窒息对大鼠肝细胞超微结构和元素分布的影响

维普资讯 http://www.cqvip.com ３８４　ｉ　２【）【）８　Ｍａ＇Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖ　Ｊ　Ｍｅｄ　Ｓｃ　ｕｕｏ　一　ｒ，３５（３）Ｓｅ．复里学报（医学版）窒息对大鼠肝细胞超微结构和元素分布的影响　朱会耕△　叶若兰　方　勇　（复旦大学附属华山医院危重病科上海２０００４０）　【摘要】　目的通过研究窒息动物肝细胞超微结构及其元素含量的变化，探讨窒息引起肝脏损害的发病机制，　ＳＤ大鼠经腹腔麻醉后，经气管插管由人工　为临床抢救窒息患者时对保肝措施予以关注提供科学依据。方法呼吸机维持通气，窒息组在关闭人工呼吸机使呼吸停止３、６、９、１２、１５　ｍｉｎ后取肝脏。窒息一复氧组在呼吸停止　后３、６、９、１２、１５　ｍｉｎ后重新开启呼吸机１２０　ｍｉｎ，再取肝脏。样本经处理后进行透射电镜观察和元素显微分析。　结果大鼠窒息３　ｍｉｎ时肝细胞已出现滑面内质网囊管扩张和线粒体基质变深。窒息６　ｍｉｎ时线粒体肿胀、粗　面内质网脱颗粒。窒息１２　ｍｉｎ时线粒体破坏，核异染色质聚集成团块状。窒息１５　ｍｉｎ时可以出现部分肝细胞　坏死。经过１２０　ｍｉｎ复氧，仅窒息６　ｍｉｎ时线粒体肿胀程度减轻，其余各组均未见改善。窒息后，肝细胞及其线　粒体Ｎａ、Ｋ元素含量明显降低，而ｃｌ、ｃａ元素含量则显著升高；窒息后经过１２０　ｍｉｎ复氧，除ｃａ含量有所恢复　外，Ｎａ、Ｋ、ＣＩ的变化没有改善。结论肝脏在窒息早期即发生细胞结构损伤，窒息后虽然经过及时复氧，但细胞　结构损伤改善有限，窒息引起肝细胞Ｎａ、ＣＩ、Ｋ、Ｃａ浓度的持续变化可能是造成肝脏损伤的原因之一。　【关键词】肝；窒息；超微结构；元素分析　【中图分类号】Ｒ　４５９．７　【文献标识码】Ａ　Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ｅｌｅｍｅｎｔａｌ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｓｐｈｙｘｉａ　ｏｎ　ｌｉｖｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ＺＨＵ　Ｈｕｉ—ｇｅｎｇＡ，ＹＥ　Ｒｕｏ－ｌａｎ，ＦＡＮＧ　Ｙｏｎｇ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｃａｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕａｓｈａｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００４０，Ｃｈｉｎａ）　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ｕｌ—　ｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ　ｏｆ　ｒａｔ　ｌｉｖｅｒ　ｄｕｒｉｎｇ　ａｓｐｈｙｘｉａ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｆｔｅｒ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ　ａｎｄ　ｔｒａｃｈｅａｌ　ｉｎｔｕｂａｔｉｏｎ，ｗｅ　ｓｗｉｔｃｈｅｄ　ｏｆｆ　ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　３，６，９，１２　ａｎｄ　１５　ｍｉｎ　ｉｎ　ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ　ｒｅ—　ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ａｎｄ　ｔｏｏｋ　ｏｕｔ　ｔｈｅ　ｌｉｖｅｒ．Ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｏｆ　ａｓｐｈｙｘｉａ－ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｒｅｖｅｎｔｉｌａｔｅｄ　ｆｏｒ　１２０　ｍｉｎ　ａｆｔｅｒ　ｂｒｅａｔｈ　ｓｔｏｐｐｉｇ　ｂｅｆｏｒｅ　ｔａｋｉｎｇ　ｔｈｅ　ｌｎｉｖｅｒ．Ａｌｌ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｆｏｒ　ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｎ　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ａｎｄ　ｉｏｎｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｐｒｏｂｅ　Ｘ－ｒａｙ　ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｖｅｓｉｃｕｌａ　ｏｆ　ｓｍｏｏｔｈ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｄｉｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｍａｔｒｉｘ　ｄａｒｋｅｎｅｄ　ａｆｔｅｒ　ａｓ—　ｐｈｙｘｉａ　ｆｏｒ　３　ｍｉ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ　ｓｗｅｌｎｌｅｄ　ａｎｄ　ｒｏｕｇｈ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｄｅｇｒａｎｕｌｅｄ　ａｆｔｅｒ　ａｓｐｈｙｘｉａ　ｆｏｒ　６　ｍｉｎ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ａｎｄ　ｂｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ　ａｆｔｅｒ　ａｓｐｈｙｘｉａ　ｆｏｒ　１　２　ｍｉｎ．Ｐａｒｔｉａｌ　ｌｉｖｅｒ　ｃｅｌｌ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ａｐｐｅａｒｅｄ　ａｆｔｅｒ　ａｓｐｈｙｘｉａ　ｆｏｒ　１５　ｍｉｎ．Ａｆｔｅｒ　ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　１２０　ｍｉｎ，ｎｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ—　ｍｅｎｔｓ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｅｘｃｅｐｔ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ　ｓｗｅｌｌｉｎｇ　ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐ　ａｓｐｈｙｘｉａ　ｆｏｒ　６　ｍｉｎ．Ｃｏｎｃｅｎ—　ｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎａ　ａｎｄ　Ｋ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｎｏｔａｂｌｙ　ｗｈｉｌｅ　Ｃａ　ａｎｄ　Ｃｌ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｏｎ　ａｓｐｈｙｘｉａ．Ａｆｔｅｒ　ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　１　２０　ｍｉｎ．ｎｏ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｓｅｅｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎａ，Ｋ，ａｎｄ　Ｃｌ　ｅｘｃｅｐｔ　Ｃａ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｌｉｖｅｒ　ｃｅｌｌ　ｉｎｊｕｒｙ　ｈａｐｐｅｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　ａｓｐｈｙｘｉａ．Ｔｈｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｓ　ｌｉｍｉｔｅｄ　ｅｖｅｎ　ａｆｔｅｒ　ｐｒｏｍｐｔ　ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎａ，Ｃ１，Ｋ　ａｎｄ　Ｃａ　ｍａｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｉｕｒｙ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ａｓｐｈｙｘｉａ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］ｌｉｖｅｒ；　ａｓｐｈｙｘｉａ；　ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｐｒｏｂｅ　ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ　ＬＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ　Ｅ－ｍａｉｌ：ＢＬ２９８８＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ　维普资讯 http://www.cqvip.com 朱会耕，等．窒息对大鼠肝细胞超微结构和元素分布的影响　３８５　在对危重病患者的抢救中，对于窒息导致患者　缺氧而造成病人大脑和肺部等脏器的损害及防治已　有深入探讨［１－３３。然而对于窒息可能造成的肝脏损　ｃｈｅｒｔ，Ａｕｓｔｒｉａ）中冷冻固定，取出后进行冷冻切片　（Ｕｌｔｒａｃｕｔ　Ｅ　ＦＣ－４Ｄ型冷冻超薄片机（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ—　Ｊｕｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ），用ＣＭ１２０透射电镜（Ｐｈｉｌｉｐｓ公司）　定位，ＥＤＡＸ　Ｐｈｏｅｎｉｘ型能谱仪进行电子探针Ｘ．射　线显微分析，分析时采用ＴＥＭ模式，液氮冷阱抗　污染，加速电压８０　ｋＶ，样品台出射角４０。，电子束　害或加重肝脏原发病变的情况，至今少有报道。为　提供窒息造成肝细胞超微结构损伤的实验依据，本　文通过建立大鼠窒息模型，利用透射电镜观察了大　鼠窒息时肝细胞超微结构的改变，同时结合元素Ｘ　射线显微分析技术对窒息以及窒息后恢复氧供的肝　细胞及其线粒体进行元素检测，对窒息引起肝组织　斑直径测线粒体０．１　ｍ、每个动物测试５个线粒　体，测整个细胞散焦全覆盖、每个动物测试５个细　胞，收谱时间２００　Ｓ。经Ｑｕａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　损伤的原因有了进一步的认识，从而为临床抢救窒　息患者时，对保肝措施予以关注提供了科学依据。　材料和方法　试验动物清洁级Ｓｐｒａｇｎｅ　Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）大鼠　３３只（由复旦大学实验动物中心提供），体重２２０　２５０　ｇ。随机分为窒息组（Ａ组，７２＝１５），窒息一复氧　组（Ｂ组，７２＝１５）和对照组（Ｃ组，７２＝３）。　窒息模型的建立大鼠经腹腔注射２　戊巴比　妥钠（４０　ｍｇ／ｋｇ体重）麻醉，固定于不锈钢解剖台　（型号：ＣｒＴＴ．Ｒ，成都仪器厂）颈部剪毛，喉头和胸骨　间正中３　ｃｍ切口，分离气管并作“Ｔ”型切口，插入　硅胶管，接动物人工呼吸机（型号：ＤＨＸ－１５０，成都　仪器厂），潮气量１２　ｍＬ／ｋｇ，频率６０次／ｍｉｎ，吸／呼　比１：３，ＦｉＯ　２１　；通气１５　ｒａｉｎ。各组随即分别不同　处理如下：　窒息组大鼠关闭人工呼吸机使呼吸停止３、６、　９、１２、１５　ｍｉｎ后分别处死３只大鼠取出肝脏。　窒息一复氧组呼吸停止３、６、９、１２、１５　ｒａｉｎ后重　新开启呼吸机１２０　ｍｉｎ，然后分别处死３只大鼠取　出肝脏。　对照组３只大鼠不经呼吸停止直接处死取出　肝脏。　电镜技术电镜样品固定采用２．５　戊二醛和　１　ＯｓＯ４双固定。大鼠处死后，迅速剪下肝脏，切　成小于１　ｍｍ３体积组织块，置２．５　戊二醛电镜固　定液２　ｈ，经０．１　ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液漂洗后，用１　ＯｓＯ　后固定１　ｈ。接着０．１　ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液漂　洗，４℃冰箱内梯度乙醇脱水，至９０　９／６乙醇和９０　丙酮混合液，９０　丙酮，再在１００　丙酮室温下脱水　１５　ｍｉｎ，重复３次。６１８环氧树脂包埋。ＬＫＢ－１型　超薄切片机（瑞典Ｌｅｉｃａ）切片，切片厚度５０　ｎｍ。枸　橼酸铅和醋酸双氧铀染色。ＣＭ１２０透射电镜（Ｐｈｉｌ－　ｉｐｓ公司）观察并照相。　元素ｘ射线显微分析技术　新鲜大鼠肝脏切　成小于１　ｎｌｒｌ－ｉ３体积组织块，快速射入ＫＦ－８０（Ｒｅｉ—　表示。　统计学分析元素分析数据以ｙ－±ｓ表示。采　用ＳＰＳＳ　１１．５软件进行统计分析，组间数据的两两　比较采用ｔ检验，多组间采用Ｏｎｅ—ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ，　Ｐ＜０．０５表示差异有显著统计学意义。　结　果　窒息对大鼠肝细胞超微结构的影响　对照组电镜下可见大鼠肝细胞呈多角形，中　央１～２个圆形核，核仁位于中央或略偏向一侧，核　质较均匀，核膜清晰。细胞质各种细胞器十分丰　富，细长粗面内质网的囊管多组聚集在一起，平行排　列，均匀分布于胞质中，滑面内质网的囊管分枝弯　曲、互相吻合成网，切面上呈小囊泡状。线粒体遍　布，数量多，杆状或卵圆形，基质较深暗，嵴的数量中　等。溶酶体多分布于胆小管或高尔基体附近，微体　也很多，还可见聚集成玫瑰花结状的糖原颗粒（ａ糖　原颗粒）和少量脂滴。其肝窦内皮细胞和库普弗细　胞形态正常。狄斯隙宽约０．２５～２　ｔｔｍ，含少许胶原　原纤维和网状纤维。肝细胞的窦状隙面有许多微绒　毛伸入狄斯隙，有的微绒毛穿过内皮细胞的窗孔。　微绒毛基部的胞质中有许多吞饮泡和含有致密无定　形物质的小泡。相邻肝细胞间胆小管，直径０．５～　１肛ｍ，短小无分枝微绒毛伸入管腔。质膜连接处紧　密连接和桥粒等组成的连接复合体结构清晰可见　（图１）。　窒息组窒息３　ｍｉｎ与对照组相比滑面内质网　的囊管发生扩张。线粒体基质变深，其余结构无明　显差异（图２）。窒息６　ｍｉｎ后，胞质中线粒体肿胀、　嵴模糊缺失，粗面内质网脱颗粒现象严重，部分内　质网形成大泡样结构（图３）。窒息９　ｍｉｎ后进而出　现核异染色质着色深，核周池扩张。胞质内糖原颗　粒减少，窦状隙扩大。窒息１２　ｍｉｎ，许多线粒体破　坏，核异染色质聚集成团块状，核膜不清。胞质电　子密度加深。窒息１５　ｍｉｎ，肝细胞明显肿胀，细胞　３．１定量分析软件包处理。元素浓度单位以ｍｇ／ｋｇ　维普资讯 http://www.cqvip.com 复咀学报(医学版)2008年5月，35(3)器排列异常紊乱区。。出现明显的细胞器聚集区及空白。细胞器聚集区内大量泡状结构细胞膜连续性丧失。肝窦内皮细胞窗孔扩大(图4)。图1对照组大鼠肝细胞超微结构Fig1UilrastructureofratliverinthecontrolgroupI．iver∞11showeclnormalc11Tonatln，nailochon(1ria．HiltlendoplasnlkretiCLIlum图2窒息3min大鼠肝细胞超微结构Fig2Ultrastuctureofratliverafterasphyxiafor3arinVcsiculaofsmoothendoplasmictelkulum【{llatedandmilochondrialmatifxdarkene~l图3窒息6min大鼠肝细胞超微结构Fig3UltrastuclureofratliverafterasphyxiarI．r6minMitochondriadarkenedandroughend01)lasmicrcticulumdegranuled图4窒息15arin大鼠肝细胞超微结构Fig4Ultrastuctureofratliveraflerasphyxiafor15arinI，iverLellrl{、crosisW11hfinestrIjctIIrt󰀀deslrtl(、liOlnat)peared窒息复氧组窒息3min复氧，与窒息组相比滑面内质网的囊管发生扩张、线粒体基质变深程度无差异。窒息6arin复氧后，线粒体肿胀变性程度减轻，粗面内质网脱颗粒现象仍然存在，内质网大泡样结构少见(图5)。窒息9min复氧后核异染色质着色仍有加深。窒息12min和窒息15arin复氧与单纯窒息组相比超微结构无明显改善。图5窒息6min复氧120min大鼠肝细胞超微结构Fig5Ultrastuctureofratliverafterasphyxiafor6arinresuscitationfor120arinMitochondriaswellingaswell∞scollII】lraslri【、t11r(；flmPliOr；11Pd窒息对大鼠肝细胞及其线粒体元素组成的影响Na含量检测窒息后大鼠肝细胞Na含量逐渐下降，窒息6min起差异显著(P<()．05)(表1)。经过复氧12()arin后发现窄息6min组肝细胞Na含量与正常对照组无显著差异(尸>()．05)(表2)，提示肝细胞Na含量恢复，但窒息9、12、15arin组仍然低Na(P<()．01)。维普资讯 http://www.cqvip.com 朱会耕，等．窒息对大鼠肝细胞超微结构和元素分布的影响　３８７　表１窒息后大鼠肝细胞元素含量　Ｔａｂ１Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏｌ￣ｍ　ｏｆ　ｒａｔｌｉｖｅｒ　ａｆｔｅｒ　ａｓｐｈｙｘｉａ　（”Ｐ％０．叭，（２　Ｐ＜Ｏ．０５，＂ＯＳ　ｃｏｎｔｒｏｌ　表３窒息后大鼠肝细胞线粒体元素含量　Ｔａｂ　３　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ　ｏｆ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ　ｉｎ　ｒａｔ　ｌｉｖｅｒ　ａｆｔｅｒ　ａｓｐｈｙｘｉａ　（”Ｐ＜０．叭，（２’Ｐ＜Ｏ．０５，　ｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　表４窒息一复氧后大鼠肝细胞线粒体元素含量　Ｔａｂ　４　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ　ｉｎ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ　ｏｆ　ｒａｔ　ｌｉｖｅｒ　ａｆｔｅｒ　ａｓｐｈｙｘｉａ－ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ　（”Ｐ＜０．叭，（　Ｐ＜Ｏ．０５，＂ＯＳ　ｃｏｎｔｒｏｌ　肝细胞中线粒体的Ｎａ含量窒息９　ｒａｉｎ起降低　Ｃｌ含量检测　窒息后大鼠肝细胞Ｃｌ含量逐渐下　（Ｐ＜０．０５）（表３），复氧１２０　ｒａｉｎ后情况类似　降，窒息６　ｍｉｎ起差异显著（Ｐ＜０．０５）（表１）。经过　（表４）。　复氧１２０　ｍｉｎ后肝细胞高Ｃｌ状态没有改善（表２）。　Ｋ含量检测　窒息后大鼠肝细胞Ｋ含量逐渐　同样，肝细胞中线粒体的Ｃｌ含量窒息后逐渐下　下降，窒息６　ｒａｉｎ起差异显著（Ｐ＜０．０１）（表１）。　降，窒息６　ｒａｉｎ起差异显著（Ｐ＜Ｏ．０５）（表３）。经　经过复氧１２０　ｒａｉｎ后肝细胞低Ｋ没有改善（表２）。　过复氧１２０　ｒａｉｎ后肝细胞中线粒体的高Ｃｌ状态从　肝细胞中线粒体的Ｋ含量窒息６　ｒａｉｎ时突然　窒息３　ｒａｉｎ时即已出现（Ｐ＜Ｏ．０１）（表４）。　升高（Ｐ＜０．０１），９　ｒａｉｎ起明显下降（Ｐ＜０．０１）（表　Ｃａ含量检测窒息后大鼠肝细胞Ｃａ含量逐渐　３）。经过复氧１２０　ｒａｉｎ后发现窒息６　ｒａｉｎ组线粒体　升高，窒息６　ｒａｉｎ起差异显著（Ｐ＜Ｏ．０１）（表１）。　Ｋ含量与正常对照无显著差异（Ｐ＞０．０５），但窒息　经过复氧１２０　ｒａｉｎ后发现与单纯窒息６、９、１２　ｒａｉｎ　９、１２、１５　ｒａｉｎ组仍然低Ｋ（Ｐ＜Ｏ．０１）（表４）。　各组比较，肝细胞高Ｃａ状态显著改善（Ｐ＜Ｏ．０１）　维普资讯 http://www.cqvip.com （表２），虽然窒息１２　ｍｉｎ组Ｃａ含量与正常对照组　相比仍过高（Ｐ＜０．０１）。　肝细胞中线粒体的Ｃａ含量窒息３　ｍｉｎ起大幅　增高（Ｐ＜０．０１）（表３），复氧１２０　ｍｉｎ后窒息３　ｍｉｎ　组有改善（Ｐ＞０．０５），其余时点线粒体仍然高Ｃａ　（表４）。　讨　论　由于肝脏强大的代偿能力，各种致病因子造成　的肝损伤往往无法经由肝功能生化检测早期发现。　就窒息而言，合并肝脏损伤的临床分析多见于新生　儿重度窒息，朱建幸等［４］曾报道１７０例患儿中有２４　例合并肝脏损害（１４．１　），其标准是ＧＰＴ＞４０　Ｕ　／Ｌ。成年患者中，窒息造成肝脏损害更易被忽视，　国内仅有报道是关于ＳＡＲＳ合并症的，陈煜［５］认为　ＳＡＲＳ患者容易并发以转氨酶短暂升高为特点的肝　脏损害，缺氧可能是原因之一。　本研究从形态学上证实细胞超微结构的变化在　窒息３　ｍｉｎ时已经有滑面内质网囊管扩张、线粒体　基质变深。窒息６　ｍｉｎ时线粒体肿胀、粗面内质网　脱颗粒。窒息１２　ｍｉｎ时线粒体破坏，核异染色质聚　集成团块状。窒息１５　ｍｉｎ可以发生部分肝细胞坏　死，提示肝脏同样是窒息早期易受损的重要脏器　之一。　临床上如果患者一般状况良好，窒息可能仅仅　造成一过性肝脏损伤。然而对于重症患者，由于系　统性炎症反应综合征，应激和微循环障碍，高热、营　养不良、热卡不足及高分解状态，抗病毒、抗生素及　其他肝毒性药物的应用等，其肝脏本已不堪重负，如　果合并窒息，可能造成严重后果。　电子探针元素分析利用高能电子束轰击样品微　’小区域，使样品中所含元素发射特定能量的Ｘ＿射　线，通过对Ｘ＿射线能量和强度进行分析，可以确定　待测样品中各元素的组成及其含量［６］。经过对本实　验各组肝细胞及其线粒体的元素分析，发现Ｎａ、Ｋ　元素含量明显降低，而ｃｌ、ｃａ元素含量则显著升高。　目前的研究认为，肝细胞ＡＴＰ缺乏，细胞膜受损，　跨膜Ｃａ　内流，内质网等细胞内Ｃａ库的释放增加，　细胞膜Ｃａ泵排Ｃａ能力和内质网Ｃａ２　Ｍ　－ＡＴＰ　酶摄Ｃａ能力减弱，导致肝细胞内Ｃａ超载，是肝细　胞损伤的关键机制之一［７　］。同时，还有研究认为　如果合并有严重的线粒体Ｃａ超载，可使得肝脏损　伤呈进行性加重［　。本实验证实窒息可同时造成肝　复旦学报（医学版）２００８年５月，３５（３）　细胞及其线粒体Ｃａ超载。唯窒息９　ｍｉｎ以内复氧　后肝细胞Ｃａ超载可以缓解，提示窒息可能先造成　线粒体Ｃａ超载，使细胞内ＡＴＰ合成减少，Ｃａ泵排　Ｃａ　能力和内质网摄Ｃａ２　的能力下降，进而引起　Ｎａ　／Ｃａ　交换逆转，使细胞内质网的Ｃａ２　大量异　常释放伴Ｃａ２　跨膜内流增加。所以造成肝细胞和　线粒体低Ｎａ高Ｃａ。同时低Ｎａ也影响到了Ｎａ　一　Ｋ　ＡＴＰ酶的活性，加上缺氧引起的细胞膜通透性　改变，造成了高Ｋ状态。而高Ｃｌ代表了细胞结构　性损伤。　本实验中大鼠窒息后经过１２０　ｍｉｎ复氧，Ｃａ超　载现象缓解并不明显，Ｎａ、Ｋ、Ｃ１的变化也未见好　转。超微结构同样有一个持续的损伤性改变，说明　窒息对肝脏的损伤在短时间内无法复原，临床上采　取保肝措施是有积极意义的。　综上所述，肝脏在窒息早期即发生细胞结构损　伤，窒息后虽然经过及时复氧，但细胞结构损伤改善　有限，窒息引起肝细胞Ｃａ超载和Ｎａ、Ｃ１、Ｋ浓度持　续变化可能是造成肝脏损伤的原因之一。　参考文献　［１］Ａｃｋｅｒ　Ｔ，Ａｃｋｅｒ　Ｈ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｅｎｓｉｎｇ　ｎｅｅｄ　ｉｎ　ＣＮＳ　ｆｕｎｃ—　ｔｉｏｎ：ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＪＥｘｐ　Ｂｉ—　ｏｌ，２００４，２０７（Ｐｔ　１８）：３　１７１—３　１８８．　［２］Ａａｒｏｎｓｏｎ　ＰＩ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ　ＴＰ，Ｋｎｏｃｋ　ＧＡ，ｅｔ　ａ１．Ｈｙｐｏｘｉｃ　ｐｕｌ—　ｍｏｎａｒｙ　ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ：ｍｅｃｈａｍｓｍｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００６，５７Ｑ（Ｐｔ　１）：５３—５８．　－１３］Ｊａｉｎ　Ｍ，Ｓｚｎａｊｄｅｒ　ＪＩ．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｈｙｐｏｘｉａ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｌｖｅｏｌａｒ　ｅｐｉｔｈｅ—　ｌｉｕｍ［－Ｊ］．ＰｒｏｃＡｍ　Ｔｈｏｒａｃ　Ｓｏｃ，２００５，２（３）：２０２—２０５．　－Ｉ４］朱建幸，周晓苓，朱晓东．新生儿重度窒息器官损害及死亡危　险因素分析ｌ－Ｊ］．中国当代儿科杂志，２００５，７（５）：３８９—３９２．　［５］陈煜，金荣华，梁连春，等．严重急性呼吸综合征并发肝脏损害　的研究初探ｌ－Ｊ］．肝脏，２００３，８（３）：１—３．　Ｉ－６］Ｈａｌｌ　Ｔ八Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｐｒｏｂｅ　Ｘ－ｒａｙ　ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＳｃａｎｎｉｎｇＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．１９８９，３（２）：４６１—４６６．　１－７］张红锋，徐曼艳，王耀发．枸杞多糖对四氯化碳和高糖致损大　鼠肝细胞的作用ｌ－Ｊ］．华东师范大学学报：自然科学版，２００４，　（３）：１２１—１３４．　［８］　张永刚．肝细胞钙超载与肝细胞损伤ｌ－Ｊ］．国外医学：生理病理　科学与临床分册，１９９７，１７（３）：２５３—２５８．　［９］林木生，官晓光，包仕廷，等．Ｌ２精氨酸对大鼠阻塞性黄疸肝　细胞线粒体内Ｃａ　的保护作用及其机制［Ｊ］．中华实验外科　杂志，２００５，２２（２）：１７４—１７５．　（收稿日期：２００７—０８—１５；编辑：王蔚）