(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 108977557 A(43)申请公布日 2018.12.11
(21)申请号 201810959071.2(22)申请日 2018.08.22(83)生物保藏信息
CGMCC NO.12342 2016.04.11
(71)申请人 南京农业大学
地址 210043 江苏省南京市栖霞区八卦洲
街道江苏省栖霞现代农业产业园区南京农业大学现代园艺产业科技创新中心(72)发明人 沈其荣 张扬 李荣 张楠
朱成之 刘红军 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任
公司 32218
代理人 傅婷婷 徐冬涛
权利要求书1页 说明书8页序列表5页 附图4页
(51)Int.Cl.
C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/686(2018.01)C12Q 1/04(2006.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/07(2006.01)
CN 108977557 A(54)发明名称
甲基营养型芽孢杆菌菌种特异性定量PCR引物及其设计方法(57)摘要
本发明公开了甲基营养型芽孢杆菌菌种特异性定量PCR引物及其设计方法。本发明首先将甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9全基因组序列在
选出没有匹NCBI和EzTaxon数据库中进行比对，
配的大于500bp的基因组片段，再利用Oligo 6软件进行引物序列设计，设定产物大小为70-250bp，引物长度为22±2bp，最后通过与同属不同种菌株依次交叉进行扩增特异性检验，土壤添加NJAU-Z9进行扩增特异性再检测，并结合盆栽土壤实际检测等步骤，筛选出一对最优的甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9定量PCR引物。本发明的引物设计方法和设计的菌株特异性引物能够为其他菌株的定量PCR特异性引物设计和甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9的定量提供方法。
CN 108977557 A
权 利 要 求 书
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1.甲基营养型芽孢杆菌菌种特异性定量PCR引物的设计方法；其特征在于包括如下步骤：
(1)将菌株NJAU-Z9全基因组序列在NCBI和EzTaxon数据库中进行比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段；
(2)利用Oligo 6软件进行引物序列设计，设定产物大小为70-250bp，引物长度为22物长度bp，共设计8对引物；
(3)通过与同属不同种菌株依次交叉进行扩增特异性检验，土壤添加NJAU-Z9进行扩增特异性再检测，并结合盆栽土壤实际检测等步骤，筛选出两对最优的甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9定量PCR引物。
2.按照权利要求1所述的方法设计的甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9定量PCR特异性引物，其特征在于两对引物序列如下：P3：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；P4：SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。
3.权利要求2所述的甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9定量PCR特异性引物中的任意一对在制备甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9定量PCR试剂盒中的应用。
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说 明 书
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甲基营养型芽孢杆菌菌种特异性定量PCR引物及其设计方法
技术领域
[0001]本发明属于农业微生物领域，涉及对一株具促生和抗病能力甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9的定量PCR特异扩增引物的设计及应用。
背景技术
[0002]促进植物生长和抗病的研究中，已经将大量有益微生物菌剂接种到土壤和根际或与有机肥料结合作为土壤改良剂接种至土壤。然而，功能菌株在土壤和根际环境中的存活在其功能发挥上起着关键作用，因此，有效的定殖是功能菌株促进植物生长和改良土壤微生物生态系统的前提。
[0003]选择性培养基涂布已经被广泛用来检测或分离环境中的目标微生物，然而，该方法灵敏度较低且耗时，并且对于形态上相似度高的菌种难以准确识别。当前，不依赖于培养的检测方法也被广泛使用，然而，这些方法大多基于16S rRNA基因，但检测水平只能在属和物种水平上提供高度接近的结果，并不足以针对菌株水平的特异检测。基于DNA的定量PCR(qPCR)技术可以准确定量土壤中多种微生物的丰度，已成为当前分子微生物学及微生物生态学研究中的关键技术，其方法主要利用特异引物扩增特异DNA片段，再进一步计算拷贝数，因此，引物设计是qPCR中至关重要的一环。目前常用的引物设计必须首先寻找到具有特异性的序列，通常的做法是，从文献中获取物种特异性基因，并根据其保守性确定其实用性，然而，从文献中获得的所谓“物种特异性基因”往往信息比较滞后，并未基于不断增长的基因组数据进行必要的更新，导致获得的引物在实际应用中不一定能确保其特异性。[0004]近些年来，全基因组测序已成为研究生物体综合信息的快速且经济有效的方法。基因组序列可提供菌种最高分辨率的遗传信息，且能够通过其与数据库的比对，获得菌株特异性遗传标记。本发明提出一种基于一株多功能根际促生菌株甲基营养型芽孢杆菌的全基因组序列(WGS)与全权威数据库比对，获得该菌株特异性基因片段区域，并开发出其特异性定量PCR引物的设计方案。进而利用此特异性引物，开发出了该菌株的定量PCR方法，并利用本发明有效探究了甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9在植物根系的动态变化，以揭示其在农业生产实践的潜在促生机制。
发明内容
[0005]本发明旨在针对现有实时定量PCR特异性引物设计技术的局限，提供一种基于全基因组上的特异性片段设计菌株特异性定量PCR引物的方法。
[0006]本发明同时提供了甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9的菌株特异性定量PCR引物。[0007]本发明同时还提供了甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9的定量PCR方法。[0008]一株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)NJAU-Z9(该菌株通过16S rRNA序列鉴定分析为甲基营养型芽孢杆菌，通过基因组比对为B.methylotrophicus同义词B.velezensis，在此我们依然保留16S rRNA序列鉴定分析命名甲基营养型芽孢杆菌)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月11日，保藏
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说 明 书
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编号为CGMCC NO.12342。
[0009]全基因组序列比对设计甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9定量PCR特异性引物的方法包括如下步骤：[0010](1)将菌株NJAU-Z9全基因组序列在NCBI和EzTaxon数据库中进行比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段。[0011](2)利用Oligo 6软件进行引物序列设计，设定产物大小为70-250bp，引物长度为22±2bp，共设计8对引物。[0012](3)通过与同属不同种菌株依次交叉进行扩增特异性检验，土壤添加NJAU-Z9进行扩增特异性再检测，并结合盆栽土壤实际检测等步骤，筛选出如下一对最优的甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9定量PCR引物；P4：Z9-4F:GTGGTAGTAACGCTATTGAA和Z9-4R：AAGTAACCTCTTTACCCACA。
[0013]按照所述的方法设计的甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9定量PCR特异性引物，其特征在于引物序列如下：P4：Z9-4F:GTGGTAGTAACGCTATTGAA(SEQ ID NO.9)和Z9-4R：AAGTAACCTCTTTACCCACA(SEQ ID NO.10)；P3：Z9-3F:GTGGTAGTAACGCTATTGAA(SEQ ID NO.7)和Z9-3:
[0014]CCTCTTTACCCACAACTGCA(SEQ ID NO.8)。
[0015]本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9定量PCR特异性引物中的任意一对在制备甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9定量PCR试剂盒中的应用。[0016]有益效果
[0017]本发明的引物设计方法和设计的菌株特异性引物能够为其他菌株的定量PCR特异性引物设计和甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9的定量提供方法，该方法设计的一对引物用于甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9的定量特异性好、准确度高。附图说明
[0018]图1设计的8对引物(P1到P8)对NJAU-Z9基因组DNA的普通PCR扩增
[0019]图2基于甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9基因组设计的8对引物对不同芽孢杆菌属菌株的交叉扩增结果。条带M：DL2000DNA标记；条带1：甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9；条带2：枯草芽孢杆菌NJAU-G10；条带3：解淀粉芽孢杆菌SQR-9；条带4：解淀粉芽孢杆菌T-5；条带5：短小芽孢杆菌LZ-8；6：解淀粉芽孢杆菌NJN-6；条带7：死谷芽孢杆菌NJAU-N23。引物1-8是根据NJAU-Z9基因组序列设计的潜在特异引物；“Bacillus”，芽孢杆菌属通用引物为阳性对照。[0020]图3qPCR和平板计数(PL)法在添加菌株NJAU-Z9的灭菌和非灭菌土壤中立即和5天后检测的结果。字母表示通过Tukey检验引物之间的显着差异
[0021]图4甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9对辣椒种苗及盆栽辣椒的促生效果
[0022]图5第一季盆栽试验中辣椒不同生育期根际土中NJAU-Z9的定量PCR测定结果
[0023]图6第二季盆栽试验中菌株NJAU-Z9的qPCR定量数据与成熟期植物生长指数间的皮尔森相关性
[0024]生物材料保藏信息
[0025]NJAU-Z9,甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为CGMCC
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说 明 书
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NO.12342，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。具体实施方式
[0026]实施例1供试菌株来源
[0027]本发明中所实验的甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为CGMCC NO.12342)及6株同属芽孢杆菌属的相近的菌株，所有菌保存于南京农业大学江苏固体有机废弃物资源化利用高技术研究重点实验室(表1)，全基因组序列上传于NCBI生物技术信息中心登录号NZ_CP022556.1。
[0028]表1用于引物分析的菌株及其相应的GenBank登录号
[0029]
[0030]
实施例2引物序列选择及交叉扩增验证试验
[0032]本发明基于全基因组序列在数据库中进行比对，搜索针对NJAU-Z9的特异性序列。第一步：将NJAU-Z9全基因组序列(NZ_CP022556.1.)在NCBI和EzTaxon两大权威数据库进行
[0031]
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说 明 书
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比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段。第二步：利用Oligo 6软件实施引物序列设计，设定产物大小为70-250bp，引物长度为22±2bp，共设计8对引物(表2)，并将8对引物通过普通PCR对NJAU-Z9基因组DNA依次扩增，根据条带质量对引物做初步判断(图1)。次外，选用6株其他相近种的基因组DNA和目标菌株的DNA作为引物P1-P8依次交叉扩增模板，并选用一对已报道的芽孢杆菌属引物作为阳性对照用于对引物特异性的测试(图2)。使用Bacteria DNA试剂盒(OMEGA)的方法提取各菌的总DNA。[0033]表2引物信息
[0034]
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[0035]
说 明 书
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[0036]
使用6株其他芽孢杆菌和菌株NJAU-Z9的基因组DNA作为模板，进行8对由基因组序
列设计的NJAU-Z9引物的交叉扩增结果表明，除了引物P5和芽孢杆菌通用引物(阳性对照)外，其他引物以菌株NJAU-Z9DNA为模板产生扩增片段；芽孢杆菌通用引物没有如报道所示扩增出所有测试芽孢杆菌菌株DNA的产物，而引物P5在枯草芽孢杆菌NJAU-G10中产生非特异性扩增，在之后的实验中舍去(图2)。[0038]实施例3质粒的构建及定量PCR
[0039]将来自甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9基因组中所选靶基因区域设计的8对引物扩增产物的片段克隆到pMD19-T载体(TaKaRa)中，并将质粒转化进大肠杆菌Top10细胞中，进行普通PCR扩增验证扩增片段，并由南京金斯瑞生物技术有限公司测序。使用分光光度计(NanoDrop 2000，Thermo Scientific Inc.，USA)测量质粒的DNA浓度。在7500实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)上使用Premix Ex TaqTM(TaKaRa)在20μl反应体系中进行梯度qPCR扩增。插入不同片段的质粒用于制备成10倍稀释系列(一式三份)，使用无菌水作为阴性对照。确定每个样品的循环阈值(CT)值后，通过将CT值与DNA浓度的对数作图并用于计算扩增效率(E)来产生标准曲线。从标准曲线计算未知样品中的初始目标基因拷贝数(所有基因片段均为单拷贝)。
[0040]使用通用引物M13[M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO.27)和M13-R：CAGGAAACAGCTATGACC(SEQ ID NO.28)]对7个克隆质粒的构建进行扩增检测，琼脂糖凝胶电
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[0037]
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说 明 书
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泳上观察到7对引物所产生的预期大小的产物片段被成功插入载体，结合测序结果得到扩增序列与目标模板一致，通过不同质粒浓度扩增的8对引物的标准曲线结果中，溶解曲线及扩增效率作为引物特异性及灵敏性的参考参数，所有引物菌表现出较高的扩增效率及单一的溶解曲线峰。
[0041]表3qPCR扩增引物条件及参数
[0042]
[0043]
实施例4灭菌和未灭菌土壤接种菌株NJAU-Z9验证所设计引物的检测效果
[0045]在24个50ml离心管中称取10g的土壤样品，并将其中一半(12个)在121℃下灭菌20分钟。NJAU-Z9细胞发酵液接种于6个灭菌离心管和6个非灭菌离心管中，每个管中含有菌株数约107CFU g-1根际土(干重)。所有处理分为灭菌和非灭菌两组，每组12个离心管，其中3个接菌后立即检测，3个接菌后五天后检测，3个不接菌为立即检测对照，3个不接菌为五天后检测对照。
[0046]如图3所示，无论在第一天(立即检测)或第五天检测，灭菌土壤样品中菌株NJAU-Z9的含量略高于非灭菌土壤，而在非灭菌土样中，NJAU-Z9在第五天的数量略低于第一天的数量。在所有引物对NJAU-Z9的定量中，P1的值低于其他引物，P4的值显着高于P2，P6，P7和P8，并且除了在灭菌土样的第5天检测值外，P4和P3之间没有显着差异。此外，P3和P4的值与平板计数(PL)无显着差异(图3)。由于所有引物的靶基因片段都是单拷贝，基于平板计数数据作为参考，可以得出结论，来自P3和P4的检测值更接近实际值(约107CFU g-1土壤)。另外，同时使用qPCR和平板计数法分别对灭菌及非灭菌的对照组土样检测。然而无论是立即检测还是5天后检测其CT值均高于32，在平板涂布结果中未观察到菌落，表明原始土壤不含目标菌株。
[0047]实施例5利用引物P4对辣椒根际菌株NJAU-Z9定殖能力的实际检测
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[0044]
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说 明 书
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温室育苗试验和盆栽试验被用来评估菌株NJAU-Z9的定殖效果，并且试验的辣椒
品种是甜椒(Capsicum annuum L.)(图4)。育苗试验设置为一个以含有NJAU-Z9菌株的生物育苗基质培育种苗和一个使用普通育苗基质培育种苗。生物基质中NJAU-Z9以5％体积质量比接菌，终浓度约107CFU g-1土干重。育苗试验重复三次，待辣椒苗期结束测量其株高茎粗等农艺性状。随后，进一步进行盆栽试验，将生物基质及普通基质所育种苗分别转移到称有5kg土，并拌有1.5％(w/w干重)的鸡粪有机肥的盆钵中。生物基质所育种苗处理(OFBS)和普通育苗基质(OF)分别设置25盆重复。待果实期，测量植物的农学性状及果实重量。盆栽试验重复两次。选用引物为P4分别对两次盆栽实验中辣椒根际土样进行qPCR检测。在第一盆栽中，对每个生育时期进行检测以确保其在根际定殖能力(图5)，第二次盆栽试验中，重复对收获期辣椒根际土样进行检测(图6)。[0049]在两次盆栽试验中，以含有NJAU-Z9的生物基质处理(OFBS)所育种苗移栽后在盆栽中能有效检测到菌株NJAU-Z9的数量。在第一次盆栽试验中，菌株NJAU-Z9在辣椒的整个生长期间表现出稳定的根际定殖能力(图5)。在第二季盆栽结果中皮尔森相关系数显示了菌株NJAU-Z9数量和植物生长指数及果实产量呈显着正相关(r＝0.678，P＝0.000027)，株高(r＝0.702，P＝0.00013)和茎直径(r＝0.427，P＝0.038)说明NJAU-Z9的定殖有效的促进了植物的生长，同时说明了本发明设计的引物能够在实际应用中有效检测到目标菌株(图6)。
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序 列 表
序列表<110> 南京农业大学<120> 甲基营养型芽孢杆菌菌种特异性定量PCR引物及其设计方法<160> 28<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1agacttattc gcatttaggc <210> 2<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2atcttctgtg ctctttcgac <210> 3<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3atgcgtctca tatggataga <210> 4<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 4attagtaaag tcagcaacaa <210> 5<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 5gacaagctaa ataaccacta <210> 6<211> 20<212> DNA
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序 列 表
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 6taagatacct atgatccaat 20<210> 7<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 7gtggtagtaa cgctattgaa 20<210> 8<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 8cctctttacc cacaactgca <210> 9<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 9gtggtagtaa cgctattgaa <210> 10<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 10aagtaacctc tttacccaca <210> 11<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 11ggctcgtggc acaatagacc <210> 12<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 12agcgtgttta ggtgctttga 12
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序 列 表
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 19agacttattc gcatttaggc aaaaataaaa aaggacacgg aaactttatt agttacgtcg 60aaagagcaca gaagat 76<210> 20<211> 215<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 20atgcgtctca tatggataga tatatctata agtactatgg ggacaagcta aataaccact ataattctgt tgtagatgaa ctaggtatta atgaagttgc aactgcatat cggaataact tatctggaaa aagtaatatt aacttcgcta aagaagttat tgattttata aaagtacagc aaagtgcata tatttttgtt gctgacttta ctaat <210> 21<211> 205<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 21gacaagctaa ataaccacta taattctgtt gtagatgaac taggtattaa tgaagttgca actgcatatc ggaataactt atctggaaaa agtaatatta acttcgctaa agaagttatt gattttataa aagtacagca aagtgcatat atttttgttg ctgactttac taatttcttt gatacattgg atcataggta tctta <210> 22<211> 143<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 22gtggtagtaa cgctattgaa ccttcttatg gagggagaaa tggaagtata tttacaaata ttttatgcga tggactgacg aataaatttt taataaaaaa gggagaactt tcactttatg atttgcagtt gtgggtaaag agg <210> 23<211> 149<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 23gtggtagtaa cgctattgaa ccttcttatg gagggagaaa tggaagtata tttacaaata ttttatgcga tggactgacg aataaatttt taataaaaaa gggagaactt tcactttatg atttgcagtt gtgggtaaag aggttactt <210> 24
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<211> 280<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 24ggctcgtggc acaatagacc agattccaaa gtgtaacttt ttcaatattc catatgaaaa 60ctcaatcact tatcatgaaa ctaatgatca cttcctaatg aattatgcaa gcatgttgca 120tttagttaat atatatcgag actctgacat ggatcctgta gaaaaattat tagaattcct 180aagttggaac cttgacaatt tactcatctc tcaatatatc aatacatatc ttgttatgtt 240attttccaat caaaatggta tcaaagcacc taaacacgct 280<210> 25<211> 123<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 25aggatacaac gattcttaca atgctaaaat agagctaaat aattttaatg atattttcga tttttatcca cctcagatat ggttaaattt ggctcgtggc acaatagacc agattccaaa gtg <210> 26<211> 162<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 26tatcaaagca cctaaacacg ctaatagcga tatattagaa agaattgaaa aaggttgtat gaatcaagca tgggatttaa cctatctatc atgttggagt acactttact ggaatgaatc aaaaacgcat gaggtttttt tatttgctac cgccgataat ct <210> 27<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 27tgtaaaacga cggccagt <210> 28<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 28caggaaacag ctatgacc 15
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说 明 书 附 图
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说 明 书 附 图
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