第4-6章复习题
一、真空题
1、用于PCR反应的耐热聚合酶有（ ）、（ ）、（ ）、 ）、（ ）等。
2、基因工程实验中常用到一些有毒、致癌、致畸试剂，这些试剂有（ ）、（ ）等。
3、根据杂交对象的不同，分子杂交可分为（ ）、（ ）、（ ）。
4、用于电泳分离DNA或RNA的凝胶有（ ）、（ ）可区分1bp的DNA。
5、外源DNA导入宿主的方法有（ ）、（ ）、（ ）等。
二、问答题
1、 核酸电泳的基本原理是什么？主要有哪几种凝胶电泳？各有什么用途？2、什么叫Sanger测序法，简述手动Sanger测序的操作步骤。
）、 ）、 ）、（ （ （ ）其中（ （
3、什么是Southern hybirdization？简述其基本过程？
4、什么是Northern hybirdization？
5、什么是原位杂交？
6、什么是Western hybirdization？
7、什么是探针？如何标记探针？
8、什么是transformation？
9、什么是transduction？
10、简述PCR的基本原理和反应过程？
11、耐热DNA聚合酶的种类和活性？
12、什么是PCR平台效应？
13、什么是寡聚核苷酸芯片？简述其工作原理？
14、试述基因克隆的基本步骤？
15、什么是基因文库、cDNA文库？
16、简述用BAC载体构建基因文库的操作步骤？
17、什么是mRNA丰度
18、简述置换引导法合成cDNA第二链的原理？
19、什么是DNA多态性？
20、RFLP的基本原理？
21、什么是SSR？
22、AFLP的基本原理？
23、什么是RAPD？
24、有两个杂交亲本，其杂交后代为F1，请用所学分子标记的基本原理设计一个实验，鉴定F1代的纯度。
25、什么是差别杂交、什么是扣除杂交？
26、什么是mRNA差异显示法？如何利用mRNA差异显示法筛选目标基因？
27、什么是酵母双杂交体系？
28、基因工程实验中会用到哪些高毒、致癌、致畸试剂？
29、已知某一基因的所表达蛋白质的氨基酸序列，如何克隆到该基因？
30、建立一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆？
31、T cell和B cell 来自于一种前体细胞，且都能识别特异性抗原，但T cell 只能说别表面抗原，其原因是T cell中含有一种由ter基因表达的TCR蛋白。你采用何种方法能克隆到ter基因？
32、在野生的拟南芥中发现一种特抗炭疽病的植株，且抗病性是由单一基因控制的，试问采用何种方法能克隆到此抗炭疽病的基因？
33、基因克隆是如何使含有单个基因的DNA片段得到纯化的？
34、当两种限制性内切酶的作用条件不同时，若进行双酶切，应采取什么措施？为什么？
35、已知某一细菌的一个ORF，但不知其是否有基因产物，试述采用什么方法可验证是否有其基因产物。
36、说明基因芯片的工作原理及其在生物学研究中的意义
37、随机引物标记DNA探针的原理和方法？
38、什么叫PCR？PCR为什么会出现平台现象？
39、已知某一物种的某一基因表达的蛋白质氨基酸序列组成，试述克隆该基因的方法
和具体步骤。
40、试述用YAC构建一种大豆基因组文库的方法。
41、试述用λgt10构建一种大豆花期叶片cDNA文库的方法？
42、下图是Sanger Sequencing PAGE部分电泳结果示意图，试读取碱基系列（5’→3’）并简述测序原理
43、已知水稻某特性由某一个单基因控制，试述用Ac-Ds转座子标签法克隆该基因的原因和方法。
44、禾毂类蛋白质的赖氨酸和色氨酸含量低，现拟用基因工程方式改变禾毂类蛋白质氨基酸不平衡的状态，试述其实验方案。
45、打算将一个cDNA克隆到一个表达载体，以便在E.coli中大量制备相应的蛋白质。这个cDNA的两侧具有BamHI的位点，因此计划将它从BamHI的位点插入载体中。实验
严格地按照克隆手册中的方法进行：载体用BamHI切割后，立即用碱性磷酸酶处理，除去5’磷酸。接着将处理过的载体同用BamHI切割的cDNA片段混合，加入DNA连接酶后进行温育，连接以后，将DNA同已处理过的可以接受DNA的细菌感受态细胞混合。最后，将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因，所以转化的细菌能够存活。实验中同时设置了4个对照： 对照1： 将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上； 对照2： 将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上； 对照3： 将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上； 对照4： 将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用DNA连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。 在进行第一次实验时，感受态细胞不是自己制备的，结果，在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落(表)。在第二次实验中，自己制备感受态细胞，但这一次，所有的平板上都没有菌落生长(表)。接着又进行了第三次实验，这次得到了转化子(表)。从实验平板上挑出12个菌落，分离了质粒DNA，并用BamH I进行切割，其中9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带，另三个克隆中切出一个cDNA片段，实验终于获得成功。
(1)你如何看待第一次的实验结果?对照1的目的是什么?
(2)影响第二次实验结果的原因是什么?对照2的作用何在？
(3)对照3和4各有什么作用?
(4)为什么要用碱性磷酸酶处理载体?
46、打算在细菌中表达一种稀有的人类某种蛋白质，以便能够大量制备这种蛋白。为确保分离纯化，决定将一段6个组氨酸的短肽加到该蛋白质的N端或C端。这些带有组氨酸标签的蛋白质能够紧紧地同Ni2+柱结合，但很容易被EDTA或咪唑溶液洗脱。此法可以一步完成大量蛋白质的纯化。 图1是编码该蛋白的核苷酸序列。请设计一对PCR引物，各含有18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列，另外，在N端有一个起始密码，其后是6个组氨酸密码子。另设计一对引物，能够在C端加上6个组氨酸和一个终止密码。
47、YES(酵母—大肠杆菌穿梭载体)是构建cDNA文库的高效载体，这种载体是λ噬菌体基因组与一个在大肠杆菌和酵母中都能复制的质粒巧妙结合而成，它兼有病毒和质粒载体的优点。 cDNA被插入载体的质粒部分，然后它能在体外被包装入病毒颗粒中，包装起来的载体感染大肠杆菌的效率比质粒本身要高得多。一旦进入了大肠杆菌，λYES中的质粒序列能够被诱导重组出入基因组，并进行独立复制，这就可以从质粒中分离出来，以便进行进一步的遗传操作。为了最大限度地提高克隆效率，载体用只有一个切点的限制性内切核酸酶XhoI (5’C↓TCGAG)进行切割，然后在dTT P存在的情况下，同DNA聚合酶一起进行温育。将一种具有平末端的双链cDNA同一段含由两段寡聚核苷酸组成的双链寡聚核苷酸接头连接起来，这两段寡聚核苷酸的序列是：5’—CGAGATTTACC和5’—GGTAAATC，它们的5’端都是磷酸。然后将载体和cDNA混合并连接在一起。采用这种方法用2μg的载体和0.1μg的cDNA，构建了一个有4×107个克隆的cDNA文库。问:
(1)假定载体长为43kb，cDNA的平均长度是lkb，请估计在连接混合物中，载体分子同cDNA的比例是多少?
(2)在此过程中，载体分子转变成重组体的频率是多少(每对核苷酸的平均分子量是 660Da)?
(3)说明怎样处理载体和cDNA分子，才能把它们连接到一起。处理过的载体本身能自连吗?cDNA呢?
(4)载体和cDNA分子要经过怎样的处理才能提高产生重组DNA分子的效率? (5)能够用XhoI从重组质粒中切出cDNA吗?
48、如何以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆一个编码动物激素的基因，并使之在大肠杆菌中进行表达?简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。
49、一个人类疾病基因被定位在7号染色体一段140kb的区域内，并已分离到此染色体区段的克隆，但是并不知道该基因定位在此区域的哪一位置。可用什么方法找到该基因?
50、种子在储藏过程中发生了某种变化，使得长成的水稻很容易被一种病原菌感染。据推测可能是某一化学诱导的突变导致一个具有抗菌功能的关键酶丢失。请设计一个实验验证这种推测是否正确，如何使种子重新获得对这种病的抗性?
51、从E.coli中分离到一种hemA突变体，这种突变是不可恢复的，并且需要生长在琥珀酸的平板上才能利用6—氨基乙酰丙酸合成血红素。希望利用该突变体去克隆E.coli 的hemA基因。首先用Sau3A部分酶切E.coli的DNA，得到的DNA片段平均为2kb，然后将这些片段从BamH I位点克隆到质粒pBR322中，连接后转化hemA突变体.根据氨苄青霉素抗性来选择重组体。将筛选到的氨苄青霉素抗性克隆重植在加有δ—氨基乙酰丙酸的平板上进行测试。请问：已经测试的Ampr抗性转化子中有多少不再需要在培养基中添加琥珀酸? (E.coli基因组的全长为4500kb)
52、在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子?
53、你在做Southern印迹分析，并且刚完成了凝胶电泳这一步。根据方案，下面一步骤是用NaOH溶液浸泡凝胶，使DNA变性为单链。为了节省时间，你略过了这一步，直接将DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交，最后发现放射自显影片
是空白。错在哪里?
54、为了大量获得许多用于生化鉴定的产物，你想将拟南芥中的一个序列已知、编码单体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达，你如何确保最终能得到产物?
55、假定你分离到一个E.coli的Thy–突变体，并推测有可能是Thy A基因突变。请设计一个方案用PCR从染色体DNA扩增突变的Thy A基因，测定突变的序列。(注：E.coli野生型的Thy A基因的序列是已知的)
56、PCR反应同大肠杆菌体内的DNA复制有哪些不同?你认为根本的差别在哪里？
57、在古生物学中，尚不知道恐龙是否是温血爬行动物，而不像今天的变温爬行动物。 假如你得到一些恐龙的DNA，你如何通过PCR和基因克隆来检测恐龙是否是温血爬行动物?
58、你打算扩增下图所示的两段序列之间的DNA，请从所列出的引物中选出合适的一对？
5’GACCTGTGGAAGC—CATACGGGATTG3’
3’CTGGACACCTTCG—GTATGCCCTAAC 5’
引物1 引物2
5’GACCTGTGGAAGC 5’ CATACGGGATTG
5’CTGGACACCTTCG 5’GTATGCCCTAAC
5’CGAAGGTGTCCAG 5’ GTTAGGGCATAC
5’GCTTCCACCGGTC 5’CAATCCCGTATG
59、假定你从黏质沙雷氏菌中克隆了一个基因，并推测可能是依赖于锌的金属蛋白酶，因为它含有两个组氨酸和一个谷氨酸与锌形成锌指结构。请你设计一个方案，改变其中一个组氨酸看看是否改变蛋白酶的活性?
60、你打算将一个具有末端的DNA片段克隆到具有BamH I 末端的载体中。问题是BamH I和Kpn I的末端是不匹配的，BamH I 是5’突出端，Kpn I则是突出的3’ 端(图)。一位朋友建议用下图所示的寡聚核苷酸“片段”来进行连接。你并没有马上意识到达种方法是可行，因为你想到的连接作用需要邻近的5’磷酸和3’羟基。虽然寡聚核苷酸分子被限制性内切核酸酶切割后会产生合适的末端，但是，合成的寡聚核苷酸的末端都是羟基。另外，虽然下图中接头是及BamH I— Kpn I ，但另一个接头却是Kpn I—BamH I，你怀疑相同的寡聚核苷酸是否能够适合这两种方式的连接。
(1)画出Kpn I—BamH I结合体和所需要的寡聚核苷酸片段的图，这种寡聚核苷酸与下图所示的是否相同?
(2)画出用连接酶处理过的分子图，指明被连接的缺口。
(3)你朋友的图解方法有效吗?
61、一个癌基因，从序列上看似乎编码一个转录因子。当放在细胞中表达时，该基因的产物是完全不溶的，这阻碍了对其功能的直接检测，免疫染色表明，这种蛋白定位于细胞核内，如同推测的一样，是一种转录因子。如果能够测出它所结合的DNA序列，就可以通过现有的序列资料中查找已知基因启动子的天然位点，从而能够找到它所调节的基因。有人建议用PCR扩增同该蛋白结合的微量DNA，思路(下图)是：
(1)合成一组长为26个碱基的随机序列的寡聚核苷酸混合体，在该序列的两侧各有一段25个碱基的序列作为PCR扩增的引物位点(图A)；(2)把这些寡聚核苷酸加到含有转录因子的细胞粗提取物中，转录因子可以同含有结合位点的寡聚核苷酸结合；(3)用转录因子特异的抗体分离同转录因子结合的寡聚核苷酸；(4)用PCR扩增选择到的寡聚核苷酸进行序列分析。按照这一思路，用0.2ng单链随机序列的寡聚核苷酸开始了这项实验，这个寡聚核苷酸可以同一个PCR引物结合成部分双链，经过如图B所示的四轮选择和复制后，用BamHI和EcoRI消化分离到的DNA，将片段克隆到质粒中去，并测定了10个独立的克隆(下表)，问:
(1)转录因子结合的保守序列是什么?
(2)结合的保守序列具有对称性吗?也就是说，具有回文结构吗?据此，能否判断转 录因子是以单体还是以二聚体的形式同DNA结合?
(3)在0.2ng的样品中有多少单链的寡聚核苷酸?(一个核苷酸的平均质量是330Da)。
(4)假定实验开始时所用的寡聚核苷酸混合物中，每一个中心部位的26个核苷酸组成确实是随机的，那么有没有可能所有长14bp的序列都存在于开始的样品中呢？
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