3. 组织样品的处理
3.1 组织样品处理
从冰箱中取出肺、脑组织样，解冻，将组织先剪成几大片，剔除组织周围其他杂质成分如血块等，再剪碎，滤纸吸干。
分别称取组织0.2g，按2.5ml.g-1组织加入生理盐水（0.5ml）制成组织匀浆液。在组织匀浆液中再加入萃取剂—乙睛2ml，涡旋2min，3500转高速离心5min，定量吸取上清液2ml（尽可能吸多，但要求所有操作过程取出体积一致），50摄氏度下氮气流下吹干（即得已预处理过的组织干样）冰箱冷冻备用（以保鲜袋分组扎号，注意贴上标签）。
测定时将上述组织干样解冻后，用100ul甲醇溶解，（注意盖上盖子，先转动试管使甲醇浸过吹干前液面）涡旋2min，12000转/分钟离心5min，得到供试液，取上清液20ul进样。
（ug/ml）×所取体积0.1ml÷空白组织质量0.2g） 4. 测定方法建立
4.1色谱条件(该条件要试验，保证内标与待测物峰充分分离，峰形好，出峰时间较短，最好控制在8min以内；可以先参考文献条件，再适当调整)
CTO-20A色谱仪，流动相1%醋酸；检测波长350nm；流速1.0ml.min-1；柱温31摄氏度、；进样量20ul。
4.2 方法专属性（看色谱图有没有干扰测试情况）
空白(灌服0.5%羧甲基纤维素钠)实验鼠组织/血浆处理而得的供试液的色谱图；
空白(灌服0.5%羧甲基纤维素钠)实验鼠组织+标准溶液处理而得的供试液的色谱图；（不需专门去做，取标准曲线中的某个色谱图即可）；
灌服低浓度药液实验鼠组织样供试液；（不需专门去做，取最后低浓度组测定中的某个色谱图即可）；
灌服高浓度药液实验鼠组织样供试液；（不需专门去做，取最后高浓度组测定中的某个色谱图即可）。
4.3 标准曲线（血浆样品另外说明）
试管分别加入0.04、0.1、0.25、0.5、1不同浓度标准溶液（各三份，此浓度
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适合样品测定，从测定样品结果判断，涵盖峰面积最大及最小的样品）各100ul，氮吹挥干溶剂，称取大鼠空白组织（质量与含药组织相同），放入对应试管得到系列浓度含药组织（ug药/g组织），然后按照上述3.1处理，进样20ul，以峰面积A（三份平均）为纵坐标，浓度C（ug药/g组织）为横坐标，进行线性回归，求线性回归方程。相关系数要＞0.99，至少做五个不同浓度 4.4精密度实验和准确度（方法回收率）
试管分别加入低、中、高三个不同浓度标准溶液（此浓度分别为标准曲线的低限、中间、高限值，下同）100ul，氮吹挥干溶剂，称取大鼠空白组织（质量与含药组织相同），放入对应试管，每个浓度平行3份，按照上述3.1处理，进样20ul，于1d内测完3份，求低、中、高3个浓度组织样的日内RSD值。另外分别于第二、三天再同法处理低、中、高浓度各一份，按照上述3.1处理，进样20ul，连同第一天数据，计算三天的低、中、高3个浓度的日间精密度RSD值。 由测定的峰面积（五次平均）比，从标准曲线可以计算得到低、中、高三个浓度测定值C2，准确度表示为：测定值C2/标称值（配制值）（一般100±10%为宜） 4.5稳定性试验
（1）反复冻融的稳定性：试管分别加入低、中、高浓度标准溶液100ul，氮吹挥干溶剂，称取大鼠空白组织（质量与含药组织相同），放入对应试管，每个浓度平行3份，制成3种浓度的质控样（ug药/g组织，标称值），在-20摄氏度条件下存放1d以上，测定时，将三份全部拿出解冻后，将其中一份按照上述3.1处理提取；另两份放回冰柜在-20摄氏度冷冻一天后，将两份全部拿出解冻后，将其中一份按照上述3.1处理提取；另一份放回冰柜在-20摄氏度冷冻一天后，拿出解冻后，将该份按照上述3.1处理提取；三份均进样20ul测定（各两针），计算反复冻融3个循环的稳定性，以准确度表示（上述4.4），并计算相对标准偏差RSD。 （2）样品室温放置：取低、中、高三个浓度工作溶液各100ul，氮吹挥干溶剂，称取大鼠空白组织（质量与含药组织相同），放入对应试管，每个浓度平行3份，制成3种浓度的质控样（ug药/g组织），室温放置4小时，然后按照前面提取方法提取、测定，计算室温放置的稳定性，以准确度表示（上述4.4），并计算相对标准偏差RSD。
（3）萃取后放置的稳定性：按照上述制取低、中、高三个浓度的萃取液（复溶液），室温放置8小时，再测定，计算萃取后放置稳定性，以准确度表示（上述4.4），并计算相对标准偏差RSD。
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（4）组织样品- 20摄氏度冷冻2 周的稳定性：取低、中、高三个浓度工作溶液各100ul，氮吹挥干溶剂，称取大鼠空白组织（质量与含药组织相同），放入对应试管，每个浓度平行3份，制成3种浓度的质控样，每个浓度平行3份，- 20摄氏度冷冻2 周，解冻后，按照前面提取方法提取、测定；计算稳定性，以准确度表示（上述4.4），并计算相对标准偏差RSD。
4.6提取（萃取）回收率试验（不需氮气吹干的提取回收率参考血浆样品） 试管分别加入低、中、高值标准溶液浓度100ul，制成低、中、高3种浓度的质控溶液，氮吹挥干溶剂，称取大鼠空白组织（质量与含药组织相同），放入对应试管，每个浓度平行3份，制成3种浓度的质控样（ug药/g组织），按照上述3.1处理，但此时上清液全部吸出，氮气吹干后，按照上述3.1处理，进样20ul，得面积A（三次平均）
分别取上述低、中、高浓度标准溶液20ul直接进样三次，得峰面积B（三次平均），则
提取（萃取）回收率=A/B×100%
5、样品测定（提取方法确定、色谱条件确定后可以先测样品再做方法的其它内容）
以上述建立的方法、条件对样品测定，每个复溶液进两次，面积取均值（如果两次面积相差太大，要检查原因，考虑进第三针或重做）。根据峰面积，从标准曲线计算求出每克组织含药量。 注意：
1：保证整个过程的条件一致性，这是定量的基础。如，组织重量、内标量、匀浆时生理盐水量，提取甲醇量，第一次离心后吸出量，复溶甲 醇量相等。
2：本次仅以橙皮素为例，涉及的数据仅供参考，各位要根据自己实际
进行适当调整。
3：其它条件如匀浆的充分与否，涡旋均匀条件，氮吹条件等，要一致。 4：注意清洗进样器，避免污染干扰测定。 5：注意安全，用电、机械，关门等
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