利用Caco-2细胞模型研究新型Pim-1激酶抑制剂KY-C002的表观渗透系数

·２３６·　安徽医科大学学报Ａｃｔａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ　Ａｎｈｕｉ　２０１８　Ｆｅｂ；５３（２）　网络出版时间：２０１８—２—１１　１１：５６　网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０６５．Ｒ．２０１８０２１０．０８３５．０２４．ｈｔｍｌ　◇药学研究◇　利用Ｃａｃｏ．２细胞模型研究　新型Ｐｉｍ－１激酶抑制剂ＫＹ－Ｃ００２的表观渗透系数　马雁，徐绍辉，于坤宏，郭圣荣　摘要　目的利用人结肠癌Ｃａｃｏ．２细胞模型研究新型Ｐｉｍ一　１激酶抑制剂ＫＹ—Ｃ００２的表观渗透系数，为药物制剂设计提　供生物药剂学依据。方法　建立Ｃａｃｏ一２细胞单层模型，通　过细胞形态观察，跨上皮细胞电阻测定和酚红通透性实验验　证Ｃａｃｏ－２细胞单层完整性。考察不同浓度Ｐｉｍ一１激酶抑制　剂ＫＹ—Ｃ００２从绒毛面（ＡＰ侧）到基底面（ＢＬ侧），ＢＬ侧到　ＡＰ侧两个方向的转运情况。应用高效液相色谱法对该化合　物进行定量分析，计算其表观渗透系数（Ｐ…）。结果建立　的Ｃａｃｏ－２细胞单层完整，适用于转运实验。Ｐｉｍ一１激酶抑制　剂ＫＹ—Ｃ００２浓度为５、１０、２０　ｇ／ｍｌ时，Ｐｉｍ一１激酶抑制剂　ＫＹ—Ｃ００２从ＡＰ侧到ＢＬ侧的Ｐ　分别为（４．７２±０．０５）×　１０一　、（５．２９±０．２０）×１０一　、（２．１０±０．４１）×１０一　ｃｍ／ｓ　（Ｐ＜０．０５）；从ＢＬ侧到ＡＰ侧的Ｐ　。分别为（７．５９　４－０．７８）　×１０一　、（１．０８　４－０．０４）×１０一　、（６．２３±０．６３）ｘ１０一。ｃｍ／　（Ｐ＜０．０５）。结论成功构建Ｃａｃｏ－２细胞单层模型并用于　考察Ｐｉｍ．１激酶抑制剂ＫＹ－Ｃ００２的透过细胞单层的性能。　在考察的浓度范围内，无论从ＡＰ侧到ＢＬ侧，还是从ＢＬ侧　到ＡＰ侧，Ｐｉｍ一１激酶抑制剂ＫＹ—Ｃ００２的Ｐ…均与其浓度有　关，浓度为１０　ｍｌ时的Ｐａｐｐ大于５　ｍｌ和２Ｏ　ｒｎＪ时的　Ｐａｐｐ。　关键词　ＫＹ—Ｃ００２；Ｃａｃｏ－２细胞单层模型；表观渗透系数；药　物转运　中图分类号Ｒ　９４　文献标志码Ａ文章编号１０００—１４９２（２０１８）０２—０２３６—０５　ｄｏｉ：１０．１９４０５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎｌ０００—１４９２．２０１８．０２．０１４　原癌基因Ｐｉｍ一１是基因ｐｉｍ家族（现发现ｐｉｍ一　１、ｐｉｍ一２、ｐｉｍ一３）中的一员，Ｐｉｍ－１激酶在调控细胞凋　亡、分化、增殖以及肿瘤形成等方面发挥非常重要的　作用。Ｐｉｍ一１蛋白作为新的抗肿瘤靶点，具有较高　的选择性，近年来越来越被关注　。化合物ＫＹ．　２０１７—１０—３１接收　基金项目：国家自然科学基金（编号：８１５７３３５２）　作者单位：上海交通大学药学院医药用高分子材料及控释用课题组，　上海２００２４０　作者简介：马雁，男，硕士研究生；　郭圣荣，男，博士，教授，博士生导师，责任作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｒ．　ｇｕｏ＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃａ　Ｃ００２（结构见图１）是杂芳基酰胺类化合物。Ｇｅｌ５　Ｊ　首先合成并证实该化合物是一种优良的Ｐｉｍ－１激酶　抑制剂，可用于预防和治疗癌症、自身免疫疾病、过　敏反应等疾病，具有很好的临床应用价值。目前尚　未有关于其生物药剂学性质的研究报道，对于其生　物药剂学性质的研究是十分必要的。Ｃａｃｏ一２细胞系　来源于人类结肠癌细胞，在常规的细胞培养条件下，　即可自发分化形成肠上皮细胞样的细胞，广泛应用　于小分子药物口服吸收的体外筛选模型。。　。该文　采用Ｃａｃｏ．２细胞单层模型研究Ｐｉｍ一１激酶抑制剂　ＫＹ．Ｃ００２的表观渗透系数及药物浓度的影响，为进　一步开展Ｐｉｍ．１激酶抑制剂ＫＹ—Ｃ００２的动物在体　肠吸收以及开发其口服制剂提供有价值的参考。　Ｎ　Ｈ　图１　ＫＹ－Ｃ００２的分子结构图　１材料与方法　１．１　主要仪器高效液相色谱仪购自美国Ｗａｔｅｒｓ　公司；ＢＳＡ１２４Ｓ万分之一电子天平购自北京赛多利　斯科学仪器有限公司；ＫＱ５２００型超声清洗仪购自　昆山市超声仪器有限公司；ＭＱＳ一３０电热恒温水浴摇　床购自上海市曼泉仪器有限公司；８５－２型磁力搅拌　器购自上海司乐仪器有限公司；Ｌ５００型离心机购自　湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；ＨＦ１５１ＵＶ　ＣＯ　培养箱购自香港力康生物医疗科技控股集团；ＪＢ—　ＣＪ—ＩＦＸ超净工作台购自吴江市万里彩钢净化有限　公司；ＸＳＰ．３７ＸＢＷ型倒置显微镜购自上海光学仪器　六厂：Ｍｉｌｌｉｃｅｌ１．ＥＲＳ－２型细胞电阻仪购自美国Ｍｉｌｌｉ—　安徽医科大学学报Ａｃｔａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ　Ａｎｈｕｉ　２０１８　Ｆｅｂ；５３（２）　·２３７·　ｐｏｒｅ公司；Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＭＫ３酶标仪购自芬兰Ｔｈｅｒｍｏ　Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ公司。　１．２主要试剂与细胞化合物ＫＹ．Ｃ００２（自制）；　乙腈（色谱纯，批号：０００００７７５１９）购自美国Ｊ．Ｔ　Ｂａｋ—　ｅｒ公司；三氟乙酸（分析纯，批号：ＳＴＢＦ６９２４Ｖ）购自　美国Ｓｉｇｍａ公司；２４孔聚碳酸酯膜转运板和２５　ｅｍ　细胞培养瓶购自美国Ｃｏｍｉｎｇ　ｃｏｓｔａｒ公司；ＤＭＥＭ培　养基和胎牛血清购自美国Ｇｉｂｃｏ公司；Ｃａｃｏ．２细胞　株购自中科院细胞库。　１．３　ＫＹ－Ｃ００２含量分析的高效液相色谱法（ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）的建立　１．３．１色谱条件色谱柱：Ｃ１８柱（４．６　ｍｍ×２５０　ｍｍ，粒径５　ｍ）；波长３０１　ｎｍ；流速１　ｍｌ／ｍｉｎ；流动　相：Ａ相为０．１％三氟乙酸水溶液，Ｂ相为０．１％三　氟乙酸乙腈溶液；０—８　ｍｉｎ　Ａ相：９５％～５％，Ｂ相：　５％～９５％；８～１０　ｍｉｎ　Ａ相：５％，Ｂ相：９５％相；１０　～１２　ｍｉｎ　Ｂ相：１００％。　１．３．２　ＨＰＬＣ方法的建立从系统适用性、专属　性、重复性、准确度、线性等方面验证ＨＰＬＣ方法。　１．３．３溶液稳定性置于２～８　ｏＣ、室温和３７℃条　件下考察对照品溶液的稳定性。　１．４　Ｃａｃｏ－２细胞单层膜模型的建立和评价　一ｌｌ　１．４．１　细胞培养　细胞培养和种板：复苏冻存的　Ｃａｃｏ－２细胞，加入１Ｏ　ｍｌ完全ＤＭＥＭ．１０培养液，将　得到的细胞悬浮液转移至２５　ｅｍ　细胞培养瓶中，放　入５％ＣＯ　３７　ｏＣ恒温培养箱中培养，隔天换液，当　细胞达到约８０％汇合时进行传代。细胞培养至合　适状态时进行种板，细胞接种到２４孔Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ板，　接种密度６　ｘ　１０　个／ｍｌ。向Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ板的单层膜　基底端（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ　ｓｉｄｅ，ＢＬ侧）加入０．３　ｍｌ完全　ＤＭＥＭ一１０培养液（无细胞），向孔板单层膜顶端（印一　ｉｃａｌ　ｓｉｄｅ，ＡＰ侧）加入０．２　ｍｌ已经充分混合的细胞　悬液。２　ｄ换ＡＰ侧和ＢＬ端侧；３—７　ｄ隔天换ＡＰ　侧和ＢＬ侧液；８～１７　ｄ每天ＡＰ侧换液，隔天ＢＬ侧　换液；１８　ｄ以后每天换ＡＰ侧和ＢＬ侧液。　１．４．２细胞单层模型评价　１．４．２．１显微镜观察Ｃａｃｏ－２细胞形态Ｃａｃｏ一２细　胞在培养至２０　ｄ左右，显微镜下观察细胞生长情　况，观察细胞生长是否均匀，是否可以清楚地看见细　胞之间的接触，以此判断细胞是否形成完整的细胞　单层。　１．４．２．２测量Ｃａｃｏ－２细胞单层膜跨膜电阻将　Ｍｉｌｌｉｃｅｌ１．ＥＲＳ电阻仪电极放人ＰＢＳ（ｐＨ　７．２）内平衡　２４　ｈ，然后置于与培养液类似的无ｃａ　、Ｍｇ“的　Ｈａｎｋ’Ｓ平衡盐溶液内平衡２　ｈ。平衡后将电极置于　７０％乙醇浸泡１５　ｒａｉｎ，再在空气中干燥１５　Ｓ后放入　无菌无Ｃａｎ、Ｍｇ　的Ｈａｎｋ’ｓ平衡盐溶液液中浸泡　１５　ｒａｉｎ，打开电源，校正电压与电阻，测量空白对照　Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ膜的跨膜电阻值，然后测Ｃａｃｏ－２细胞单层　膜跨膜电阻值，样品的实际电阻为样品实测电阻减　去空白电阻值。　１．４．２．３　酚红通透性实验　取电阻值≥２５０　ｅｍ　的Ｃａｃｏ．２细胞单层膜＿ｌ　，用无Ｃａ¨、Ｍｇ　的　Ｈａｎｋ’Ｓ平衡盐溶液小心冲洗３次，轻轻吸干孔内无　Ｃａ“、Ｍｇ　的Ｈａｎｋ’Ｓ平衡盐溶液，以清除细胞表　面对测定有干扰的物质。于Ｃａｃｏ一２细胞ＡＰ侧加入　含５　ｍ＃Ｌ酚红的无Ｃａ“、Ｍｇ　的Ｈａｎｋ’ｓ平衡盐　溶液（ｐＨ　７．２）３００　ｌ，细胞ＢＬ侧加人不含酚红的　无Ｃａ　、Ｍｇｎ的Ｈａｎｋ’ｓ平衡盐溶液４００　ｌ。将培　养板置３７℃、５％ＣＯ，培养箱内，于３０、６０、９０、１２０　ｍｉｎ于ＢＬ侧取样２００　ｌ，并加入２００　ｌ不含酚红　的无Ｃａ　、Ｍｇｎ的Ｈａｎｋ’Ｓ平衡盐溶液。以酶联免　疫荧光分析仪于５６０　ｎｍ处测定Ｃａｃｏ．２细胞单层膜　ＢＬ侧内酚红的累积透过量。计算表观渗透系数　（ａｐｐａｒｅｎｔ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｅｆｉｆｃｉｅｎｔ　Ｐ　ｐｐ），Ｐ　ｐｐ＝（ｄＱ／　ｄｔ）／（ＡＣ０），其中ｄＱ／ｄｔ为单位时间药物转运量　（ｍｇ／ｓ）；Ａ为转运膜的面积，此时Ａ为０．６　ｅｍ　；ＣＯ　为酚红的初始浓度５　ｍｇ／ｍｌ。　１．５化合物ＫＹ－Ｃ００２转运实验将化合物ＫＹ—　Ｃ００２溶解在纯水中配制成１００　ｍｌ储备液，以无　Ｃａ“、Ｍｇ　的Ｈａｎｋ’ｓ平衡盐溶液稀释至所设计浓　度。选取细胞跨膜电阻≥２５０　ｃｍ　的Ｃａｅｏ－２细　胞单层，根据实验设计，分别在细胞两侧加人化合物　ＫＹ－Ｃ００２溶液和无Ｃａ“、Ｍｇ“的Ｈａｎｋ’Ｓ平衡盐溶　液（ＡＰ侧０．３　ｍｌ，ＢＬ侧０．４　ｍ１），与恒温摇床上（３７　，５０　ｒ／ｍｉｎ）温育。化合物溶液的浓度分别为５、　１０、２０　ｇ／ｍｌ。再按实验设计时间点进行取样，单孔　取点，每点平行３个孔。取得的样品溶液过滤之后　按照“ＫＹ—Ｃ００２含量分析的ＨＰＬＣ方法”测定转运　量，计算Ｐａｐｐ和ＢＬ—ＡＰ侧跨膜转运的表观系数与　ＡＰ—ＢＬ侧跨膜转运的表观系数的比值外排率（ｅｆ．　ｌｆｕｘ　ｒａｔｉｏ，ＥＲ）值。　１．６统计学处理实验数据采用ＳＰＳＳ　１６．０软件　分析，数据用　±Ｓ表示，运用ｔ检验进行比较。　２结果　２．１建立ＫＹ．Ｃ００２含量分析的ＨＰＬＣ方法本　文中建立的ＨＰＬＣ方法适用于新型Ｐｉｍ一１激酶抑制　·２３８·　安徽医科大学学报Ａｃｔａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉ．ｓ　Ａｎｈｕｉ　２０１８　Ｆｅｂ；５３（２）　剂ＫＹ—Ｃ００２含量分析。具体结果如下。　２．１．１　系统适用性ＫＹ．Ｃ００２：两份对照品溶液各　Ａ　０　ｌ４　０．１２　连续进样３针，响应因子的ＲＳＤ均为０．２％，均≤　３．０％；两份对照品溶液３针响应因子平均值之比为　９９．３％，在９７．０％～１０３．０％。酚红：两份对照品溶　液各连续进样３针，响应因子的ＲＳＤ分别为０．４％、　０．１％，均≤２．０％；两份对照品溶液３针响应冈子平　均值之比为１００．２％，在９７．０％～１０３．０％。　２．１．２专属性＞１．５。　５　０．１０　Ｓ　０．０８　墨ｏ　０６　０．０４　０．０２　０　００　０　００　１　００　２　００　３　００　４　００　５　００　６　００　７　００　８　００　时Ｍ（ｍｉｎ）　Ｂ　空白溶剂在主峰保留时间处无明　《　显干扰，对照溶液中主峰和邻近峰之间的分离度均　２．１．３重复性ＫＹ—Ｃ００２：平行配制６份供试品溶　褪　鹫　０Ｏ０　ｌ　Ｏ０　２　Ｏ０　３　Ｏ０　４Ｏ０　５．Ｏ０　６　Ｏ０　７．Ｏ０　８　００　液含量的为９９．７％，ＲＳＤ为１．３％，≤３．０％。酚红：　平行配制６份供试品溶液含量的为９９．２％，ＲＳＤ为　．ｔ　懂譬　霞　甍　时Ｉ＇ｔ１］（ｍｉｎ）　峰绡景　Ｉ　鼍ｔ　Ｌ诤　ｌｅ　１．０％，≤３．０％。　ｕ、‘ｉ　　、　一！苷战链　２．１．４准确度ＫＹ—Ｃ００２：４０％浓度的回收率分别　Ｃ　为１０１．５％、１０３．９％、９９．９％；１００％浓度的回收率　分别为９６．７％、１００．２％、１００．７％；２００％浓度的回　０　收率分别为１００．５％、１０１．８％、１０１．６％；在９５．０％　～坦　１０５．０％。酚红：４０％浓度的回收率分别为　堂　９８．１％、９８．０％、９８．４％；１００％浓度的回收率分别为　９９．３％、９９．０％、９７．６％；２００％浓度的回收率分别为　９９．６％、９９．３％、９９．７％；在９５．０％～１０５．０％　２．１．５　线性　ＫＹ—Ｃ００２：对照品溶液在０．２１～　２１．０６　ｇ／ｍｌ范围内线性良好，线性方程为Ｙ＝４７　６９０．５９７　１　一４　９３４．１５３　２．Ｒ＝０．９９９　８，响应因子的　：　时间（ｍｉｎ１　．．结果　Ｉ　匿嘲　ｌ　Ｉ龟ｐｔ耄Ｉ－　ｌ　、“　叫　Ｉｇｌ２２　ｌ　１：Ｉ　：　Ｉ　Ｊ　．６　Ｉ‘ｍ：Ｉ￣２８５５　１．　ＲＳＤ％为１．９％。酚红：对照品溶液在０．４１～４０．５８　ｍｌ范围内线性良好，线性方程为Ｙ＝１５　０３６．１３０　７Ｘ一１７４．７０８　８，Ｒ＝１．０００　０，响应因子的ＲＳＤ％为　０．８％。　图２化合物ＫＹ－Ｃ００２的ＨＰＬＣ色谱图　注：ｔＲ＝７．８７　ｍｉｎ；有侧峰为ＫＹ—Ｃ００２，左侧为酚红；Ａ：空白溶剂　色谱行为图；Ｂ：ＫＹ—Ｃ００２对照品色谱行为罔；Ｃ：细胞样品色谱行为　图　２．１．６溶液稳定性样品溶液保存在２～８℃条件　下，至少１　ｄ内保持稳定；对照品溶液保存在２～８　ｃＩ二条件下，至少Ｉ　ｄ内保持稳定。　２．１．７化合物ＫＹ—Ｃ００２的色谱行为图　见图２。　２．２　Ｃａｃｏ－２细胞单层膜模型的评价　本实验室条　件下建立的Ｃａｃｏ．２细胞单层膜模型可用于化合物　ＫＹ—Ｃ００２的跨膜转运实验。　２．２．１　显微镜观察Ｃａｃｏ．２细胞形态　Ｃａｃｏ－２细胞　在２４孔Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ板上培养２１　ｄ左右，显微镜下观　察细胞生长情况，细胞生长均匀，在细胞之间形成接　触清晰可见的边界线，其形态见图３。　２．２．２　Ｃａｃｏ－２细胞单层膜跨膜电阻　本实验中细　图３培养２０　ｄ显微镜下Ｃａｃｏ－２细胞形态×４０　胞培养至ｌ９　ｄ、２０　ｄ进行电阻测定，连续两天电阻值　为（４５５－４－４０）Ｑ／ｃｍ　，均＞２５０　１）／ｃｍ　。　２．２．３酚红通透性实验取酚红标准试液５　ｍｇ／Ｌ　安徽医科大学学报Ａｃｔａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ　Ａｎｈｕｉ　２０１８　Ｆｅｂ；５３（２）　·２３９·　加入到２４孑Ｌ板的Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ膜中，于不同时间取样　（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ膜接收池），酶标仪测定其吸光度值，通过　酚红标准曲线计算酚红透过量，计算Ｐ　。酚红在　Ｃａｃｏ．２细胞单层膜的Ｐａ，ｐ均＜１０～ｃｍ／ｓ，远低于没　有培养细胞的空白组，说明酚红从ＡＰ侧渗漏入ＢＬ　侧较少，膜的完整性良好。在实验中，也可用肉眼与　空白对照观察有无酚红。见表１。　表１酚红透过试验不同时间的Ｐ　ｐｐ（ｃｍ／ｓ）　２．３化合物ＫＹ．Ｃ００２转运实验不同浓度Ｐｉｍ．１　激酶抑制剂ＫＹ—Ｃ００２的Ｐ…、ＥＲ结果见图４、表２。５　加　　结果表明：①在考察的浓度范围内，ｌ　无论从ＡＰ侧到　４　５　２　ＢＬ侧，还是从ＢＬ侧到ＡＰ侧Ｐ。　均与Ｐｉｍ一１激酶抑　制剂ＫＹ－Ｃ００２的浓度有关，不同浓度问差异有统计　＋一　土　土　０　Ｏ　Ｏ　学意义（Ｐ＜０．０５）；浓度为１０　ｇ／ｍｌ时的Ｐａ加　ｐｐ大于５　ｉ　ｇ／ｍｌ和２０　ｍｌ时的Ｐ　×　×　×　ｐｐｃ②在考察的浓度范　围内，从ＡＰ侧到ＢＬ侧Ｐｉｍ　ｍ　ｍ　ｍ一１激酶抑制剂ＫＹ．Ｃ００２　；　的Ｐ．ｐｐ均＞１０～ｃｍ／ｓ，表明该化合物吸收良好。７　ｌ　６　　吣　土　±　±　Ｏ　Ｏ　Ｏ　＾∞　＾＾　×　×　×　ｍ　ｍ　ｍ　Ｂ　图４不同浓度Ｐｉｍ－１激酶抑制剂ＫＹ－Ｃ００２的Ｐ　ｐｐ　Ａ：ＡＰ俱０—　ＢＬ倾０；Ｂ：ＢＬ倾４—　ＡＰ倾４；与５　ｇ／ｍｌ　ＫＹ－Ｃ００２比　较：　Ｐ＜０．０５；与１０　ｇ／ｍｌ　ＫＹ—Ｃ－００２比较：　Ｐ＜０．０５　表２　Ｐｉｍ·１激酶抑制剂ＫＹ·Ｃ００２的Ｐ　ｐｐ（ｎ＝３，　±ｓ）　浓度　ＡＰ—ＢＬ侧　ＢＬ－－￣ＡＰ　４　（　ｇ／ｍ１）　（ｃｍ／ｓ）　（ｃｍ／ｓ）　ＥＲ值　Ｏ．１６　Ｏ．６１　Ｏ．２５　３讨论　本研究建立了新型Ｐｉｍ．１激酶抑制剂ＫＹ—Ｃ００２　的ＨＰＬＣ色谱检测方法且完成方法学验证，结果表　明该方法简便、灵敏、可靠、专属性良好，符合定量分　析要求。　评估药物口服吸收效果的常用方法是整体动物　实验，而用细胞模型进行体外吸收特性评估具有以　下优点　引：①避免动物的个体差异，体外重现性　好；②克服整体动物吸收代谢耗药量大的缺点，尤　其适于对微量样品的检测；③检测周期较短，可作　为快速药物筛选工具；④可以在分子水平对药物分　子的吸收、代谢和转运进行研究。一般来说，连续２　ｄ测得的电阻值＞２５０　ｃｍ　的Ｃａｃｏ－２细胞单层　膜可用于化合物的跨膜转运实验＿】　，本实验室条件　下建立的Ｃａｃｏ－２细胞模型适用于化合物的转运实　验。　综上所述，在考察浓度范围内，新型Ｐｉｍ一１激酶　抑制剂ＫＹ—Ｃ００２的Ｐ…与浓度有关，化合物ＫＹ．　Ｃ００２的Ｐ…＞１０Ｉ¨ｃｍ／ｓ，表明该化合物的吸收良　好　，具有开发Ｉ＝Ｉ服给药剂型的可能性，为进一步　开展动物体内肠吸收实验提供了参考和基础。　参考文献　［１］　Ｋｕｍａｒ　Ａ，Ｍａｎｄｉｙａｎ　Ｖ，Ｓｕｚｕｋｉ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｃｒｙｓｔａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏ－　ｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｐｉｍｌ：ａ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ａｂｅｒｒａｎｔ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｈｙｐｅｒｍｕｔａ—　ｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｄｉｆｆｕｓｅ　ｌａｒｇｅ　ｃｅｌｌ　ｌｙｍｐｈｏｍａ［Ｊ］．Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２００５，３４８　（１）：１８３—９３．　［２］　Ｍａｇｎｕｓｏｎ　Ｎ　Ｓ，Ｗａｎｇ　ｚ，Ｄｉｎｇ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｗｈｙ　ｔａｒｇｅｔ　ＰＩＭ１　ｆｏｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｆｕｔｕｒｅ　Ｏｎｃｏｌ，２０１０，６（９）：　１４６１—７８．　［３］　郑小洲，金晓磊，赵临襄．小分子ＰＩＭ激酶抑制剂的研究进展　［Ｊ］．中国药物化学杂志，２０１３，２３（６）：４９９—５０５．　［４］刘浩秋．靶向ＰＩＭ蛋白激酶抗肿瘤药物的研究进展及设想　［Ｊ］．中国当代医药，２０１４，２１（２８）：１９１—３．　［５］　Ｇｅ　Ｙｕ．ＰＩＭ　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｕｓｅ　ｔｈｅｒｅｏｆ　ｉｎ　ｄｒｕｇ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ［Ｐ］．ＷＯ，２０１４．　［６］　廖沙，谢剑炜．Ｃａｃｏ－２细胞模型在药物体外研究中的应用　［Ｊ］．中国新药杂志，２００５，１４（４）：４１６—９．　［７］崔孟王句，李敬来，张振清，等．Ｃａｃｏ．２细胞模型在药物制剂学　研究中的应用［Ｊ］．解放军药学学报，２００９，２５（１）：５９—６１，　［８］刘璐，李晓华．仙茅苷在Ｃａｅｏ－２细胞模型中跨膜转运特征　·２４０·　安徽医科大学学报Ａｃｔａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ　Ａｎｈｕｉ　２０１８　Ｆｅｂ；５３（２）　ｂｙ　ＬＣ／ＭＳ［Ｊ］．Ｂｉｏｍｅｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ，２０１４，２８（６）：８８５～９０．　研究［Ｊ］．药学与临床研究，２０１６，２４（６）：４４５—８　［９］　Ｔｉａｎ　Ｘ　Ｊ，Ｙａｎｇ　Ｘ　Ｗ，Ｙａｎｇ　Ｘ，ｅｔ　ａ１．Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｅｒｍｅａ—　［１２］　黄霞，江涛，翟青，等．应用Ｃａｃｏ一２细胞模型观察介质　ｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　３６　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｕｓｉｎｇ　Ｃａｃｏ一２　ｃｅｌｌ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ　ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．ＩＩｌｔ　Ｊ　Ｐｈａｒｍ，２００９，３６７（１—２）：５８—６４．　　Ｎ，Ｔｓａｏ　Ｒ，Ｓｕｉ　Ｚ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｏｆ　ｐｕｒｅ　ｄｉｅｓｔｅｒ－　［１０］　Ｌｉｔｙｐｅ　ａｌｋａｌｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ａｎ　ａｃｏｎｉｔｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｃｒｏｓｓ　ｔｈｅ　Ｃａｃｏ－２　ｃｅ１１　ｍｏｎｏ．　ｐＨ和氨氯地平对替米沙坦跨膜吸收转运的影响［Ｊ］．上海交　通大学学报医学版，２０１２，３２（１２）：１６０５—９．　［１３］　关溯，陈孝，黄民．Ｃａｃｏ一２细胞模型——药物吸收研究　的有效“Ｔ具”［Ｊ］．中国药理学通报，２００４，２０（６）：６０９—１４．　［１４］　沈凯，王景田．药物肠吸收实验研究方法进展［Ｊ］．中国新　１ａｙｅｒ　ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ　Ｍｅｄ，２０１２，７８（７）：６９２—７．　Ｓｕｎ　Ｓ，Ｚｈａｎｇ　Ｈ，Ｓａｎ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｔｒａｎｓｐｏｎ　ｏｆ　ｓｏｐｈｏ—　ｃａｒｐｉｎｅ　ａｃｒｏｓｓ　ｔｈｅ　Ｃａｃｏ－２　ｃｅｌｌ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ　ｎｍｄｅｌ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　药杂志，２００３，１２（１２）：９８８—９１．　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｃｅｌｌ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｅｆｉｃｉｆｅｎｔｓ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　Ｐｉｍ－１　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＫＹ－Ｃ００２　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　Ｃａｃｏ－２　ｃｅｌｌ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ　Ｍａ　Ｙａｎ，Ｘｕ　Ｓｈａｏｈｕｉ，Ｙｕ　Ｋｕｎｈｏｎｇ，ｅｔ　ａｌ　（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏ　Ｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２４０）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｅｆｉｃｉｆｅｎｔｓ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　Ｐｉｍ－－１　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＫＹ－－Ｃ００２　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａ　ｈｕｍａｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ　Ｃａｃｏ一２　ｃｅｌｌ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ　ａ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｈａｒｍａｃｙ　ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　ｆｏｒ—　ｍｕｌａｔｉｏｎ　ｄｅｓｉｇｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃａｃｏ一２　ｃｅｌｌ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ　ｗａｓ　ｂｕｉｌｔ，ａｎｄ　ｉｔｓ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｃｅｌｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏ—　ｇＹ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｈｅｎｏｌ　Ｒｅｄ　Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｔｈｅ　ａｐ—　ｐａｒｅｎｔ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｅｆｉｃｉｆｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｐｉｍ－１　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＫＹ—Ｃ００２　ｆｒｏｍ　ａｐｉｃａｌ　ｓｉｄｅ（ＡＰ　ｓｉｄｅ）ｔｏ　ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ　ｓｉｄｅ　（ＢＬ　ｓｉｄｅ）ｏｒ　ｆｒｏｍ　ＢＬ　ｓｉｄｅ　ｔｏ　ＡＰ　ｓｉｄｅ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＫＹ—Ｃ００２　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅ　ａｐｐａｒｅｎｔ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｅｆｉｃｉｆｅｎｔｓ（Ｐ　ｐｐ）ｗｅｒｅ　ｔｈｅｎ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　Ｃａｅｏ一２　ｃｅｌｌ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ　ｗａｓ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ．Ｔｈｅ　Ｐ…ｖａｌｕｅｓ　ｏｆ　Ｐｉｍ一１　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＫＹ—Ｃ００２　ｗｅｒｅ（４．７２±０．０５）　ｍｌ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　Ｐ　ｐｐ　ｖａｌｕｅｓ　ｏｆ　Ｐｉｍ一１　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　×１０一　ｃｍ／ｓ，（５．２９±０．２０）×１０一　ｃｍ／ｓ，（２．１０±０．４１）×１０一　ｃｍ／ｓ（Ｐ＜０．０５）ｆｒｏｍ　ＡＰ　ｓｉｄｅ　ｔｏ　ＢＬ　ｓｉｄｅ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＫＹ—Ｃ００２　ｗｅｒｅ　５，１０，２０　ＫＹ—Ｃ００２　ｗｅｒｅ（７．５９±０．７８）×１０一。ｃｍ／ｓ，（１．０８±０．０４）ｘ　１０　ｃｍ／ｓ，（６．２３±０．６３）×１０。ｃｍ／ｓ（Ｐ＜　０．０５）ｆｒｏｍ　ＢＬ　ｓｉｄｅ　ｔｏ　ＡＰ　ｓｉｄｅ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＫＹ·Ｃ００２　ｗｅｒｅ　５，１０，２０　ｍｌ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕ－　ｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　Ｃａｃｏ一２　ｃｅｌｌ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ　ｍｏｄｅｌ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｅｒｍｅａｔｅｄ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ　ｏｆ　Ｐｉｍ一１　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＫＹ—Ｃ００２．Ｔｈｅ　Ｐ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｉｍ一１　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＫＹ·Ｃ００２　ｗａｓ　ｒｅ—　ｐｐ　ｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｉｔｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｐ　ｐｐ　ａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　１　０　Ｐ　．　ｍｌ　ｗａｓ　ｇｒｅａｔｅｒ　ｔｈａｎ　５　ｍｌ　ａｎｄ　２０　ｍｌ　ｏｆ　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ＫＹ—Ｃ００２；Ｃａｃｏ一２　ｃｅｌｌ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ　ｍｏｄｅｌ；Ｐ　。。；ｄｒｕｇ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ