食品微生物之水产品中的微生物检验方法研究进展

・卫生研究・　２０１３年３月第５１卷第７期　食品微生物之水产品中的微生物检验方法研究进展　王国琴　河南省平顶山市疾病预防控制中心，河南平顶山４６７０００　【摘要】本文以ＤＮＡ和免疫学为基础，从免疫磁珠分离法、基因芯片检测法、传统的ＰＣＲ技术和定量的ＰＣＲ技　术等角度对水产品中微生物的检测方式进行了简单阐述。　【关键词】水产品；微生物；检测技术　【中图分类号】Ｒ２５４．７　【文献标识码】Ｂ　【文章编号】１６７３－９７０１（２０１３）０７—０１１６一Ｏ２　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｔｅｓｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ａｑｕａｔｉｃ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ｍｉ・　ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｉｎ　ｆｏｏｄ　ＷＡＮＧ　Ｇｕｏｑｉｎ　Ｐｉｎｇｄｉｎｇｓｈａｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｈｅｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｐｉｎｇｄｉｎｇｓｈａｎ　４６７０００，Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｔｈｉｓ　ａｒｔｉｃｌｅ　ｉｎ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｓ　ｔｈｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｆｒｏｍ　ｉｍｍｕｎｅ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｕｓｉｎｇ　ｇｅｎｅ　ｃｈｉｐ　ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ＰＣＲ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｉｎ　ａｑｕａｔｉｃ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｗａｙ　ｂｒｉｅｆｌｙ　ｅｌａｂｏｒａｔｅｄ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ａｑｕａｔｉｃ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　在水产品当中存在着大量的微生物，对人类的身体健　康带来了很大的威胁，会引起腹泻、呕吐、败血症等一系列　病症。微生物对水产品的影响是造成食品安全隐患的首要　灵敏，可以达到逆转录一ＰＣＲ技术与打点杂交相结合的效　果。把水产品当中的李斯特菌通过免疫磁性分离进行作　用，以ＰＣＲ技术为基础，可以产生具有独特效果的李斯特　因素。现在对水产品微生物检测方向主要是对大肠杆菌、　菌落总数和致病菌等研究ｌｌｌ。传统的微生物检测方式以分　离培养、血清试验和生化技术等为主，但是，面临的主要问　菌ＩＭＳ—ＰＣＲ技术，对水产品进行检测。通过使用该种技术　进行检测，我们可以得到如下结论：该方法可以保证食品　基质、杂菌和培养及成分不再对ＰＣＲ检测带来严重性干　扰，并且具有高敏感度、高效率和高准确性的特点。　１．２采用基因芯片检测方式　题是资金使用大、人工劳动多、效率有待提高、特异性较弱　等问题，没能从根本上解决水产品的质量安全，检测力度　没有达到标准要求［２１。随着我国分子生物学技术的不断发　所谓的基因芯片技术就是把每个基因寡核苷酸放在　芯片的表面上。取得微生物样本的ＤＮＡ，经过ＰＣＲ扩增之　展，整体的检测效率有了质的飞跃，主要有检测效率高、针　对性强、准确性有保证等特点，在对水产品微生物检测方　面有着很大的使用前景，并且具有很大的挖掘空间。本文　对水产品中微生物的检测方法做一探讨。　１水产品中微生物的检验方法　１．１采用免疫磁珠的分离方式　后可以使用荧光标记探针．与芯片表面的寡核苷酸进行点　杂交，最后使用精确的扫描仪进行定量并对荧光分布进行　分析，最终确定被检测样品当中是否存在某种微生物（５１。基　因芯片检测方式可以对微生物进行全面、高效和并行的检　测。从数据角度分析，它可以对隐藏的病原体进行检测，使　用一张芯片对某一种病原菌的各项指标进行检测，因此具　有很好的效果。例如：经过混合之后的基因组可以准确地　之所以使用免疫磁珠的分离方式．是因为可以将特异　性的抗体与磁性颗粒的表面进行关联，町以让样品中的微　生物进行特异性的结合，通过外部磁场的影响．装有病毒　的微生物磁性球会在　作川之下向两端靠拢，这样就可以　使微　物从样品当巾脱离　来　，　这种方法较普通检测　式　，　肴很明１．Ｉｌｌ的优势．　・ｌｆ　含有大培细菌的溶液　叶１具有选择性的将微生物分　分辨¨１各种李斯特菌相关联的分离物，美国科学家经过分　析，将单管复合体扩增与基因　片技术埘李斯特菌进行检　测和分辨。使用同定、高效的措施对水产品巾各种微生物　进行获取、处理和分析足我们所期　的。现在，我同虽然　对样品的处理和卡ｆｆ火基　芯片技术有ｒ很大程度的提高．　但是，使州基『大１芯片　式还需要对水产品巾的微生物进行　深入研究，而且要对外部标『伟化程序、资金、设备和条件等　环境进行细致化建设，亟需对这一系列问题给予解决。总　而言之，基　芯片技术还有着很大的发展空间。　１．３采用传统的ＰＣＲ技术　离　来，并且具ｆ『较高的效率．　使　．｝｝ｊ镜检技术和ＰＣＲ等　快速检测方式相互取长补短．免疫磁性分离技术＿ｎ『以将水　产品微生物检测效率大大提高。例如：在创建免疫捕获一　ＲＴ—ＰＣＲ技术的过程中，即首先使用ＩｇＧ抗体将甲型肝炎　病毒吸收到标本之上，之后把该病毒的ＲＮＡ通过逆转录　形成ｃＤＮＡ［４１。使用ＰＣＲ技术进行增长扩充，将传统核酸提　取方式的步骤进行精简。这种方法体现出的优势在于更加　１　１６中国现代医生ＣＨＩＮＡ　ＭＯＤＥＲＮ　ＤＯＣＴ０Ｒ　所谓的ＰＣＲ技术，就是聚合酶链式反应，它是在上个　世纪八十年代首先由美国科学家提出的，是一种可以在体　外快速增长的特定基因，所以，又称之为基因体外扩增技　２０１３　３月第５１卷第７期　・卫生研究・　术。该技术可以在试管中进行，经过数小时的培养，可以使　很少的目标基因增长数十万倍．即把不易检测的皮克单位　扩增到易于检测的微克单位，省去了克隆流程，缩减了大　量的费时程序。现在，ＰＣＲ技术已经具有对微生物病原的　检测、分析、克隆、分离以及序列分析等功能，而且在水产　品微生物检测当中也予以高度的重视。　例如：在辽宁近海地区。大量的海水样品以及贝类中　检测结果．在贻贝的ＤＮＡ中引入两者的基因片段，以此来　完成对目标检测基因的建立，之后使用ＡＢＣ—ＰＣＲ检测方　式，最终表明，这种方法对贝类中隐胞子虫和贾第虫具有　很明显的检测效果。　２结语　综上所述，对水产品中微生物进行安全性检测是极为　重要的研究课题，并且更加趋近于实时、准确。通过微生物　具有甲型肝炎病毒，经过分析研究，使用石英粉滤柱法将　水样品进行浓缩，同时使用ＰＣＲ技术在附近海水中检测　ｍ　ＲＮＡ，最终结果表明，该部分海水中存在ＨＡＶ污染，在　此之后，使用抗原捕捉聚合酶链反应技术对辽宁周边沿海　城市的水产品进行检测，结果为ＲＮＡ阳性　。麻痹性贝毒　是南甲藻类浮游生物分泌出的，对人体神经具有一定的麻　痹作用，也是水产品中毒的主要元ｌｘＪ之一　可以通过建立　ＰＣＲ快速检测Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ属和Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ污染贻贝中的　相关毒素类型方式，结果得ｍ，ＰＣＲ是一种对目标浮游生　自身的遗传因子和免疫系统的特点来判断微生物数量的　ＰＣＲ技术、免疫技术和基因技术等都有着使用范围较广的　价值，实时处理可以更加准确地进行预防和预报。ＰＣＲ技　术极大地提高了检测效果和灵敏度．但在实际操作当中还　是会Ｈ｛现较多的假阳性现象。此外，在外部环境发生极大　变化的时候，会产生相应的连锁反应，是灵敏度等优势下　降的原因。而基因芯片技术弥补了相关不足，但是整体费　用较高，所以，多种方式合理搭配，相信会找到行之有效的　检测途径　物进行有效深入的检测措施。　１．４经过改进的ＰＣＲ技术　新型的ＰＣＲ技术与传统ＰＣＲ技ｌ术具有相同的原理，　【参考文献】　【ｌ１黄玉柳，陈静，黎小正．水产品微生物实验室质量控制探讨…．微　生物学杂志，２０１０．３０（５）：１０８一Ｉ】０．　但是存定量技术等方面原理有所不同。经过改进的ＰＣＲ　技术是使用荧光染料和探针来确保增长的特异性，而且荧　光信号的强与弱直接影响增长产物的多少，以此来确保准　确性ｌ７Ｊ。采取实时荧光逆转录一ＰＣＲ方法是在常规逆转录一　ＰＣＲ检测的基础之上使用荧光探针，摒弃了电泳的使用，　而且不再使用具有致癌作用的溴化乙锭，这样保证了丁作　人员、研究人员以及环境的安全性。而且可以进行实时性　［２】董成娟．微生物学检验的影响　素　－ｊ质量控制…．巾困保健营养：　临床医学学刊，２０１０，１９（４）：２０３—２０４．　［３］李凤霞，吴燕燕，李来好．病原微生物对水产品的污染及其检测控　制方法『Ｃ１．中围水产学会学术年会论文摘要集，２００８，（３）：１６７一ｌ７３．　【４１贾爱荣，孟秀梅，夏雪奎，等．出口水产品中微生物污染调查分析　及限量讨论ＩＪ１．农产品加　１　・学刊，２０１２，（１）：２４—２９．　『５１刘立志，吴锦如，游鹏．娄底市水产品微生物污染的实验室检测与　分析ｌＪ１．实用预防医学，２００９，１６（６）：ｌ８３０－１８３１．　检测，与其他方法（普通逆转录一ＰＣＲ、电镜法）相比，更加　敏感、特异，并且具有可观的速度。例如：根据副溶血性弧　菌的基因为序列设计并合成具有一定特异性的引物和荧　光标记探针时，使用定量一ＰＣＲ技术对虾、鱼片等水产品进　行检测．方法是在其中放入副溶血性弧菌，采用直接定量　的方式检测出的低限是ｌ０　ｃｆｕ，ｇ。通过２４　ｈ的菌类扩增培　养．低限可以达到２　ｃｆｕ／ｇ￣　。　【６１胡鲲，李怡，朱泽闻，等．微生物显色法快速检测水产品中恩诺沙　星残留Ⅲ．上海海洋大学学报，２００９，（４）：４７２—４７８．　【７】张振霖．快速检测水产品中大肠杆菌的新技术研究进展【Ｊ１．中同水　产，２００８，（７）：７８—７９．　ｆ８１林涛，兰敏，黄伟，等．荧光酶免疫分析仪一微生物鉴定仪存水Ｊ　品沙门氏菌检测叶１的应刚『Ｊ１．食　，与发酵Ｔ业，２００８，３４（８）：ｌ３３一　ｌ３６．　在研究的初期，使用的扩增方式是多重嵌套，在软体　动物当中取得ＤＮＡ部分片段，以ＰＣＲ增长之后的片段和　ＤＮＡ序列为基础，分析人类粪便巾的隐贾第虫和孢子虫的　（收稿１　Ｊ期：２Ｏｌ２一ｌ　ｌ一３０）　关键词　天键嗣足为ｒ便ｌｒ编制义献索　ＪＩ、榆索币¨『蒯读　选取的能反映义啦主题慨念的嗣或“ｄ　。小川听ｆｑ发的　何篇沦义须选取４～８个火键测　父键洲鹰尽　从荚　ＮＩ朋的ＭＥＳＨ数批库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／　ｑｕ　ｒｙ．ｈ￣ｇｉ？　ｌ｝　Ｉｌｌｅｓｈ）ｆｌ１选取，其巾义译名可参照叶１旧医学科学院医学信息研究所编译的《医学主题词注释宇　顺表》。未被词表收录的新々业术语（自　词）可直接作为关键浏使用，建议排枉最后。中医药关键词应从中国　中医科学院中医药信息研究所编写的《中医药主题词表》中选取。有英文摘要的文章，应标注与中文对应的英　文关键词。应特别注意首标关键词的选用。该词应反映全文最主要的内容。应注意勿将副主题词当作关键词　歹Ｕ出。　ＣＨｌＮＡ　ＭＯＤＥＲＮ　ＤＯＣＴＯＲ中国现代医生１１７