1移动基因：又叫转位因子（transposable elements）,由于它可以在染色体基因组上移动，甚至可在不同染色体间跃迁，故又称跳跃基因（jumping gene）。有三种类型，插入序列，转为子和噬菌体Mu和D108。 2断裂基因（split gene）：真核细胞的结构基因，其核苷酸序列中含有与氨基酸编码无关的DNA间隔区段，从而被分割成不连续的若干区域。将这种编码序列不连续，有间隔区段的DNA片断称为断裂基因。非编码间隔区段称间隔子，有转录和编码功能序列称表达子。原核细胞无内含子。 3重叠基因（overlapping genes）：不同基因的核苷酸序列有时为相邻两个基因共用，将核苷酸彼此重叠的两个基因称为重叠基因。
4假基因：在珠蛋白基因簇（gene cluster）各片断核苷酸序列分析时发现，除了有正常的功能基因之外，还有功能失活的特殊序列片断，它不能行使表达功能。该类无表达功能的畸变核苷酸基因序列片断，称为假基因。
5同尾酶：有一些限制性核酸内切酶识别的碱基顺序不完全恒定，即识别顺序不同，但酶切后产生同样黏性末端的两种酶称为同尾酶，如BamHⅠ和Bgl Ⅱ。 6质粒：细菌存在于细胞质中的一种独立于染色体以外的遗传成分，是由环状的DNA分子组成的复制子。质粒有我复制和调控系统，可以在胞浆内自主复制，把携带的遗传信息通过自我复制的子代质粒，可随细菌分裂而进入子代菌体中。还有转移，选择性标记及不相容性等特性。
7柯斯（COS）质粒：粘性质粒（Cosmid）带有λ噬菌体的Cos位点和整个pBR322的DNA顺序。经感染进入细菌细胞以后，它就好象质粒那样在细胞中进行复制。分子量小，易环化和扩增，可包装30-45kb外源基因，可由Ampr抗性筛选，常用于构建基因文库。 8 Cos位点（Cohesive-end site）： λDNA为线状双链分子，两端各有几个碱基的单链互补粘性末端，通过粘性末端的互补作用形成双链环形DNA。这种由粘末端结合形成的双链区段即Cos位点。 9 COS细胞：用一个复制起始部位缺失的SV40突变种感染猴细胞，由于病毒DNA不能自主复制，便整合到宿主染色体DNA中，早期基因表达产生功能性的T抗原，这样的细胞就叫COS细胞。
10基因组文库：分离真核生物中某种DNA成分, 通常是分离供体细胞中的染色体DNA，酶切后，将这些染色体DNA片段与某种载体相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真核细胞染色体DNA片断的克隆株, 这种克隆株群体称基因组文库。 11cDNA文库：以mRNA为模板在反转录酶的作用下将形成的互补DNA（cDNA ）与某种载体相接，而后转入大肠杆菌，建立克隆株，即cDNA文库（gene library） 12转染：病毒（含噬菌体）DNA及其重组子DNA导入宿主细胞（或细菌）的过程。由于噬菌体是细菌的病毒，因此噬菌体DNA 导入大肠杆菌的感受态细胞也称转染。
13转导：以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程称转导。
14 转化：以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞。转化作用就是一种基因型细胞从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA，进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生变化的现象。常见：原生质粒转化法，化学转化法和电穿孔法。
15启动子：是位于结构基因上游，转录起始调控所必需的一段DNA序列，是RNA聚合酶与模板DNA结合的部位。内含-35区（与σ因子结合）和-10区（和核心酶结合）的保守序列。当启动子与全酶结合后可在+1转录起始点开始转录。
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16 终止子：位于一个基因编码区3’下游提供终止信号的DNA序列，可以被RNA聚合酶识别并发出停止mRNA合成的信号。一般为一段发卡结构的反向重复序列。 17起始密码子：编码多肽链的第一位氨基酸的密码子AUG（或ATG），编码甲硫氨酸（蛋氨酸）。在细菌中也有罕见的起始密码子GUG，编码缬氨酸。其起始表达作用AUG＞GUG。
18终止密码子：有三个密码子（UAA, UAG，UGA），是使蛋白质合成终止的码子，通过一个或两个组合在一起发挥作用。只表示链的终止，不表达氨基酸。
19 锌指结构：由两个半胱氨酸残基和两个组氨酸残基通过位于中心的锌离子结合成一个稳定的指状结构，并以锌辅基螯合成的环状结构作为活性单位，在指状突出区表面暴露的碱基及其极性氨基酸与DNA结合有关。
20粘性末端：是指DNA分子在限制酶切割后产生一条链多出几个碱基的互补对称的突出末端，若5’突出称5’粘性末端，他们能够通过碱基间的配对而重新环化起来，若平末端的DNA片段则不易重新环化。
21 PCR：聚合酶链反应，是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件：模板DNA，寡链核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲液系统和DNA变性、复性及延伸的温度与时间等，使加入的4种dNTP由引物沿模板从5’→3’按碱基配对原则, 形成与模板DNA互补的半保留复制链。
22 Genomic DNA：基因组DNA，组成生物基因组的所有DNA，包含一个生物体的全部遗传信息，即DNA的全部核苷酸序列。对于二倍体高等生物，其配子的DNA总和即为一组基因组。不同区域具有不同的功能，有些编码蛋白质，有些调控基因的复制，转录和蛋白质表达等。 23 Intron：即间隔子（内含子），与原核的蛋白质编码基因相比，真核蛋白质编码基因最主要的特点是其转录区的编码序列是间断的不连续的，其中非编码序列叫间隔子。它可随DNA的转录，参与形成前体mRNA，而后在转录后的加工过程中被剪切，最终不存在于成熟mRNA中。因其对翻译产物的结构无意义，因而累计有更多的突变。 24 Exon：即表达子（编码序列），与原核的蛋白质编码基因相比，真核蛋白质编码基因最主要的特点是其转录区的编码序列是间断的不连续的，其中编码氨基酸的序列叫表达子。它是转录物经加工后被保留的相应的成熟RNA分子，并可在蛋白质合成过程中表达为蛋白质。所有外显子一同组成了遗传信息。 25转录（transcription）：生物体以DNA为模板在mRNA聚合酶的作用下，合成RNA的过程称为转录。包括转录起始、延伸、终止等过程。转录是不对称的，体现为在DNA双链上一股链可以转录而另一股不可以。二是模板链并不都是在同一单链上。
26翻译(translation): 在多种因子辅助下，细胞内以mRNA模板，在核糖体上通过tRNA识别该mRNA的三联体密码子和转移相应氨基酸，组装合成蛋白质肽链的过程。在多数情况下，新生多肽还需要经过转译后加工和修饰才能成为有活性的蛋白质。
27顺式作用元件：顺式作用元件为一些能与DBP结合的特定序列DNA片段,主要位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录效应。按功能可分为启动子、增强子、沉默子、衰减子、终止子等DNA序列片段。
28反式作用因子 ：反式作用因子是一组能直接或间接地与DNA的顺式作用元件
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特定序列结合，发挥调节作用的核内非组蛋白，激活或阻遏基因表达。是DNA结合蛋白（DBP），DBP又称转录因子（transcription factor,TF）分通用转录因子及转录调节因子两大类。基因表达的组织特异性及细胞周期特异性受上述元件和因子的相互作用所决定。
29转录因子：能够结合在某基因上游特异核苷酸序列上的蛋白质，活化后从胞质转位至胞核，通过识别和结合基因启动子区的顺式作用元件,启动和调控基因表达。
30瞬时表达 ：外源基因进入宿主细胞后，不整合到受体细胞染色体而独立于其外，随复制而出现基因产物，但复制量不宜太多，否则会引起细胞死亡，也不能随细胞传代，因而其表达的量越来越少最后消失。这种现象称为瞬时表达。 31稳定表达 ：具有选择性标记，有完整的哺乳动物细胞转录系统，但无真核复制子的表达载体，在转染哺乳动物细胞后，外源基因进入真核细胞后，可将基因整合到细胞染色体上，可随细胞转录表达和传代。通过对转染DNA的阳性细胞克隆筛选，则可获得外源基因整合到细胞染色体中稳定表达的细胞。 32tk基因：可以合成胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine Kinase,TK），在所有真核细胞中都有表达, 是嘧啶生物合成补救代谢途径中的一个关键酶, 它可催化胸苷磷酸化转变成为dTMP, 继续磷酸化生成dTTP, 参与DNA的生物合成。通过HAT培养基筛选TK+细胞。同时也对GCV敏感，是一种常见的自杀基因。
33亮氨酸拉链：存在于蛋白C末端，为两组走向平行，带亮氨酸的α—螺旋形成的对称二聚体，约为30个氨基酸，每两个亮氨酸之间隔有六个氨基酸，于是每两圈螺旋就有一个亮氨酸，排成一排，从而在2个α-螺旋的蛋白分子之间形成一条拉链。形成二聚体后可使肽链上富含的碱性氨基酸区与亮氨酸拉链形成的整体结构与DNA亲和力较强而发生结合。 34基因突变：指基因组DNA分子在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变（通常只涉及部分序列的变化），并引起个体表型的改变, 而使生物体发生遗传变异。 35同义突变：是指碱基被替代后, 没有改变产物氨基酸序列, 这是与密码子的简并性相关, 如CTT、CTC、CTA、CTG的第3位碱基互相替代后其编码表达的产物均为亮氨酸,因此这种突变不产生突变效应。
36错义突变：是指碱基序列的改变引起了产物氨基酸的序列改变。有些错义突变严重影响到蛋白质活性甚至完全失去活性，从而影响了表型。如果该基因是必需基因，则该突变为致死突变。
37.无义突变：某个碱基的改变可使某种氨基酸的密码子突变为终止密码子。如赖氨酸的密码子AAG突变为终止密码子TAG,若肽链合成过早终止, 则蛋白质产物一般没有活性。若是发生在基因DNA的3’末端处, 它所表达产生的多肽常有一定活性或有部分活性, 这种突变又称为渗漏变型（leaky mutation）。
38限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。主要从原核生物中分离纯化出来。 39基因拼接：将有共同限制性内切酶切点的基因连接起来形成多种基因杂合体，如将IFN-1与IFN-2亚型间进行拼接，可形成IFN-1/2或IFN-2/1等，称IFNs杂合体。此外，也可根据需要将具有协同效应的不同基因进行接拼。 40基因缺失：将原基因中的非功能区域的编码子人为地使之缺失的过程称为基因缺失，所表达的产物相对分子质量虽然小了，但有时可提高表达效率，如IL-6缺失N端17~25个核苷酸可使IL-6的表达效率提高。有时还可降低一些毒性作用。如TNF基因缺失某一区域可使毒性下降。
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41重组病毒载体：将外源性的DNA直接插入缺陷型的病毒基因组上，插入的外源片段的大小同被取代的病毒基因组区段是等同的。这样形成的重组体DNA能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，并包被成病毒颗粒。但为了补充被取代病毒基因组DNA功能，必须用一种与之互补的辅助病毒。
42重组质粒型载体：即重组病毒-质粒载体，这类载体只取病毒基因组中维持在哺乳动物中进行复制的有关序列以及抗性标记基因，使它与一个细菌质粒融合，这样的重组体也能够在大肠杆菌中进行复制和增殖，不过这种重组体不能够被包装成病毒颗粒，不能出现裂解感染的情况。
43基因工程多肽疫苗：使微生物对人体具保护作用的抗原基因经体外重组表达后所制备的生物活性多肽类疫苗称基因工程多肽或亚单位疫苗。其表达系统可以是酵母，也可以是哺乳动物细胞，若无需糖基化的多肽疫苗甚至可在大肠杆菌等原核细胞中表达。
44基因置换(gene replacement)：是指将致病基因整个地被有功能的正常基因所置换，使致病基因永久地得到更正。但操作难度大，有伦理学问题。
45基因修正(gene correction)是指将致病基因的突变碱基序列予以纠正，而正常序列部分予以保留，使突变的致病基因恢复正常功能。即使致病基因的突变序列纠正为正常序列（用碱基点突变技术）。
46基因修饰(gene augmentation)则是指将目的基因导入缺陷细胞或其它细胞，目的基因的表达产物可修饰和改变缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。 47基因失活(gene inactivation)就是应用反义技术(antisense technology)特异封闭某些基因的表达，以达到抑制或阻止某些有害基因的表达。SiRNA的基因干扰可造成靶基因（异常基因）的失活（或沉默）。
48转基因动物：就是把外源性目的基因导入动物的受精卵或其囊胚细胞中，并在细胞基因组中稳定整合，再将合格的重组受精卵或囊胚细胞筛选出来，采用借腹怀孕法寄养在雌性动物的子宫内, 使之发育成具表达目的基因的胚胎动物, 并能传给下一代。这样，生育的动物为转基因动物。这类动物由于外源性目的基因的稳定存在而赋于子代动物个体。
49动物克隆：是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。取发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，使之与去掉细胞核的卵母细胞融合，经短期培养后形成胚胎细胞并移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。
50基因敲除：是向正常生物个体内引入某个突变基因位点而选择性地使某特定基因功能失活的技术，可培养出靶向性剔除某基因的动物，而导致行为特性改变。但由于同源位点和重组率低等原因，障碍较大。
51 ES细胞：胚胎干细胞，不仅具有全能分化能力，而且可以在体外培养建立细胞株。同时还有无限增殖和自我更新等功能。若把培养的细胞接种到恰当的动物胚胎中培育分娩后，便可发育出嵌合体动物。 52基因组：表示某物种单倍体的总DNA。对于二倍体高等生物其配子的DNA总和即为一组基因组，不同生物基因组数目不同。
53基因表达：生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编码的形式储存在遗传物质DNA上。基因表达的过程就是遗传信息经过转录，翻译等及其复杂的生物化学反应，最终产生具有生物功能的蛋白质。即DNA→RNA→蛋白质。DNA中含有的基因
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遗传信息决定了物种的遗传和变异，并通过表达蛋白质来呈现遗传性状。
54 RT-PCR：即逆转录PCR，先在逆转录酶的作用下以mRNA为模板合成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR反应。这样，低浓度的mRNA被扩增放大易于检测。是一种快速、简便且敏感性极高的检测RNA的方法，可用于分析基因的转录产物、克隆cDNA及合成cDNA探针、改造cDNA序列等。其关键步骤是RNA的逆转录，要求RNA 模板必须是完整的且不含DNA，蛋白质等杂质。 55载体（vector）：可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子。主要包括五类：质粒，λ噬菌体的衍生物，柯斯质粒，单链DNA噬菌体M13，动物病毒。
56基因：指编码有功能蛋白质多肽链或RNA分子所必须的全部核酸序列。一个基因不仅含有编码蛋白质肽链或DNA分子的核酸序列，还包括保证转录所必须的调控序列及位于编码区上游5’端的启动子非编码序列，内含子和位于编码区下游3’端的终止子非编码序列。前者为结构基因后者为调控基因。 57 密码子（codon）：由3个相邻的核苷酸组成的mRNA基本编码单位。有64种密码子，其中有61种氨基酸密码子(包括起始密码子,AUG、ATG也编码蛋氨酸和甲硫氨酸)及3个终止密码子（UAA,UAG,UGA），由它们决定多肽链的氨基酸种类和排列顺序的特异性以及翻译的起始和终止,。
1 什么叫做基因？何谓基因的新概念？基因的主要功能是什么? 答：概念见名解56.
所谓基因的新概念是随着近年分子生物实验技术的发展，从分子水平上研究基因的结构和功能，提出的移动基因，断裂基因，重叠基因，假基因等基因的新概念。 功能：基因是编码蛋白质或者RNA分子基本遗传信息的基本遗传单位，最终可合成各种特异的多肽，具有不同的功能。从化学角度看，基因是具有特定功能和结构的连续脱氧核糖核苷酸序列，是构成染色体的重要组成部分，是构成DNA的功能单位。
2真核细胞基因组中的基因常有内含子存在，能否在原核细胞中表达？能，为什么？不能，为什么？ 答：不能，真核细胞基因序列中的内含子是插入在结构基因中间使其不能连续的间隔基因序列片段，可随DNA 转录参与形成前体mRNA，而后在转录后的加工修饰过程中通过两次转脂反应而剪切，在原核细胞中，由于其基因组序列不包括这类内含子，也缺乏相应的内含子的剪接功能和转录后加工系统。因此不能完成内含子基因序列的剪切过程，是一种无效转录。同时，真核生物基因在原核细胞中表达还必须有相应的原核RNA聚合酶以及可识别的原核细胞的启动子, 才能催化RNA的合成。
3试述DNA分子的结构及其意义。
答： DNA一级结构：即DNA分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序。其中A,T,C,G碱基分布不均匀，但脱氧核糖和磷酸均一样。意义：1、蕴藏着极为丰富的转换为蛋白质的遗传信息；2、一些特定序列以其大量信息决定着DNA的空间结构及基因间相互作用和调控功能。
DNA二级结构：为DNA双螺旋结构，由两条反向平行互补的脱氧核糖核苷酸链组成，两条链之间靠碱基间的氢键结合，多为右手螺旋。意义：解释了DNA 复制时两条链可分别作为模板生成新的子代互补链，从而形成遗传信息稳定传递的半保留复制机制。
DNA三级结构，指双螺旋结构基础上的卷曲，包括线状双链中可能有的扭结和超
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螺旋、多重螺旋和分子内单链形成的环及环状DNA中的扭结、超螺旋和连环等体拓扑学状态。意义：1、使DNA体积更小，2、DNA的线性序列带遗传信息，而紧绷的超螺旋状态储存着必要的生物学过程的能量和信息。是一种重要的功能态。 三链DNA：双螺旋结构基础上形成的三链螺旋结构。意义：1、作为精确切割双螺旋DNA靶序列的分子剪刀；2、作为基因表达抑制物，选择阻断靶基因，抑制转录；3、阻止序列专一性蛋白质结合，影响DNA 与蛋白质结合及DNA复制转录等。
四链DNA：如端粒酶是真核细胞DNA 3’末端特殊重复序列，对染色体起保护作用。
4 试述cDNA文库的构建及其意义？
答：过程：1、cDNA克隆：选用目的基因含量丰富的组织细胞，提取总RNA，根据3’末端polyA尾长度不一，用亲和层析法获取较纯的mRNA2、第一股 cDNA合成：以分离纯化的mRNA为模板，以Oligo(dT) 为引物在反转录酶的作用下，沿模板的3’→5’方向合成。对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA，也可用随机引物法，以6～8个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链（RNA-DNA）3、第二股cDNA的合成：⑴ 自身引导法⑵ 置换合成法⑶ 外加引物合成法 4、cDNA与载体连接和导入宿主细胞：cDNA加头或衔接尾，使产生的黏性末端与载体相应的黏性末端互补，形成重组DNA。
意义：1、以成熟mRNA 为模板合成的cDNA无内含子，大大减小其长度，便于操作。2、真核生物细胞表达mRNA 的量比人类基因组少很多，因此减少了筛选目的基因的工作量。3、某一特定功能基因在mRNA 中拷贝量大于基因组，利于获得较多模板。4、可从全长cDNA序列中直接找到编码区，推测氨基酸顺序，分析性质和功能。5、基因克隆后可在原核细胞中表达有生物活性的蛋白。 5基因组文库构建的过程及意义？
答：过程：1、分离纯化基因组DNA,提取哺乳动物细胞染色体DNA；2、制备全部基因组的DNA片断：包括完全酶解，部分酶解和机械切割。3、构建基因组文库载体，常用载体：粘性质粒，λ噬菌体，酵母人工染色体系统。4、DNA片段与载体的连接包装：直接与经BamHⅠ消化酶切的λ噬菌体的黏性末端在T4连接酶的作用下进行重组结合形成重组DNA，然后进行体外包装产生完整的具有强感染力的噬菌体颗粒，继而形成噬菌斑。5、导入细胞，一定条件下进入大肠杆菌培养增殖。
基因组DNA +粘性质粒→重组DNA→转化细菌→菌落
② 基因组DNA +λ噬菌体→重组DNA→包装成噬菌体→感染细菌→噬菌斑
意义：1、可便于研究基因组中5’末端控制基因转录的调控序列，内含子的分布和作用以及重复序列的数量及分布的大小。2、开展“人类基因组计划”研究。3、在哺乳动物细胞中，是表达目的蛋白的基本形式之一。 6什么是限制性核酸内切酶？ 答：限制性核酸内切酶是一类可以识别双链DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类限制酶。主要从原核生物中国分离纯化而来。根据限制酶的结构,辅因子的作用方式，可将限制酶分为三种类型：I型、II型及III型。Ⅰ型既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型只催化非甲基化的DNA的水解；III型同时具有修饰及认知切割的作用。 7.链终止DNA测序法基本原理及过程？
答：原理：在单链DNA合成链延伸过程中，若以dNTP为原料，新掺入的脱氧核
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苷酸5’-P与前一个核苷酸戊糖的3’-OH以磷酸二酯键相连，可使链不断延伸。但若在反应体系中加入ddNTP，可替代具有相同碱基的dNTP，但由于ddNTP不具有3’-OH，下一个核苷酸不能与之连接，使得DNA链的合成终止。因此，可以特定的放射标记，通过放射自显影获知最后一位核苷酸的碱基类型，从而获知相应的DNA序列。
过程：1、以待测序列的单链DNA为模板，加入适当的DNA引物和4种dNTP，其中一种是带放射标记的，分别加入相应的反应体系（A/T/C/G）中。同时，每个反应体系加入一定比例的ddNTP和DNA聚合酶。2、PCR合成。由于同一反应体系中有dNTP和ddNTP，因此会竞争相同的碱基部位，若以前者结合，则合成继续，后者则使合成停止。因此，最终会得到很多长度不同的合成链。3、将合成结束后的产物分四条相邻泳道进行凝胶电泳，每个体系为一条泳道。则产生四条分子量从小到大，从正极到负极的梯度条带。4、将凝胶电泳产物通过放射自显影，在X光胶片上显现四条并列的“梯子”条带。5、对四条“梯子”条带并列分析。从最下的正极向上依次将最短的DNA链到最长链的末端碱基读出。即从5’→3’直接读出这条链的碱基顺序，但要注意的是，这条链是待测模板链的互补链，还需要进行互补转换，最终得到待测链序列。 8试绘图并说明大引物PCR定点诱变法的过程。 答：如图P183页。 原理：以第一轮PCR产物作为第二轮PCR扩增的引物。第一轮以引物2和引物3扩增出短片段DNA，引物2含有预先设计的突变序列。待PCR产物经纯化后除去原来的引物，然后以上一轮PCR扩增产物作为大引物，并与引物1一起再对靶基因作第二轮PCR扩增，其产物即为突变的DNA。
9.何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明？
答：四大里程碑：1、1944年Oswald Avery报道肺炎球菌转化实验，不仅证明了生物的遗传物质是DNA，而且还证明了DNA可以转移，并把一个细胞的性状传递给另一个细胞；2、1953年James waston和Francis Crick阐明了DNA双螺旋结构，建立了DNA半保留复制及蛋白质合成的中心法则，提出了遗传信息是DNA→RNA→蛋白质，也阐明了转录翻译过程中出现误差造成生物变异；3、遗传密码子的破译：1961年Monod和Jacob提出操纵子学说，1968年Crick和Nireberg完全破译64个遗传密码子，确定遗传信息是以密码子方式传递的；4、基因转移载体的发现：20世纪60年代，发现了细菌的质粒，它是指生物体染色体以外的环状DNA，具有独立自我复制的能力，可在微生物细胞间转移。 三大技术发明：1、工具酶的发明（内切酶、合成酶、连接酶）；2、基因合成和测序（合成仪、测序仪）；3、PCR技术（PCR扩增仪）。 10 基因重组常用哪几种载体？其共同特点如何？
答：常用载体有5类：质粒，λ噬菌体的衍生物，柯斯质粒，单链DNA噬菌体M13，动物病毒。
共同特征：①在寄主细胞中能自我复制②容易从寄主细胞中分离纯化③载体DNA分子中有不影响扩增的非必需区④有单一酶切位点（多克隆位点）：一种酶在一
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个载体上只有一个酶切位点。多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶切位点⑤能赋予细胞特殊的遗传标记⑥表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、终止子,SD序列）。
11作为理想的质粒载体有哪些基本条件？
答：作为理想的质粒载体，应具备以下几个条件（1）能自主复制，即本身是复制子（2）具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；（3）在基因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征，（4）分子量要小，多拷贝，易于操作。 12什么叫插入失活，举例说明之？ 答：外源基因片段克隆到插入型载体上后，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应，也为克隆基因的选择提供了表型。常用的有免疫功能失活和大肠杆菌-半乳糖甘酶失活。
例一：免疫功能失活。Imm434是噬菌体434的免疫区段，通过噬菌体杂交的办法导入噬菌体基因组，构成插入型的派生载体。在CⅠ基因内部有EcoRⅠ和HindⅢ的单一切割位点，若在这两个位点中任意一个插入外源DNA片段，都会导致CⅠ基因的失活，阻遏蛋白合成受阻，进入溶菌周期，结果产生出清晰的噬菌斑，而亲本噬菌体CⅠ未失活，可以变成溶原的状态，形成浑浊的噬菌斑。
例二：-半乳糖甘酶基因组中含有一个大肠杆菌的LacZ区段，在诱导物IPTG存在下，可指导合成-半乳糖甘酶与X-gal结合形成蓝色化合物。因此由这样的载体感染的大肠杆菌Lac-指示菌，涂布在含有IPTG和X-gal的培养基上，会形成蓝色噬菌斑。但若在LacZ区段插图外源DNA片段，就会阻断其编码序列使其失活，从而不能形成相应的蓝色噬菌斑。
13如何从所克隆到的基因重组体载体中鉴定基因的存在和正确性？ 答：1、利用遗传标志的表型特征筛选：（1）由载体提供的性状进行筛选：a、抗生素抗性标记筛选：当带有完整抗性基因的载体转化抗性细胞后，所有转入载体的细菌都获得了抗性，被转化的阳性克隆菌，能在含相应抗生素的平板上生长形成菌落，而未转化的原宿主菌则不能生长。b、抗性基因的插入失活筛选：在含有两个抗性基因的载体中，如果目的基因DNA 片段插入其中一个抗性基因，就会导致抗性基因功能失活，用两个含不同抗生素的平板进行对照筛选。c、-半乳糖甘酶LacZ基因失活：通过基因内互补作用，使缺失LacZ基因的突变体和带有完整LacI而无-半乳糖甘酶活性的的突变体结合，形成有功能活性的-半乳糖甘酶。（2）根据插入基因的遗传性状进行筛选：如亮氨酸（Leu）为Leu营养缺陷菌所必须，如果外源基因中能够表达Leu，则可使细菌生长。 2、根据重组子的结构特征筛选：（1）重组子大小鉴别筛选：菌落→提取质粒→单切酶→电泳质粒。携带外源目的基因的重组子质粒分量大，条带滞后，反之在前。适用于插入片段大的重组体筛选。（2）酶切鉴定：菌落→提取质粒→双切酶→电泳质粒。原载体无外源目的片段，电泳为一条带，装有外源基因的载体有原载体和目的基因片段两条带。（3）PCR筛选法：利用能与插入基因片段两端互补的特异引物，以少量抽提的重组子DNA为模板扩增出特异片段的转化子为携有目的基因的重组子，还可进行直接测序。（4）原位杂交：在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置原位不变的转移到滤膜上，并在原位溶菌裂解，DNA变性和用特异探针进行杂交。（5）斑点杂交：将重组体DNA或RNA提取出来，将样品点在硝酸纤维膜上进行杂交。纯化的重组体去除了杂质干扰。（6）Southern blot：将同源片段定位在某个酶切片段中，可用于对克隆后片段的基因定位，也
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可测其含量。
14、质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 答：一般用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶（BAP或CAP），预先处理线性的载体DNA分子，以移去其末端的5’-P基团，于是在连接反应中，它自己的两个末端就再也不能被连接酶共价连接起来了。这样形成的杂种DNA分子的每一个连接位点中，载体DNA都只有一条链是外源DNA连接上的，而另外一条链由于失去了5’-P基团，不能作此连接，故留下一个具有3’-OH和5’-OH的缺口，尽管如此，这样的DNA分子仍然可以导入细菌细胞，并在寄主细胞内完成缺口的修复工作。另外，也可改用双酶切片段的定向克隆，用两个不同的限制性核酸内切酶切割目的基因和载体，产生两个不同的粘性末端，避免该现象。 15如何利用抗体标记基因筛选阳性克隆？
答：1、抗生素抗性标记筛选：大多数质粒载体均带有抗生素抗性基因，如抗氨苄西林基因等，当带有完整抗性基因的载体转化抗性细胞后，所有转入载体的细菌都获得了抗性，被转化的阳性克隆菌能在相应抗生素的琼脂平板上生长，如pBR220的抗氨苄西林基因可使克隆菌在氨苄西林平板上生长并形成菌落，而未被转化的原宿主菌则不能生长。
2、抗性基因的插入失活：在含有两个抗性基因的载体中，如果目的基因DNA片段插入其中一个抗性基因，就会导致该抗性基因的功能失活，用两个分别含不同抗生素药物的平板进行对照筛选，可筛选出阳性重组子克隆菌株。如pBR322质粒编码有Tet抗性基因和Amp抗性基因，若通过外源DNA片段使Tet或Amp抗性基因失活，则重组体克隆能在只含有一种抗生素的平板上生长繁殖的重组体克隆即为阳性转化。
16真核表达调控的顺式作用元件和反式作用因子有哪些？其作用特点是什么？ 答：顺式作用元件有：启动子，增强子，沉默子，衰减子，终止子。
作用特点：1、多数位于真核生物结构基因上游，只有终止子位于下游，而增强子可以在上游也可以在下游。2、能够与DNA结合蛋白质结合的特定序列的DNA片段。3、决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录效应。 反式作用因子因子：通用转录因子和转录调节因子。
作用特点：1、同一DNA序列可被不同蛋白质识别。2、不同蛋白质因子可与不同DNA 序列发生联系，但直接连接为少数。3、蛋白质-蛋白质或DNA-蛋白质的结合，均导致构象上得细微变化，构象变化常是实现调控功能的分子基础。4、在反式作用因子的自身生物合成过程中，有相当大的可变性和可塑性。 17、目的基因表达系统有哪几种？其特点如何？
答：主要有原核（如大肠杆菌）和真核(如哺乳动物细胞)两大表达系统。
两个系统的特点：1、真核生物DNA大部分是非裸露的，由核膜包裹，DNA 转录后需由特殊的肽链引导出核膜后开始翻译。原核生物大部分DNA属于非结合状态，又无核膜相隔，边转录边翻译。2、真核生物DNA 中存在内含子，不翻译，可在转录后的加工修适中剪切掉。原核生物DNA序列中没有内含子，也没有转录后相应的剪切过程。3、真核生物具有在需要时以可控方式重拍某些DNA片段和扩增特定基因的机制，原核生物中罕见。4、真核生物有3种不同的RNA聚合酶，分别参与不同类型的RNA分子转录作用。而原核生物往往只有一种RNA聚合酶。5、真核生物产生的mRNA分子寿命大多比原核生物长。6、真核生物初级转录产物可进行转录后的加工修饰。不仅可除去内含子，还可以再mRNA分子的5’末端加帽，3’末端加尾。7、真核生物不存在操纵子结构，转录产物mRNA为单顺
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反子，其表达调控成散在瀑布样型。原核基因表达调控顺序为操纵子，转录产物为多顺反子，可直接与一定数量的核糖体结合形成为多聚核糖体。8、真核生物基因为多拷贝。而原核生物中除了rRNA，tRNA和启动子部分区域为重复序列，其余基因很少含重复序列。9、真核生物一条mRNA上同时只能合成一条肽链，原核生物每个核糖体可独立合成一条肽链，多聚核糖体可同时在一条链上合成多条肽链。10、真核生物翻译过程不需要SD序列的特异性结合，原核生物必须依赖这种序列。11、原核生物表达的外源基因蛋白产物不能被糖基化。 18基因工程疫苗研究开发常用的技术途径有哪些？
19基因治疗展望和应用如何？
答：展望：基因治疗存在感染率低，表达水平低，长期表达效果难，整合随机性带来危害等自身问题，以及伦理道德，安全性，技术复杂，要求条件高，所用细胞寿命短等技术问题。但它是人类治疗疑难疾病的新方法，新技术，随着研究和应用的不断发展，不断深入，技术不断完善成熟，基因治疗将会在人类常见病和多发病及疑难病的有效治疗中发挥巨大作用，许多原来视为“不治之症”的疾病将应用这先进技术得到治愈，其应用前景极为广阔。
应用：1、遗传性疾病的基因治疗 2、肿瘤的基因治疗（1）抑癌基因转移的基因治疗（2）反义寡核苷酸的原癌基因失活疗法（3）药物自杀基因在肿瘤基因治疗中的应用（4）癌抗原基因转移的肿瘤基因治疗（5）多重耐药性基因转移的肿瘤基因治疗3、病毒的基因治疗（1）阻止病毒复制策略（2）使感染HIV细胞死亡的方法（3）降解策略
20有哪几种反义核苷酸基因失活疗法？简述其原理。
答：原理：反义RNA是一种与mRNA互补的RNA分子，它是双链DNA中无意义链转录的RNA，因此肿瘤癌基因活化表达的mRNA的起始翻译部位就会被相应的反义RNA互补结合形成RNA/RNA双链体，进而就阻止了核糖体与启动子结合，或阻止核糖体mRNA上移，以抑制mRNA的翻译，起到了抑制癌基因过高表达癌蛋白的效果。
反义核酸包括三类：1、将特异的反义基因重组到表达载体上，导入靶细胞中转录出反义RNA，形成双链RNA,阻碍基因的翻译。2、人工合成寡聚脱氧核糖核酸经过化学修饰导入细胞，与mRNA和DNA结合，形成RNA/DNA杂链或DNA核苷酸三聚体，影响基因的翻译或转录。3、特异性的核酸，根据癌基因设计出特异的“锤头”或“发夹”结构，它能够催化切割，降解异常表达基因的mRNA而影响基因的翻译。
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21何谓“动物克隆技术”？有何应用价值？
答：动物克隆：是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。取发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，使之与去掉细胞核的卵母细胞融合，经短期培养后形成胚胎细胞并移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。
应用价值：1、培育优良畜种和生产实验动物。2、生产转基因动物。3、生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法。4、复制濒危动物物种，保存传播动物物种资源。
22 PCR基本原理和过程？
答：原理：是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件：模板DNA，寡链核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲液系统和DNA变性、复性及延伸的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增。 其技术原理如图：P135
PCR过程：1、DNA模板变性：与体内不同，体外用94C左右的高温使其变性形成单链DNA。2、模板与引物退火：PCR需要两条寡链核苷酸作为合成时的引物，分别与待扩增DNA的序列两端互补。在降低温度过程中，通过控制退火条件就能使其与扩增区域两端配对。3、引物延伸：在4种dNTP及Mg离子存在的条件下，DNA聚合酶在最适作用温度下可将核苷酸从引物3’端掺入，沿模板延伸。整个过程约需要30轮的循环。
23.试述RT-PCR的原理及过程？
答：原理：即逆转录PCR，先在逆转录酶的作用下以mRNA为模板合成DNA,再以cDNA为模板进行PCR反应。这样低浓度的mRNA被扩增放大易于检测。是一种快速、简便且敏感性极高的检测RNA的方法，可用于分析基因的转录产物、克隆cDNA及合成cDNA探针、改造cDNA序列等。
RT-PCR过程：1、mRNA，引物和逆转录酶以及适当的缓冲体系在70C5min，生成相应的cDNA。2、dNTP，DNA聚合酶，引物，适当的缓冲体系，37C1h，而后95C5min灭活反应体系中的其他杂质，4C保存。 24试述肿瘤的发生机理。
答：1、癌基因（原癌基因）的异常表达。2、抑癌基因的失活，会对癌基因的异常表达失去抑制作用。3细胞在增殖过程由于某些因素使DNA在复制过程中产生碱基错配的基因，由于细胞DNA修复功能的丧失而无法得到校正。4肿瘤转移基因和肿瘤转移抑制基因相互制约的关系发生失调或障碍。5肿瘤细胞免疫功能的
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强弱也与肿瘤的发生相关。
25试述细胞周期调控异常与恶性肿瘤发生的相关性。 答：细胞周期素和CDK等细胞周期相关蛋白过表达或者缺陷，特别是那些决定细胞有G1进入S期的蛋白若表达异常，使细胞周期进程超越或突破细胞周期的控制点，细胞不能正常发生细胞自发产生的细胞死亡，衰老或分化，从而造成细胞恶性增生，形成恶性肿瘤。P53，Rb等抑癌基因的突变或缺失，与许多恶性肿瘤的发生进展和不良预后相关，如某些生长因子及其受体的高表达与癌基因异常激活有关，特别是一些与信号转导有关的蛋白酶的异常活化，以及抑制细胞凋亡基因的异常表达，均与细胞的恶变相关，如周期素D2在直肠癌中呈高表达。此外，cdk抑制物如P21、P27等基因在恶性肿瘤发生中也都有异常表达（突变，缺陷或失活）。
26试述p53对肿瘤的作用及其机理？
答：P53基因为细胞周期依赖性基因，促进表达的产物为P21蛋白，在细胞静止期表达很低，经有丝分裂刺激后，在G1期开始升高，在G1→S期表达达到高峰，M期含量最低，利于细胞进入分裂期。P21蛋白又是一种cdk抑制因子，确保细胞基因组的稳定性，使细胞在DNA损伤修复期不能进入S期，并抑制他们的活化，推迟细胞周期。P21及时对受损DNA进行修复，若不能修复，则P53基因启动细胞凋亡程序，下调bcl-2，上调bax，诱导细胞凋亡。因此，P53基因是细胞生长停止或凋亡的关卡。若P53基因突变或缺失，则失去对正常细胞的生长调控作用，细胞异常增殖，形成肿瘤。而且这种突变或缺失会遗传给子代，形成遗传性肿瘤高发家族。
27. 试述基因工程的原理和过程？
答：原理：基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。是在体外将外源基因组合到特定载体（病毒、质粒、噬菌体等），并将之导入到原来没有这类分子的宿主体内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。 基本操作步骤：1、从生物体的基因组或cDNA文库中，分离目的基因的DNA片段。2、将目的基因连接到具有自我复制并有选择标记的载体上，形成重组DNA分子。3、将重组DNA分子导入受体细胞。4、将带有重组DNA分子的细胞，通过繁殖和克隆筛选，挑选出具有重组DNA分子的阳性细胞克隆。5、将选出的阳性细胞克隆使目的基因在细胞内进行高效表达。
28运用分子生物学知识，结合本专业，设计一个课题。 答：无标准答案。
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1.何谓蛋白质的等电点？其大小和什么有关系？
答：蛋白质是两性电解质，既可与酸，又可与碱相互作用。溶液中蛋白质的带电情况，与它所处环境的pH值有关。调节溶液的pH值，可以使一个蛋白质带正电或带负电或不带电；在某一pH时，蛋白质分子中所带的正电荷数目与负电荷数相等，即静电荷为零，在电场中不移动，此时溶液的p H值即为该种蛋白质的等电点。
蛋白质的等电点主要取决于该蛋白质的氨基酸组成。含碱性氨基酸多的蛋白质其等电点要比含酸性氨基酸多的蛋白质的等电点高（大）；此外，蛋白质的解离情况与所处环境的pH值、离子强度、离子的种类等有关．所以蛋白质的等电点不是一个精确的固定值，与测定时所用的缓冲液的性质、pH、离子强度等有关。 2.研究发现，多聚一L－Lys在pH7.0呈随机螺旋结构，但在pH10为a螺旋构象，为什么？预测多聚一L－Glu在什么pH条件下为随机螺旋，在什么pH下为a螺旋构象？为什么？
答：在pH7．0时赖氨酸侧链上的ε氨基带正电荷，它们之间的静电排斥作用阻止了a螺旋的形成。在pH10时，由于接近赖氨酸的等电点，侧链是非质子化的状态，允许a螺旋的形成。对多聚一L－Glu来说，在 pH7．0时，由于侧链羧基都带负电荷，它们之间的静电排斥，将干扰a螺旋的形成，应呈随机螺旋状态，在接近谷氨酸侧链的pK值为4．25～4．0时，因谷氨酸的侧链羟基是非质子化的，应呈螺旋构象。
3. 试比较蛋白质的变性作用与沉淀作用。
答：l）蛋白质的变性作用：蛋白质因受某些物理的或化学的因素的影响，分子的空间构象破坏，从而导致其理化性质，生物学活性改变的现象称为蛋白质的变性作用。强酸，强碱，剧烈搅拌，重金属盐类，有机溶剂，脉，肌类，超声波等都可使蛋白质变性。
2）蛋白质的沉淀作用：由于水化层和双电层的存在，蛋白质溶液是一种稳定的胶体溶液。如果向蛋白质溶液中加入某种电解质，以破坏其颗粒表面的双电层或调节溶液的pH，使其达到等电点，蛋白质颗粒因失去电荷变得不稳定而将沉淀析出。这种由于受到某些因素的影响，蛋白质从溶液中析出的作用称为蛋白质的沉淀作用。
如重金属盐类、有机溶剂、生物碱试剂等都可使蛋白质发生沉淀，且不能用透析等方法除去沉淀剂而使蛋白质重新溶解于原来的溶剂中，这种沉淀作用称为不可逆的沉淀作用。如果向蛋白质溶液中加入大量的盐类，如硫酸铰，蛋白质的溶解度逐渐下降，以致从溶液中沉淀出来，若用透析等方法除去使蛋白质沉淀的因素后，可使蛋白质恢复原来的溶解状态。此种沉淀作用称为可逆的沉淀作用。 沉淀的蛋白质不一定变性失活，但变性后的蛋白质一般失去活性
4.多聚L－Leu肽段在二氧杂环己烷（dioxane）存在时可形成a螺旋结构，但多聚L－Ile不能，为什么？
答：因异亮氨酸的β碳原子上有一甲基，干扰了a螺旋结构的形成。在亮氨酸分子中，甲基位于γ碳原子上，远离主链，不会干扰a螺旋结构的形成。
5. 一次突变，某蛋白质分子内的一个丙氨酸转变为缬氨酸导致该蛋白质生物活性的丢失；然而在另一次突变时，由于一个异亮氨酸转变为甘氨酸而使该蛋白质的活性恢复了，请分析可能的原因是什么？
答：第一次突变时丙氨酸转变成了缬氨酸，因后者的侧链较大，使蛋白质的构象
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改变；另一次突变后由于异亮氨酸转变为甘氨酸，甘氨酸的侧链较小（和丙氨酸相似），补偿了第一次突变造成的影响。
6. 甘氨酸是蛋白质进化中高度保守的氨基酸残基吗？为什么？
答：甘氨酸是20种氨基酸中侧链最小的一个氨基酸。正因为如此，它的存在使多肽链能形成紧密的盘绕折叠（to make tight turns）或相互靠近。
7. 从蛋白质的一级结构可预测它的高级结构。下面是一段肽链的氨基酸排列顺序：“L－A－H－T－Y－G－P－F－Z（Q）－A－A－M－C－K－W－E－A－Z（Q）－P－D－G－M－E－C－A－F－H－R”，问：
1）你认为此段肽链的何处会出现在β转角结构？ 2）何处可形成链内（intra－）二硫键？
3）假定上述顺序是一个大的球蛋白分子中的一部分结构，指出D、I、T、A、Z（Q）、K氨基酸残基可能在蛋白质分子的表面还是内部？
答：1）β转角结构很可能出现在7位和19位，即脯氨酸残基处。 2）13位和24位的半肽氨酸之间可能形成二硫键。 3）极性、带电荷的氨基酸如 AsP，Gln，Lys一般在分子的表面，而非极性的氨基酸如Ala，Ile可能在分子内部。苏氨酸尽管有极性，但亲水性指数（hydropathy index）接近零，故它可能在分子表面或分子内。
8. 何谓基因文库？建立 DNA文库（基因组文库）的基本方法是什么？
答：DNA文库（DNA library）是由一个基因组产生的所有 DNA片段克隆的总称。简单地 说，就是把某一基因组DNA切割成成千上万个片段，把这些片段全部克隆。于是，这些DNA片段的全部克隆含有一个生物体的全部遗传信息。就像人类知识都储存在图书馆中一样。建立DNA文库的基本方法是： （1）纯化载体DNA； （2）用相同的限制性内切酶分别切割载体DNA和基因组DNA，并经蔗糖密度梯度离心纯化切割后的基因组DNA片段，去掉太大或过小的片段； （3）将纯化的基因组 DNA片段与切开的载体 DNA混合并连接，产生的“连接混合物”用于转化细菌细胞或包装成噬菌体颗粒。让重组噬菌体转染细菌细胞，这样便产生了含有不同重组DNA分子的一群细菌细胞或噬菌体。从理论上讲，几乎所有的这个基因组的DNA都可能存在于这个DNA文库中。以这种方法建立的“DNA图书馆” 叫做“基因组文库”。每个细菌细胞生长成一个菌落或称一个“克隆”；每个“克隆” 中的细胞含有相同的重组DNA分子。在噬菌体构成的“文库” 中，每个重组噬菌体产生一个噬菌斑，即琼脂培养基上细菌“草坪” 中细胞被溶解产生的半透明的环斑。在一个噬菌斑中的所有重组噬菌体都是相同的。 1、DNA印迹技术
Southern blotting 又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，亦可用于分析重组质粒和噬菌体。 在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
SDS Pr.EK 酚/氯仿 限制性内切酶 电泳
基本方法：tissue E解液 DNA 酶切片段
条带 印迹转移 取膜 杂交 显示
其中印迹转移是一夜的时间，要保证DNA完全转移，可用EB染色显示红色来
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测验。 （2）RNA印渍技术
Northern blotting又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。
主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。 （3）蛋白质印渍技术 Western blotting
又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。 （4）斑点印迹 Dot blotting 斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。 （5）原位杂交 in situ hybridization
即组织原位杂交，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。
PCR即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。温度时间及循环数是如何控制的： PCR变性（94℃，30s） 退火（Tm—5℃，50s） 延伸（72℃，40s） 保温 （72℃，10min）
其中 Tm=4（G+C）+2（A+T）
1变性温度与时间：双链DNA在90—95度变性，1min若低于93度则要延长时间，温度不能过高，E活性受影响，主要取决于GC含量，G+C含量越高，则温度越高，所需时间与DNA分子的长度相关，分子越长，则变性时间越长 2退火温度与时间
一般为40-60度，30-60s，取决于引物的长度，碱基组成及其浓度，还有靶序列长度，可通过公式计算 T=Tm—（5℃～10℃）=4（G+C）+2（A+T）—5℃ 在Tm值允许的范围内，选择较高温度可大大减少引物与模板间的非特异性结合 3延伸温度与时间，一般选择在70-75℃之间，常用72℃过高的延伸温度不利于引物和模板的结合
延伸时间可根据待扩增片段的长度而定，一般1Rb以内的DNA片段延伸1min足够，3-4kb需要3-4min，扩增10kb，则需要延伸15min，延伸时间过长会导致特异性条带的出现，对低浓度的扩增，延伸时间要稍长一些
4循环次数主要取决于模板的浓度，一般为25-40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量随之增多 原理：合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度；
PCR体系基本组成成分：模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs
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Mg2+
1、引物设计原则
1）引物的特异性 2）避开产物的二级结构区 3）长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。 4）G+C含量 一般为40%~60%。Tm=4（G+C）+2（A+T）
5）碱基础随机分布：3′端不应超过3个连续的G或C 6）引物自身，引物之间无二级结构
8）引物的3′端：不可以修饰 9）引物的5′端：可以被修饰，包括：加酶切位点；标记 生物素、荧光、地高辛。10）密码子的简并
PCR的主要用途：目的基因的克隆；基因的体外突变；DNA和RNA的微量分析；DNA序列测定；基因突变分析；
设计实验分析重组子筛选未出现阳性斑的原因；
制备好重组质粒转入感受态细胞，接种于有AMP的培养基上培养，挑取阳性克隆子
无阳性克隆子的原因：1连接不好，不能产生正确的重组子，2感受态细胞有问题3、操作水平不到位（转化时的温度、试剂）4试剂问题
设计实验对照 1以同体积无菌水代替重组子2以同体积正常的重组质粒溶液 实验组：样本重组质粒 结果出现情况： N P S 1 × √ √&× 2 √ × √ 3 × × × 出现:1结果若无阳性，则连接产物不好2说明全污染3为感受态细胞不好或操作有问题
一.PCR出现假阳性原因：
1.引物设计不合适；1.选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，从而扩增出非目的性序列的PCR产物。2.靶序列太短或引物太短导致特异性不强。解决方案：选择特异性强的区段设计引物。 2.靶序列或扩增产物的交叉污染。（1）整个基因组或大片段的污染；1.操作时小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管污染环境。2.除酶及不耐热物品外，所有试剂及耗材均应高温高压消毒，所用离心管及枪头均应一次性使用。3.必要时，加样本前，反应管及试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。（2）空气中的小片断核酸污染这些小片断比靶序列短，但有一定同源性，可互相拼接，与引物互补后，扩增出PCR产物，导致假阳性出现。解决方案：运用巢式PCR来减轻或消除。 二、.出现假阴性； 1．模板因素：（1）模板中含有杂蛋白；（2）模板中含有Taq酶抑制剂；（3）模板中蛋白质残留，特别是染色体中的组蛋 白残留；（4）提取制备模板时丢失过多；（5）模板核酸变性不彻底。模板因素引起假阴性解决方案：1.配制有效而稳定的消化处理液;2.提取程序固定,不宜随意改动；3.模板DNA的溶解液应固定不变。
2．酶失活：1.酶本身的质量问题(供应商的问题）；2.酶存放时间太长；3.酶存放方式不当，或其他意外原因；4.忘记添加Taq酶。酶失活引起假阴性解决方案：1.检查加样程序及过程，看是否忘记加Taq酶；2.更换新的Taq酶;3.新旧两种Taq
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酶同时使用。
3．引物：1.引物质量；2.引物浓度；3.两条引物的浓度是否对称等。引物引起假阴性解决方案:1.选定一个好的引物合成单位;2.引物浓度不仅要看OD值，稀释时更要平衡其摩尔浓度；3.引物应高浓度小量分装保存，防止反复冻融或长期冷冻保存，导致引物的变质降解失效，也可要求合成单位将固体分装；4.引物设计不合理，如长度不够，引物本身或两条引物之间形成二聚体等。
4．Mg2+浓度：Mg2+浓度对PCR扩增效率影响极大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性；浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，出现假阴性。 5．反应体积的改变：做小体积PCR后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，而非简单地将反应体系中的各个成分加大几倍，否则易失败。
6．物理原因：1.变性温度低，变性时间短；2.退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率；3.延伸时间过短等。
7．靶序列变异：靶序列变异导致假引性的情况常常发生在靶序列变异正好发生于特异性引物与之结合部的中间，使引物失效。解决方案：根据已知序列重新选择区段设计引物。
1增效PCR（booster PCR）：当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增.消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。 2)巢式PCR（nest PCR）此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。 除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。
3)多重PCR 在同一PCR体系中加入若干对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。 4）RT-PCR RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ng~μg水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。
RAN杂交出现多条带的原因. Nothern bloting杂交的原因
RNA在转录的时进行可变剪接：长度不等，但有部分共同序列，存在保守序列。 该RNA可能是某一多基因家族成员转录的产物。 拷贝数差异：重复基因，重复次数不同
mRNA发生断裂、降解：部分断裂或部分降解，分子量变小，但仍保留与探针接合区。
假阳性：探针特异性不高 杂交条件不严谨：洗膜不彻底
Western bloting杂交出现多条带的原因：后加工问题，蛋白质碱基；表达过程碰到限制；Pr降解。？？
呼吸耗氧量下降的可能原因(滞育) 电子传递和辅酶；
NADH NADH- Q还原酶（Ⅰ）
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FADH2 琥珀酸-Q还原酶（Ⅱ） CoQ cell色素还原酶（Ⅲ）b，c 1
Cell色素c cell色素氧化酶（Ⅳ）a，a3 O2
好氧下降的原因：NADH/ FADH2量不足；H能否传递给aa3；细胞色素氧化酶
等E活性降低；O2供应不足。 糖蛋白中寡糖链的还原端残基与多肽链的氨基酸残基形成两种糖肽键：
N-糖肽键：糖的半缩醛羟基与肽链上的Asn的酰胺基团上的氨基形成N-糖肽键。
O-糖肽键：糖链上的半缩醛羟基与肽链上的Thr, Ser, HyPro, HyLys的羟基形成O-糖肽键；
N－糖链的合成：N-糖链的合成与肽链的合成同时进行,合成部位是粗面内质网和高尔基体；N-糖链的合成的抑制剂是衣霉素；N-糖链的生物合成步骤：合成以酯键相连的寡糖前体（G－寡糖）；将前体转移到正在增长着的肽链上；除去前体的某些糖单位；在剩余的寡糖核心上再加入另外的糖分子。
伴翻译（co-translation):N-糖链合成是和蛋白质肽链的合成同时进行，所以被称为伴翻译。
转化实验 父性遗传
蛋白质分离峰值分析蛋白质提取纯化时的图分析；
乳糖操纵子共3个结构基因，它们一起组成一个转录单位，即LacZAY，它们共用一个启动子PLAC。P是RNA聚合酶识别和结合的部位。在结构基因的上游还有个操纵基因O。Lac1通常位于启动子的上游，表达的蛋白质是通过蛋白质和DNA之间的相互作用来影响转录，称其为调节基因。P不是强启动子，因此要保持高水平转录，结构基因就需要一种专一的活化蛋白，称cAMP受体蛋白或分解代谢活化蛋白（CAP）.这样由P.O.CAP结合位点三部分构成了操纵子的调控区.
转录起始负调控：当乳糖不存在时，细胞内有活性的阻遏蛋白浓度超过诱导剂异构乳糖浓度时，提示LAC操纵子处于阻遏状态。这是因为调节基因LAC1表达的阻遏蛋白与操纵基因结合，阻断了RNA聚合酶通过操纵区的转录启动。当乳糖存在时，作为诱导剂的异构乳糖能与阻遏蛋白结合使具有阻遏活性的四聚体蛋白质转变为无活性的亚基单体，脱离操纵基因而发生转录（总的说来就是有时阻遏无时转录）。 CAP的正性调节：细菌中的CAMP与葡萄糖的分解代谢有关。当细菌利用葡萄糖分解提供能量时，它生成少而分解多，含量低；当无葡萄糖供应时，它含量增加，特异性的与CRP结合，CRP构象变化成CAP ，它能与特异的DNA序列结合，增强RNA酶的转录活性，可提高50多倍。综述：正调节和负调节根据存在的碳源性质及水平来协调操纵子的表达。当阻遏蛋白封闭转录时，CAP不能作用，但如果没有CAP的加强作用，即使阻遏蛋白解聚，转录活性依然不高。 色氨酸操纵子的调节
由该操纵子调节基因TrpR所表达的蛋白质是一个无阻遏活性的二聚体蛋白，该蛋白受周围环境中色氨酸浓度的调节。当色氨酸浓度高时，无需更多表达色氨酸的酶，而色氨酸本身与无活性的阻遏蛋白结合，后者被激活，增加了对操纵基因O的亲和力，封闭操纵基因，色氨酸合成酶系表达被阻断。色氨酸浓度低时，尽管阻遏蛋白存在，但它缺乏色氨酸本身有效浓度的变构激活，此转录。 衰减子细调：转录衰减指转录可正常启动，但当转录进入第一结构基因之前立
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即停止转录的过程。在第一结构基因trpI即翻译起始部位上游开始有162个碱基组成的前导序列，作用就是减弱操纵子的转录作用。如前所述，色氨酸浓度未达到变构无活性阻遏蛋白时，但已经有点多时，先导序列就可以降低转录作用。
父性遗传：特征由雄性亲本的基因或功能自我复制的细胞器单独地传递给子代。例如在动物胚胎中，中心粒来源于受精精子携带的中心粒。Y连锁基因在性别决定和精子形成中起作用。
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生物氧化损伤及其修复
一、生物体内的活性氧 （reactive oxygen species, ROS） 1. 活性氧的种类
1.1 自由基型的ROS：
(1) 超氧阴离子，superoxide anion, (2) 羟自由基，hydroxyl radical, (3) 氢过氧基，hydroperoxyl radical, (4) 烷氧基，alkoxy radical, (5) 烷过氧基，peroxy radical,
(6) 铁酰血红素蛋白基，ferroyl haem protein radical. 1.2 非自由基类型的ROS:
(1) 过氧化氢，hydrogen peroxide, (2) 次溴酸，hypobromous acid, (3) 次氯酸，hypochlorous acid, (4) 臭氧，ozone,
(5) 单线态氧，single oxygen, (6) 氢过氧化物，hydroperoxide. 2. ROS的产生部位
2.1 线粒体电子传递链产生超氧阴离子---约0.2%的呼吸耗氧转换为ROS。 2.1.1 复合体Ⅰ和Ⅲ是产生超氧阴离子的主要部位 2.1.2 复合体Ⅰ中FMN和FAD产生超氧阴离子
2.1.3 泛醌的非酶氧化产生超氧阴离子，复合体Ⅰ和Ⅲ中都含有泛醌，可见泛醌的非酶氧化是产生超氧阴离子的关键。电子传递受阻，是大量产生超氧阴离子的重要原因。
2.1.4 细胞色素产生超氧阴离子---含有亚铁离子的细胞色素辅基血红素极易与氧结合，成为氧合血红素，在进一步解离时产生超氧阴离子。 2.1.5 影响呼吸电子传递链产生超氧阴离子的主要三个因素
(1) 电子传递链的电子传递是否通畅，受阻则超氧阴离子产生量大； (2) 电子传递链上的氧浓度，[O2] 高则超氧阴离子产生量大；
(3) 线粒体的呼吸状态，当ADP耗尽，而氧尚未耗尽时，即状态四超氧阴离子产量最大。
2.1.6 线粒体产生的ROS是维持正常生理功能所必需的。ROS生成与ATP合成偶联。
2.2 微粒体产生超氧阴离子
微粒体 (microsome) 的内质网上NADPH-细胞色素P450还原酶催化NADPH给出电子，其血红素-亚铁在有氧时产生超氧阴离子。 2.3 过氧化物酶体产生过氧化氢
过氧化物歧化酶体（peroxisome）中含有氨基酸氧化酶（amino acid oxidase），催化氨基酸氧化，产生过氧化氢。 2.4 细胞膜产生超氧阴离子
细胞膜上NADPH氧化酶催化产生超氧阴离子，后者起着重要的信号传导与基因表达调节作用。 3. 产生ROS的代谢 3.1超氧阴离子的产生
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3.1.1 非酶性产生
（1）O2氧化Fe2+为Fe3+ 同时产生超氧阴离子，尤其是血红素中亚铁离子与氧的反应。
（2）铜离子可以发生类似反应。
（3）其它成分，如甘油醛、还原型核黄素、FMN、FAD、肾腺上素、四氢蝶呤、半胱氨酸和谷胱甘肽等在氧化时都产生超氧阴离子。 （4）醌类氧化产生超氧阴离子。 3.1.2 酶类反应产生超氧阴离子
约有十多种酶可以催化产生超氧阴离子，如一些过氧化物歧化酶类。其中以下两类酶很重要：
（1）黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase, XO）催化次黄嘌呤、黄嘌呤氧化产生超氧阴离子。
（2）NADPH氧化酶，其产生的超氧阴离子及其继发性ROS在细胞中起着信号传导和基因表达调控作用。 3.2 羟自由基的产生 3.2.1 非酶性产生
（1）水的电离辐射分解
（2）Fenton反应：Fe2+ ＋ H2O2 →·OH ＋OH－＋Fe3+ （3）Haber-Weiss反应 O-2 ＋H2O2→·OH＋OH-＋O2 3.2.2 酶催化产生·OH
（1）髓过氧化物酶-H2O2-卤化物系统 （2）前列腺素合成酶系统 （3）鸟苷酸环化酶系统
3.3 H2O2的产生—酶催化产生为主 （1）超氧化物歧化酶（SOD） （2）黄嘌呤氧化酶（XO）
（3）蛋白激酶C NADPH+O2+H+→NADP+ +H2O2
（4）其它还包括D-氨基酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、单胺氧化酶等 3.4 单线态氧的产生—光敏反应 4. 活性氧的性质 4.1 超氧阴离子
（1）弱氧化剂和弱还原剂。
（2）可以通过细胞膜的阴离子通道进入细胞内，与一些生物分子直接反应，氧化儿茶胺、氧合血红蛋白、抗坏血酸、部分氢醌化合物以及部分含硫蛋白质等；还原高铁细胞色素、高铁血红蛋白、NADPH、氮蓝四唑和部分醌类化合物等。 （3）与金属离子反应生成羟自由基。 4.2 过氧化氢
（1）强氧化剂和弱还原剂。
（2）半衰期长、可选择性跨膜、长距离扩散。 4.3 羟自由基 （1）极强氧化剂
（2）寿命极短、扩散5-10个分子的距离、立即氧化周围的任何生物分子。 二、活性氧对生物分子的损伤和修复
正常人体内存在活性氧造成的氧化损伤：脂质过氧化、DNA氧化和蛋白质氧化产
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物。同时也存在修复损伤的生物分子和重新合成的能力。 （一）活性氧对DNA的损伤和修复 1. DNA结构的损伤 1.1 碱基的损伤
除了超氧阴离子和过氧化氢外都可直接氧化损伤碱基。单线态氧可以迅速氧化嘧啶和鸟嘌呤，羟自由基可以氧化所有四种碱基，产生15种不同产物，包括8-羟基鸟嘌呤。 1.2 糖基破坏
脱氧戊糖的每个碳原子和羟基都可以与羟自由基反应，在碳位置抽氢加氧，破坏糖基结构。 1.3 链断裂
包括单链和双链断裂，主要由于脱氧戊糖被破坏、磷酸二酯键断裂或者碱基的破坏或脱落。
碱基损伤导致双螺旋局部变性，该损伤位点被特异性核酸内切酶识别而被切割，称为酶敏感位点。
损伤的碱基被DNA糖基化酶（glycosylase）除去或者水解除去，形成无嘌呤、嘧啶位点，再由核酸内切酶除去。 1.4 DNA交联
包括链内交联（同一条链中两个碱基共价结合）、链间交联（DNA-DNA交联、DNA-蛋白质交联）
1.5 Fe与Cu离子在自由基损伤DNA中的作用
Fe和Cu离子介导过氧化氢与DNA的相互作用，包括位点专一性和任意攻击性两种。前者是DNA链内的Fe和Cu离子介导，后者是DNA外部Fe和Cu离子介导。 1.6 内源性氧化剂对DNA的损伤及其检测
细胞中8-羟基脱氧鸟苷（8-OH-2-dG）反映DNA氧化损伤增加与修复的平衡量。 2. 参与自由基损伤DNA的修复酶 A. DNA-糖基化酶 OGG1 B. 内切酶Ⅲ和Ⅳ
（二）活性氧对生物膜的损伤与修复
1. PUFA的脂质过氧化（lipid peroxidation） 1.1 PUFA（多元不饱和脂肪酸）被自由基抽氢，形成脂基；不饱和健重排，形成共轭双键，在233nm有特征峰；在不成对电子碳原子上发生过氧化，形成脂过氧基；后者可以连锁反应进行上述反应，或者形成环氧化物，进一步断裂形成醛类或者烃类分子。
1.2 脂质过氧化产物
丙二醛和异前列烷类，后者为衡量整体脂质过氧化的最佳指标。 1.3 丙二醛及其聚合物可以与DNA碱基形成加合物，具有突变作 用。
1.4 后果
A. 形成老年斑 B. 酸败
C. 细胞膜硬化。 1.5 修复
A. 由磷脂氢过氧化物-谷胱甘肽过氧化物酶清除，即LOOH→LOH；
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B. 磷脂酶A2（phospholipase A2）及Ca2+存在下被切去。
C. 谷胱甘肽转硫酶（GST）催化LOOH→LOH，LOH进入脂肪酸代谢。 3. 蛋白质
3.1攻击对象---蛋白质本身或者其氨基酸残基，如：
（1）含有巯基的蛋白质损伤。组氨酸→组氨酸内过氧化物→天冬氨酸盐→天冬酰胺；半胱氨酸→半胱氨酸-二硫化物→混合二硫化物→磺酸、亚磺酸、次磺酸。 （2）金属离子介导的蛋白质损伤 （3）氨基酸残基的氧化修饰 A. 精氨酸→谷氨酸半醛﹢NO B. 赖氨酸→2-氨基己二酸半醛
C. 脯氨酸→谷氨酸半醛→焦谷氨酸盐→谷氨酸盐 D. 甲硫氨酸→甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜
E. 色氨酸→5-羟基色氨酸、犬尿素、N-甲酰犬尿素 F. 酪氨酸→二酪氨酸 G. 苯丙氨酸→酪氨酸 （3）后果
A. 肽链断裂---包括肽链的水解和α-碳原子处直接断裂。 B. 蛋白质交联---二硫鉴或者二酪氨酸。 C. 破坏二级、三级和四级等高级结构。
（3）检测指标---羰基衍生物，仅指可与醛或者酮反应的＞C=O才能称为羰基。产生途径：
A. 赖氨酸与糖反应 B. 蛋白质与醛类反应
C. 赖、精、脯、苏直接氧化。 3. 糖类
单糖自动氧化产生α-羰基和过氧化氢。前者可与DNA、RNA和蛋白质发生交联反应，抗有丝分裂和癌变。
3.2 蛋白质损伤的修复或者重新合成
（1）含巯基蛋白质氧化损伤的修复—巯基二硫化物氧化还原酶系统，包括： A. glutaredoxin， B. GSSG还原酶，
C. 硫氧还蛋白（thioredoxin）， D. 硫氧还蛋白还原酶。 （2）酶催化的氧化损伤蛋白质的降解与重新合成---多功能蛋白酶，可以催化水解A. 碱性氨基酸肽键，B. 疏水性氨基酸肽键，C. 酸性氨基酸肽键。
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