生第3天的SD大鼠,由广西医科大学实验动物中心提供。

11112　主要试剂:TBD胎牛血清(天津灏洋生物公司);DMEM、0125%胰蛋白酶(GIBCO公司,美国);小鼠抗神经胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidprotein,GFAP)抗体(Sigma公司,美国);兔抗谷氨酰胺合成酶(glutaminesyn2thetase,GS)抗体(Sigma公司,美国);四甲基偶氮唑盐(MTT)(Amresco分装);荧光(Cy3)标记羊抗小鼠IgG,荧光(Cy3)标记羊抗兔IgG(武汉博士德公司);Hoechest染料。11113　仪器:超净工作台(吴江市黄埔空调净化设备有限公司);水平离心机(Eppendorf,德国);CO2恒温培养箱(Ther2mo,Forma公司);倒置相差显微镜(ZEISS,德国)酶标仪(Bio2tek);培养瓶、24孔、96孔培养板(JETBiochemicalInt,加拿大)。112　方法11211　Müller细胞的原代培养:将SD乳鼠用酒精全身擦拭3广西教育厅博士研究生科研创新项目资助(2006105981001D13),广西自然科学基金项目资助(桂科自0640090)

1广西医科大学组织胚胎学教研室

△通讯作者

收稿日期:2006206218

2　结　果

211　视网膜Müller细胞的形态学观察

・224・

21111　倒置相差显微镜:细胞培养过夜后,可见少许细胞贴壁呈伸展状。3d后基本贴壁,胞质丰富,并长出突起,以后突起逐渐增长。约10～14d时呈半融合状态,相邻的细胞连接成网状。此时细胞形态典型:胞体狭长,胞质丰富,两端突起,不呈梭形。约21d时细胞融合,细胞长轴平行排列,有的排列成典型的菊花形。21112　透射电镜:透射电镜显示培养细胞表面有微绒毛,胞质丰富,细胞质细胞器丰富,内含8～10nm的微丝,尚可见线粒体、粗面内质网,溶酶体等细胞器,胞核大、部分细胞可见2个核仁。212　视网膜Müller细胞的鉴定:免疫荧光染色显示大部分细胞GFAP和GS阳性,胞体及突起发出红色荧光,细胞核Hoechest染色阳性,显蓝色荧光,表明为Müller细胞。经鉴定,90%以上为阳性细胞。

广西医科大学学报　2007Apr;24(2)

养效率低,一个月以上才能铺满瓶底;而第一次换液时间改

在第7天时,2、3周即可见细胞铺满瓶底。我们认为其原因可能有二:一是生长代谢活跃的细胞因营养因素逐渐被淘汰;二是可能逐渐形成有利于Müller细胞生长的稳定的微环境,使Müller细胞成为优势细胞。这样,不但提高细胞培养效率,还有利于去除混杂细胞,一定程度上起到纯化细胞的作用。312　Müller细胞鉴定:由于视网膜细胞成分复杂,因此需要鉴定培养出来的细胞是否是Müller细胞。目前Müller细胞的鉴定主要依据其细胞形态的特征及一些免疫组织化学的指标进行[2]。在完整视网膜中,Müller细胞具有特殊的形态如胞体狭长,胞质丰富等,有的排列成典型的菊花形。电镜下可观察到细胞表面有微绒毛,胞质丰富,细胞质细胞器丰富,内含8～10nm的微丝。在细胞培养早期上述结构常无改变,因而可借助光学显微镜进行观察鉴定,但随着传代的增加,Müller细胞典型形态发生改变,此时常需借助电镜对其超微结构的观察,利用透射电镜观察细胞内部结构、测量细胞框架系统是鉴定Müller细胞标志性结构的重要方法[3]。本研究中,我们培养出来的细胞符合上述形态特点。

除了根据细胞结构等进行鉴定外,还可根据特殊的细胞酶学、免疫学特征对Müller细胞加以鉴定。Müller细胞通常被认为是一种存在于视网膜中的特殊星形胶质细胞。GFAP既存在于正常成熟星形胶质细胞中,又见于增生的星形胶质细胞中,随着星形胶质细胞的发育成熟而表达,可作为Müller细胞鉴定标志物之一[4]。本研究中,95%以上细胞为GFAP阳性细胞。但也有作者认为,GFAP不能作为鉴定Müller细胞的标志物,原因是正常情况下Müller细胞中低度表达GFAP,而视网膜中的星形胶质细胞强烈表达GFAP,因此,GFAP阳性难以鉴别培养细胞是星形胶质细胞还是Müller细胞[5]。但目前大多数文献倾向于把GFAP作为鉴定Müller细胞的标志物之一[1,3]。

由于GS仅存在于视网膜的Müller细胞中,因此现在普遍认为GS可作为Müller细胞的特异性标志物[4]。在本研究中,GS免疫组化鉴定原代培养细胞,细胞质发出红色荧光,细胞核显蓝色荧光为阳性细胞,GS鉴定90%以上为阳性细胞。结合光镜、电镜及GFAP观察的结果,可见本实验培养的细胞基本上为Müller细胞,纯度与文献报道一致[4]。

3　讨　论

311　Müller细胞原代培养及纯化:目前Müller细胞的培养方法有组织块悬浮法和酶消化法[2]。组织块悬浮法是指取部分视网膜组织,接种于培养瓶内,待贴壁后,加入营养液,置入培养箱内进行培养,Müller细胞多在4～5d后自组织缘游出。而酶消化法是指使用多种消化酶分解视网膜的基质成分,而将视网膜制成组分细胞悬液,再利用Müller细胞较快贴壁生长的特性,达到纯化培养Müller细胞的目的。本研究中我们采用酶消化法进行Müller细胞的培养。取材是Müller细胞原代培养及纯化成功与否的关键,取材不佳会直接影响到收获细胞的量、杂质的混杂程度。取材尽量选用新生鼠,鼠龄越小,分离出的细胞活力越强;以往的文献报道[2,3],取材的路径都是沿锯齿缘后约1mm处环行剖开眼球,去除晶状体和玻璃体后剥离视网膜,而我们认为从后极部撕开眼巩膜,再轻轻挤压一下,视网膜即可很容易地分离出来,这种取材方法操作上更为简便,大大缩短了取材时间,有利于细胞活力的保持;有文献报道,采用酶消化法时,酶的浓度及消化时间不易掌握[3]。我们认为应用0125%的胰酶胰酶消化视网膜为宜,消化时间不宜过长或太短,以10～15min为宜。尽量采用150目的筛网过滤,以滤去组织块,制成单细胞悬液。制成的单细胞悬液要有一定的密度,在50ml的培养瓶中,约取3只鼠龄3d的SD大鼠视网膜,这样制成的单细胞悬液细胞密度较为合适,约为1×105/ml左右。

SD大鼠的视网膜细胞成分复杂,除主要成分Müller细胞外,还含有星形胶质细胞、血管内皮细胞、周细胞、神经细胞、少突胶质细胞等,由于Müller细胞在细胞比重、贴壁时间、粘着力、细胞寿命等方面与这些细胞有较大差别,因而可通过多种方法纯化Müller细胞,如机械振荡吹打法、速率沉淀法、梯度离心法、毛吸管吸取法[3]。机械振荡吹打法为目前较常用方法,此法是利用Müller细胞较其他细胞贴壁紧这一特点,先震荡培养瓶,而后以吸管反复吹打培养液,使其它细胞悬浮,经更换培养液,达到纯化细胞的目的。我们在本实验中,也是采用这一方法,经过多次传代培养,使细胞纯化,细胞纯度与文献报道一致[4]。另外,我们发现在一定时间内维持微环境的稳定,可使Müller细胞更多增生,成为优势细胞。早期,我们在原代培养2、3d时第一次换液,细胞培

参　考　文　献

1　苟　琳,张作明,许汉鹏.视网膜Müller细胞在视网膜病

变中的作用和研究现状.眼科研究,2003,21(2):2172220.2　刘　瑶.视网膜Müller细胞的培养.国外医学眼科学分册,1995,19(1):43245.3　王越晖,宋　鄂,冷　瀛,等.兔视网膜Müller细胞原代培养.吉林大学学报(医学版),2003,29(3):3672369.4　王　芳,赛　音,贺西格,等.大鼠Müller细胞的体外培养及免疫组织化学鉴定.解剖学杂志,2005,28(5):5992601.5　LupienC,BrennerM,GuerinSL,etal.Expressionof

glialfibrillaryacidicproteininprimaryculturesofhumanMullercells.ExpEyeRes,2004,79(3):4232429.