猴耳环消炎颗粒微生物限度检查法的验证

猴耳环消炎颗粒微生物限度检查法的验证

作者：曹克任 郑鹏

来源：《养生保健指南》2015年第08期

【摘要】目的：建立猴耳环消炎微生物限度检查方法并进行验证。方法：按照《中国药典》2010年版一部的要求，对细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法进行验证。结果：猴耳环消炎颗粒可按常规法进行微生物限度检查。 结论：为能检出药品中被污染的微生物，应对该药品的微生物限度检查进行验证。

【关键词】猴耳环消炎；微生物限度检查；方法验证

猴耳环消炎颗粒由猴耳环干浸膏制成，用于上呼吸道感染、急性咽喉炎、急性扁桃体炎、急性胃肠炎，亦可试用于细菌性痢疾。为保证能检出药品中被污染的微生物，应对检查进行方法验证。

1.试药、仪器与培养基 1.1 试药

猴耳环消炎颗粒（江西杏林白马药业有限公司，批号：20140311） 1.2 仪器

电热恒温培养箱，电子天平，高压蒸汽灭菌器。 1.3 实验用菌种

大肠埃希菌[CMCC〔B〕44 102]、金黄色葡萄球菌[CMCC〔B〕26 003]、枯草芽孢杆菌[CMCC〔B〕63 501]、白色念珠菌[CMCC〔F〕98 001]、黑曲霉[CMCC〔F〕98 003]，以上均为购自山东省食品药品检验研究院的第三代菌种。 1.4 培养基

营养琼脂培养基（1305223），玫瑰红钠培养基（130523），营养肉汤培养基

（1305223），改良马丁培养基（130211），pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液（1303232），北京三药科技开发公司；胆盐乳糖培养基（20130326），MUG培养基（20121126），青岛高科园海博生物技术有限公司。 1.5 供试液制备

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取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。

2.细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证 2.1 菌液制备

取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，34℃培养24小时，取白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，26℃培养24小时，上述培养物用0.9%氯化钠溶液稀释到50-100cfu/ml的菌悬液备用；取黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，26℃培养7天，加入5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释到50-100cfu/ml的孢子悬液备用。 2.2 细菌计数方法验证[1]

2.2.1 试验组 取1：10的供试液1ml注入平皿中，再分别注入1ml 2.1中制备好的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌菌悬液，倾注营养琼脂培养基。

2.2.2 菌液组 各取1ml 2.1中制备好的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌菌悬液，分别注入平皿中，倾注营养琼脂培养基。

2.2.3 供试品对照组取1：10的供试液1ml注入平皿中，倾注营养琼脂培养基。 2.3 霉菌及酵母菌计数方法验证

2.3.1 试验组 取1：10的供试液1ml注入平皿中，再分别注入1ml 2.1中制备好的白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液，倾注玫瑰红钠琼脂培养基。

2.3.2 菌液组 各取1ml 2.1中制备好的白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液，分别注入平皿中，倾注玫瑰红钠琼脂培养基。

2.3.3 供试品对照组 取1：10的供试液1ml注入平皿中，倾注玫瑰红钠琼脂培养基。 各试验菌分别进行3次独立的平行试验，分别计算各试验菌每次实验的回收率。各组计数及试验组的菌数回收率见表1。 82 80

2.4 结果 表1显示5株试验菌株的3次回收率均高于70%，猴耳环消炎颗粒可用常规法进行细菌、霉菌及酵母菌计数。

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3 控制菌检查方法验证[1]

3.1 菌液制备 取大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，34℃培养24小时，上述培养物用0.9%氯化钠溶液稀释到50-100cfu/ml的菌悬液备用。

3.2 供试品组 取1：10供试液10ml接种至100ml胆盐乳糖培养基中， 34℃培养24小时，取上述培养物0.2ml至5mlMUG培养基试管中，于5小时、24小时在366nm紫外光下观察；沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，观察液面颜色。

3.3 试验组 取1：10供试液10ml、3.1中制备好的大肠埃希菌菌悬液1ml（50-100cfu）接种至100ml胆盐乳糖培养基中，方法同3.2。

3.3 阳性对照实验 取3.1中制备好的大肠埃希菌菌悬液1ml（50-100cfu）至100ml胆盐乳糖培养基中，方法同3.2。

3.4 阴性对照实验 取pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液10ml至100ml胆盐乳糖培养基中，方法同3.2。 观察结果见表2

3.5 结果 试验组检出大肠埃希菌，表明猴耳环消炎颗粒可用常规法进行控制菌检查。 4 讨论

通过方法验证，猴耳环消炎颗粒可以采用常规平皿法进行细菌、霉菌和酵母菌计数，可用常规法进行控制菌检查。由于微生物限度检查易受试验条件的影响，中国药典规定要进行方法验证，以确保在检验条件下被污染的微生物能被检出，因此所有药品的微生物限度检查均需进行方法验证，确保所用方法适用于该药品的微生物限度检查。[2] 【参考文献】

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].中国医药科技出版社，2010，附录：附录Ⅷ C 79-88.

[2]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].中国医药科技出版社，2010：351-389.

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