枯草芽孢杆菌JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分离纯化

微生物学报ActaMicrobiologicaSinicaVol.44No.4

August2004

枯草芽孢杆菌JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分离纯化

刘 静

1,2

王 军 姚建铭 潘仁瑞 余增亮

1111*

(1中国科学院离子束生物工程学重点实验室 合肥 230031)

(2新疆大学离子束生物工程中心 乌鲁木齐 830046)

摘 要:枯草芽孢杆菌JA分泌物中具有抑菌作用的粗提液通过DEAE-SepharoseFF、SOURCE15PHE、Sephacry1S-200HR和反相HPLC多步柱层析分离纯化后,获得3种对水稻纹枯和小麦赤霉病菌均有抑菌作用的抗菌肽AFP1、AFP2和AFP3。MALDI-TOF质谱法测得其分子量分别为14621645D、14761390D和14901530D。氨基酸组成分析结果表明,AFP1和AFP3由苏氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸等多种氨基酸组成。目标产物热稳定性好、对蛋白酶有一定的耐受性,推断很可能是低分子量的环状脂肽。关键词:枯草芽孢杆菌,分离纯化,抗菌肽

中图分类号:Q936 文献标识码:A 文章编号:0001-6209(2004)04-0511-04

芽孢杆菌能产生多种抗菌物质,其中大部分是多肽,主要抑制革兰氏阳性菌;有些多肽还能抑制革兰氏阴性菌、霉菌和酵母。其中有一些抗菌肽已被应用于治疗人类、动物和植物的疾病,同时也可作为生物表面活性剂、食品防腐剂、饲料添加剂和分子生

[1,2]

物学的研究工具。植物病原真菌是引起植物病害,造成农业损失的主要原因之一;枯草芽孢杆菌能产生多种抑制植物病原真菌的抗菌物质,且对人畜无害,不污染环境,因而在生物防治植物病害中起着重要的作用

[3]

赠;番茄青枯病菌(Tomatobacterialwilt)安徽农业大学惠赠;黄瓜灰霉菌(Botrytiscinerea),黄瓜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)上海生物农药研究所保存。11113 指示菌:黑曲霉(Aspergillusniger),本实验室保存。

112 柱分离材料和分离系统

柱层析填料DEAE-SepharoseFF、SOURCE15PHE和Sephacry1S-200HR均为Pharmacia公司产品,DiamonsilC18柱系Dikma公司产品;所用仪器为LKB层析系统及Waters公司的HPLC。

113 抗菌物粗提液的制备

[10]

将BacillussubtilisJA接种到KMB液体培养基中,30e摇瓶培养(200rPmin)48h后,常温8000rPmin离心30min,弃沉淀。上清液经Millipore公司的Mini_Pellicon切向流超滤系统超滤浓缩后(截留分子量为1000D)6000rPmin离心取上清液,即得到粗提液。

114 粗提液的抑菌活性11411 离体生测试验:管碟法

[12]

TM

。迄今为止,国内外多家实验室通过

分离纯化芽孢杆菌的发酵产物,得到了一些高分子

[4~9]

量蛋白类的抗菌物质和低分子量的抗菌肽

[10,11,13,14]

。本实验室成功分离了一株对多种植物

病原真菌都有抑制作用的JA菌株,并经中国科学院微生物研究所鉴定为枯草芽孢杆菌。我们对JA菌株发酵粗提液部分性质进行了研究,并且分离纯化了粗提液的抗菌物质,研究了纯化产物的部分性质。

1 材料和方法

111 菌株

11111 拮抗菌:枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisJA)为本实验室自行分离。

11112 检测菌:水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani),小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum),西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.niveum),安徽农业大学惠

*

测定粗提液对不同

检测菌的抑菌活性:牛津杯内加入粗提液200LL,以抑菌圈直径表示抑菌活性的大小。

11412 活体生测试验:在一叶期黄瓜幼苗上喷洒粗提液,待粗提液干后将黄瓜灰霉病菌(B.cinerea)和菌核病菌(S.sclerotiorum)的菌丝块(厚011cm,直径为014cm)直接贴在黄瓜叶面中央,处理后的试材置

基金项目:国家攻关项目(2001BA302B-4);安徽省自然科学基金项目(01041401)通讯作者。Tel:86-551-5592189;Fax:86-551-5591310;E-mail:zlyu@ipp.ac.cn

作者简介:刘 静(1974-),女,河南郾凌县人,新疆大学离子束生物工程中心教师,现中国科学院合肥物质研究院等离子体所03级博士,主要从事离子束生物应用研究。E-mail:liujing@ipp.ac.cn收稿日期:2003-09-15,修回日期:2003-12-07512微 生 物 学 报44卷

于21e恒温保湿箱中培养发病,5d后考察各处理的防治效果。该试验由上海生物农药所协助测定。115 粗提液稳定性的测定

11511 热稳定性:将粗提液分别经108e、115e和121e高压灭菌处理,以经孔径为0122Lm的微孔滤膜过滤的样品作为对照,用管碟法测抑菌活性,对照的抑菌活性定为100%。

11512 pH稳定性:通过直接调节粗提液的pH值考察环境酸碱度对抗菌物抑菌活性的影响,以未经酸碱调节的粗提液(pH为710)作为对照,其抑菌活性定为100%。

11513 蛋白酶稳定性:37e水溶条件下,用反应浓度均为1mgPmL的蛋白酶K和胰蛋白酶处理粗提液不同时间,测酶处理液的抑菌活性,以不加酶处理的粗提液作为对照,抑菌活性定为100%。116 抗菌肽的分离纯化

粗提液经阴离子交换柱DEAE-SepharoseFF、疏水柱SOURCE15PHE、分子筛柱Sephacry1S-200HR和反相C18柱多步分离纯化,得到几个对黑曲霉、小麦赤霉病菌和水稻纹枯病菌均有抑制作用的活性组份,将得到的活性成分冷冻干燥后进一步分析。117 抗菌肽分子量的测定

抗菌肽的分子量用两种不同的方法测定:首先用不连续的SDS-PAGE法,分离胶浓度为14%,浓缩胶的浓度为5%,SDS的浓度为011%,电泳后用考马斯亮兰染色;其次用MALDI-TOF质谱法进行抗菌肽分子量精确地测定,由中国科学技术大学生命科学实验中心采用BIFLEXTMIII型MALDI-TOF协助测定。

118 抗菌肽氨基酸组成的分析

分离纯化得到的样品冻干后由中国医学科学院药物研究所采用日立L-8500氨基酸分析仪协助测定。

120min后抑菌活性也仅下降25%;由此表明粗提液中的抗菌物具有较好的热稳定性;对不同酸碱度的试验表明抗菌物的最适pH范围是610~715,当pH

<515或者pH>910时抑菌活性有明显的降低;粗提液用两种蛋白酶处理不同时间后,抑菌活性降低不明显,说明粗提液对蛋白酶K、胰蛋白酶具有一定的耐受性。

213 抗菌肽的分离纯化

21311 DEAE-SepharoseFF柱层析:将粗提液用A缓冲液(20mmolPLpH618磷酸盐缓冲液)充分透析,8000rPmin离心取上清液,过A缓冲液平衡的DEAE-SepharoseFF阴离子交换柱,用含0102~110molPL(NH4)2SO4的A缓冲液进行线性梯度洗脱,收集对黑曲霉、小麦赤霉病菌和水稻纹枯病菌均有抑菌作用的活性峰,并将收集的活性洗脱液经Millipore公司的StirredCells8050超滤杯浓缩后(截留分子量为1kD)用含110molPL(NH4)2SO4的A缓冲液充分透析。21312 SOURCE15PHE柱层析:将阴离子柱收集的活性组份上A缓冲液预平衡过的SOURCE15PHE柱,A缓冲液淋洗至基线,再用含0102~1100molPL(NH4)2SO4的A缓冲液进行线性梯度洗脱,最后用蒸馏水洗脱得到3个活性峰,收集合并后浓缩。21313 Sephacry1S-200HR柱层析:浓缩后的样品过含015molPL(NH4)2SO4的A缓冲液预平衡的分子筛Sephacry1S-200HR柱,然后以同样的缓冲液洗脱,得到两个洗脱峰,收集活性峰样品浓缩,再经Mill-iQ水充分透析。

21314 反相HPLC分离:100%乙腈(011%TFA)平衡C18柱,将经分子筛后收集的活性组份上柱,用30%~80%乙腈(011%TFA)进行线性梯度洗脱,收集到若干分子量在1000D至1500D左右的多肽,在乙腈浓度达到50%左右时得到3种有活性的目标纯化产物(图1)。收集抗菌肽AFP1、AFP2和AFP3,冷冻干燥后得到白色粉末状的固体。

2 结果

211 粗提液抑菌活性

离体生测试验结果表明粗提液对水稻纹枯病

菌、小麦赤霉病菌、西瓜枯萎病菌和番茄青枯病菌有强烈的抑制作用;活体生测试验显示粗提液对黄瓜灰霉和菌核病菌有强烈的抑菌作用,同时对红蜘蛛有杀虫效应。212 粗提液的稳定性

粗提液经108e、115e和121e分别处理10min,其抑菌活性均没有降低,即使121e处理图1 抗菌肽的RP-HPLC上的分离

Fig.1 PurificationofantimicrobialpeptidesonRP-HPLCcolumn

4期刘 静等:枯草芽孢杆菌JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分离纯化513

214 抗菌肽分子量的测定

用SDS-PAGE测得抗菌肽的分子量在10kD左右;经MALDI-TOF质谱法测定,3种主要的抗菌肽AFP1、AFP2和AFP3均为单一组份,分子量分别为14621645D、14761390D和14901530D。215 抗菌肽抑菌活性的测定

管碟法试验结果表明3种抗菌肽对水稻纹枯病菌和小麦赤霉病菌都有抑制作用(图2)。

包括Eleines,Bacitracins及Gramicidins等,具有线状或环状结构,它们分子量小,热稳定性好,含有D-氨基酸,能耐受蛋白酶的水解作用。对枯草芽孢杆菌JA粗提液性质的研究表明该抗菌物热稳定好且对蛋白酶K和胰蛋白酶都有一定的耐受性,这与抗菌肽分子量小和它可能有环状结构有关。

据已知的芽孢杆菌产生的抗菌肽如1973年Peypoux报道的Iturin到的Fengycin

[14,15]

[13]

[2]

;1986年Deleu分离纯化得

等,它们都是有环肽结构的脂肽,

其家族中的抗菌肽除了氨基酸组成的微小差别外,它们的脂肪烃侧链的长度也存在较大的变化,从JA菌株发酵液提纯得到的抗菌肽AFP1、AFP2和AFP3其分子量大小相差14D或28D,正好相当于一个或

图2 3种抗菌肽对试验菌的抑菌活性

Fig.2 Inhibitoryactivityofantimicrobialpeptidesagainstthetestmicro-organisms

A.Rhizoctoniasolani;B.Fusariumgraminearum.

两个亚甲基的分子量,因此推断它们可能属于这一类的抗菌肽,因而AFP2的氨基酸组成很可能与AFP1和AFP3相似。

抗菌肽AFP1、AFP2和AFP3经SOURCE15PHE柱层析时,当用蒸馏水洗脱时才得到活性组份,再用反相HPLC分离目标产物,乙腈达到大约50%抗菌肽才能被洗脱,说明抗菌肽具有强疏水性。推断它们的强疏水性与可能存在脂链有关。SDS-PAGE测定的分子量高于MALDI-TOF的测定结果,推测可能脂肽侧链的存在影响mPz从而影响抗菌肽电泳时的迁移率,所以测得的分子量偏大。得到的3个抗菌肽在测定用的3种检测菌的抑菌试验中均有抑菌活性,它们的分子量均为1400D以上且含有10个氨基酸与FengycinA与FengycinB在分子量和氨基酸组成上十分相似,但是理化性质不尽相同,如3个抗菌肽的水溶性都非常好,文献报道的Fengycin定,以确定是否是新的抗菌肽。

某些抗菌肽对许多危害严重的病原真菌都表现出很强的抑菌活性,在农牧业中有很好的应用前景;另外抗菌肽能够在细菌质膜上形成离子通道,破坏膜势,引起胞内物质泄漏,从而杀死细菌,一般不易产生耐药性和交叉抗性,很可能成为新药的来源。本实验室从JA菌株分离纯化得到的抗菌肽对多种植物病原真菌有强抑制作用,并且对某些植物细菌和人类致病真菌也有抑制作用,相关实验正在研究中。

致谢 感谢安徽大学生命科学院肖亚中教授给予了支持和悉心指导。[14]

216 氨基酸组成分析

样品经6molPLHCl于110e氮气保护下水解24h,采用日立L-8500氨基酸分析仪分析。结果表明分子量相差28D的AFP1和AFP3在氨基酸组成上相近(表1),氨基酸组成分析表明AFP1由1个Ala,1个Ile,1个Pro,1个Thr,3个Glx(Glu或Gln),2个Tyr和1个可能存在的Orn组成,而AFP3是Ala由Val代替,也含有10个氨基酸。AFP2提取的样品较少,尚未作氨基酸组成分析;AFP1和AFP3两者的区别只是Val与Ala的不同。

表1 抗菌肽AFP1与AFP3的氨基酸组成

Table1 AminoacidcompositionofantimicrobialpeptidesAFP1andAFP3Aminoacid

ThrGlx(GluorGln)

IleTyrProValAla0Orn

10118

ItmaybeOrnItmaybeOrn

at24162minat24157min

81771916010181

8165181541014310151

2100(1)4147(2)2147(1)

02132(1)

2100(1)4129(2)2141(1)2123(1)

ContentPmol%AFP11016734183

AFP3916933159

No.ofresiduesAFP12143(1)7195(3)

AFP32124(1)7177(3)

不溶于

水。有关抗菌肽脂肪酸部分的结构有待进一步的测

3 讨论

芽孢杆菌能产生多肽类的抗生素,这些抗菌肽514微 生 物 学 报

[8]

44卷

谢 栋,彭 憬,王津红,等.枯草芽孢杆菌抗菌蛋白X98Ó的纯化与性质.微生物学报,1998:38(1):13-191

童有仁,马志超,陈卫良,等.枯草芽孢杆菌B034拮抗蛋白的分离纯化及特性分析.微生物学报,1999,39(4):339-3431裴 炎,李先碧,彭红卫,等.抗真菌多肽APS_1的分离纯化与特性.微生物学报,1999,39(4):344-491

刘 颖,徐 庆,陈章良.抗真菌肽LP-1的分离纯化及特性分析.微生物学报,1999,39(5):441-4471

徐积恩,朱明珍.抗生素,北京:科学出版社,1982,1521PeypouxF,GuinandM,MichelG,etal.StructureofiturinA,anantibioticfromBacillussubtilis.Biochemistry,1978,17(19):3992-39961

参

[1][2]

考文献

[9][10][11][12][13]

BoDnszkyM,PerlmanD.PeptideAntibiotics.Science,1969,163:352-3581

BullaLAJr,HochJA.BiologyoftheBacilli.In:DemainAL,SolomnNA.ed.Biologyofindustrialmicroorganisms.1985,57-781

[3][4][5][6]

喻子牛主编.微生物农药及其产业化.北京:科学出版社,2000,1-111

刘伊强,王雅平,潘乃,等.拮抗菌TG26的鉴定及其抗菌蛋白BÑ的纯化和部分特性.植物学报,1994,36(3):197-2031刘进元,潘乃

,陈章良.抗菌蛋白LCÒB的纯化及性质.微

生物学报,1993,33(4):268-273

林 东,徐 庆,刘忆舟,等.枯草芽孢杆菌SO113分泌蛋白的抑菌作用及抗菌蛋白的分离纯化.农业生物技术学报,2001,9(1):77-801

[14]VanittanakomN,LoefflerW,KochU,etal.Fengycin)AnovelantifungallipopeptideantibioticproducedbyBacillusubtilisF-29-31JAntibiotics,1986,39(7):888-9011

[15]DeleuM,RazafindralamboH,PopineauY,etal.ColloidssurfacesA.PhysicochemEngAspects,1999,152:3-101

[7]胡 剑,赵永岐,王岳五.枯草杆菌BS-98分泌的抗真菌蛋白的分离纯化及其部分性质的研究.微生物学通报,1997,24(1):3-71

PropertiesofTheCrudeExtractofBacillussubtilisand

PurificationofAntimicrobialPeptides

LIUJing WANGJun YAOJian-Ming PANRen-Rui YUZeng-Liang

*

(KeyLaboratoryofIonBeamBioengineering,ChineseAcademyofSciences,Hefei 230031,China)

Abstract:Threetypesofantimicrobialpeptides,namedAFP1、AFP2andAFP3,whichallhadstronginhibitoryactivity

againstRhizoctoniasolaniandFusariumgraminearumwerepurifiedfromthecrudeextractofBacillussubtilisJA.Theirmolecularweightswere14621645D,14761390Dand14901530Drespectively,determinedbyMALDI-TOFmassspec-trometry.Theaminoacidcompositionsofthetwoantimicrobialpeptideswereanalyzedandtheresultsshowedthatthepu-rifiedmaterialswerecomposedofThr,Ile,Pro,Val,Glx(GluorGln)andsoon.Thepeptideswerefoundtobether-mostableandpartialresistedproteinases.Itappearedthatthepeptidesmaybecycliclipopetides.Keywords:BacillussubilisJA,Purification,Antibacterialpeptide

Foundationitem:NationalKeyTechnologiesR&DProgramofChina(2001BA302B-4);NaturalScienceFoundationofAnhuiProvince(01041401)

*

Correspondingauthor.Tel:86-551-5592189;Fax:86-551-5591310;E-mail:zlyu@ipp.ac.cn

Receiveddate:09_15_2003

5微生物学报6综述文章投稿说明

我刊一些综述类来稿存在一些问题,主要表现为:篇幅庞大,罗列文献,内容空泛,缺乏观点。为使此栏目更加新颖并更具可读性,特提出几点说明,欢迎大家根据要求,踊跃投稿,并提出你们对该栏目的建议和想法。

1.本刊主要刊登微型综述(Minireview),来稿字数最好控制在5000字以内(不包括参考文献)。2.综述的选题要有新意,对读者及同行确有一定的启发作用和参考价值。3.参考文献应控制在40篇以内,近3年发表的文献不少于10篇。

4.应结合文献扼要评述国内外学者在本领域的研究进展,不要泛泛罗列文献,只述不评。5.应结合自己的研究工作,就该研究领域存在的问题和解决的途径提出自己的观点。6.欢迎投送/能够反映国际研究热点、对学科发展有指导意义0的述评类文章。