6.1.3.1靛酚蓝比色法 1.方法选择
测定土壤铵态氮,主要有直接蒸馏法、浸提后测定法和扩散吸收法等。直接蒸馏法是在氧化镁存在下直接蒸馏土壤,但此法在弱碱蒸馏时仍可能使一些简单的有机氮微弱水解成氨气蒸出,易使结果偏高。浸提后测定法多采用中性盐(硫酸钾、氯化钾、氯化钠等)浸提土壤,土壤溶液中的NH4+,可选用蒸馏、比色、或氨电极法测定。浸提蒸馏法的操作简便,易于控制条件,适合于NH4+含量较多的土壤。氨气敏电极法测定土壤中的NH4+,操作简便,快速,灵敏度高,重复性和测定范围后很好,但仪器的质量必须可靠。在这里我们详细介绍浸提比色法和扩散吸收法。比色法有多种,这里介绍靛酚蓝比色法。靛酚蓝比色法的灵敏度和准确度高,适用于大批样品自动化分析(本法测定范围~·L-1铵态氮)。扩散吸收法利用氧化镁水悬液的弱碱性,交换吸附在土壤胶体上的铵态氮,不致破坏土壤矿质部分。此法适用于各种类型土壤样品的测定,特别是对于还原性强的沼泽土和潜育土,可省去消除还原性物质的手续,同时,由于扩散吸收法不须蒸馏装置,设备简单,适用于大批样品的分析(本法测定范围50~300μg铵态氮)。 2.基本原理
土壤浸出液中的NH4+在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚作用,生成水溶性染料靛酚蓝,溶液的蓝色很稳定,在NH4+浓度为~·L-1范围内,其深浅与NH4+含量成正比。 3.主要仪器及试剂
主要仪器:振荡机;分光光度计。 主要试剂:
(1)2mol·L-1KCl溶液:称取149.1g氯化钾(KCl,化学纯)溶于水中,稀释至1L。
(2)苯酚溶液:称取10g苯酚(C6H5OH,化学纯)和100mg硝基铁氰化钠(硝普钠)[Na2Fe(CN)5NO·2H2O]稀释至1L【1】。此试剂不稳定,须贮于棕色瓶中,在4℃冰箱中保存。
(3)次氯酸钠碱性溶液:称取10g氢氧化钠(NaOH,化学纯),7.06g磷酸氢二钠(Na2HPO4·7H2O,化学纯),31.8g磷酸钠(Na3PO4·12H2O,化学纯)和 52.5g·L
-1
次氯酸钠(NaOCl,化学纯,即含5%有效氯的漂白粉溶液)10mL溶于水中,稀释至1L,贮于棕色瓶中,在4℃冰箱中保存。
(4)掩蔽剂:将400g·L-1的酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O,化学纯)与100g·L-1的EDTA二钠盐(C10H14O8N2Na2,化学纯)溶液等体积混合。每100mL混合液中加入 10 mol·L-1氢氧化钠,即得清亮的掩蔽剂溶液。
(5)5μg·mL-1铵态氮(NH4+-N)标准溶液:称取0.4717g干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4,分析纯]溶于水中,定容至1L,制备成含铵态氮(N)100μg·mL –1的贮存溶液;使用前将其加水稀释20倍,即配制成含铵态氮(N)5μg·mL –1的标准溶液备用。 4.操作步骤
(1)NH4+浸提【2】:
称取10.00g新鲜土样(若是风干土,过10号筛)准确到0.01g【3】,置于200mL三角瓶中,加入2mol·L-1氯化钾溶液100mL,塞紧塞子,在振荡机上振荡1h。取出静置过滤,待土壤—氯化钾悬浊液澄清后,吸取一定量上层清液进行分析。如果不能在24h内进行,用滤纸过滤悬浊液,将滤液储存在冰箱中备用。同时测定土壤水分含量。 (2)比色:
吸取土壤浸出液1,2mL~10mL(含NH4+-N 2μg~25μg)放入50mL容量瓶中,用氯化钾溶液补充至10mL,用水稀释至30mL,然后依次加入苯酚溶液5mL和次氯酸钠碱性溶液5mL,摇匀。在室温(20℃左右【4】)下放置1h后【5】,加掩蔽剂1mL以溶解可能产生的沉淀物,然后用水定容至刻度。2h后,用1cm比色槽在625nm波长处进行比色,读取吸光度。同时做两个试剂空白试验。
(3)工作曲线的绘制:分别吸取0,,1,2,3,4,5mL NH4+-N标准液于50mL容量瓶中,各加10mL氯化钠溶液,同(2)步骤进行比色测定。得到浓度为0,,,,,, mg·L-1 NH4+-N溶液。 5.结果计算
W(N)式中:
W(N)——土壤中NH4+-N的含量,mg·kg-1;
cVts
mK2c——显色液铵态氮的质量浓度,μg·mL –1; V——显色液的体积,mL; ts——分取倍数,[tsm——样品质量,g;
K2——土样换算为烘干土样的水分换算系数。 6.注意事项
【1】硝普钠是显色反应的催化剂,能加速显色,并增强蓝色及颜色的稳定性,但硝普钠是剧毒药品,使用时应注意安全。
【2】靛酚蓝比色法测定NH4+,也可用测定NO3-时的土壤浸出液,从而节省操作步骤,测定结果可能稍有差异。
待测液体积(mL)100测定时吸取待测液体积(mL)2~10];
【3】土样经风干或烘干后可能引起NH4+含量的变化,所以,称样以新鲜土样为好。若以干土计算,应同时测定含水量后换算。
【4】显色后在20℃左右放置1h,再加入掩蔽剂。过早加入会使显色反应很慢,蓝色偏弱;加入过晚,则生成的氢氧化物沉淀可能老化而不易溶解。
【5】显色过程中,掩蔽剂应在显色后加入。如加入过早,会使显色反应很慢,蓝色偏低;加入过晚,则生成的氢氧化物沉淀可能老化而不以溶解。在20℃放置1h,即可加入掩蔽剂。 6.1.4土壤中硝态氮的测定 1.方法选择
土壤中的NO3-的测定,可用水或中性盐溶液提取,要求制备澄清无色的浸出液。在所用的各种浸提剂中,以饱和CaSO4清液最为简便和有效。浸出液中NO3-可用比色法、电极法和紫外分光光度法等测定。比色法中的酚二磺酸法的操作手续虽较长,但具有较高的灵敏度,测定结果的重现性好,准确度也较高,本方法的测定范围为~·kg-1。醋酸-硝酸试粉比色法,适用于含有氯化物和硝态氮含量较高的土壤。对于肥力较低的土壤(硝态氮5mg·kg-1以下者),不够灵敏。用硝酸根电极测定土壤中NO3-较一般常规法快速和简便。虽然土壤浸出液有各种干扰离子和pH的影响以及液膜本身的不稳定等因素的影响。但其准确度较高,而且有利于流动注射分析。紫外分光光度法,虽然灵敏、快速,但需要价格较高的紫外分光光度计。这里我们只介绍酚二磺酸比色法。 2.基本原理
硝酸根在无水情况下与酚二磺酸作用,在碱性条件下产生分子重排,生成黄色络合物,这种黄色在一定的范围内,是与水样中硝酸根的含量成正比关系,因此可与硝酸根标准溶液比较,进行比色测定。其反应过程如下:
3.主要仪器及试剂
主要仪器:分光光度计;水浴锅;振荡机;瓷蒸发皿。 主要试剂:
(1)酚二磺酸试剂:称取25.0g白色苯酚(C6H5OH,分析纯)置于500mL三角瓶中,以225mL浓硫酸(H2SO4溶解,混匀,瓶口稍盖,至于沸水浴中加热6h,可得酚二磺酸溶液,储于棕色瓶中保存,严防吸湿。试剂冷却后可能析出结晶,用时须重新加热溶解,但不可加水。
(2)10μg·mL-1 NO3--N标准溶液:准确称取0.7218g 硝酸钾(KNO3,分析纯)溶于水,定容1L,此为100μg·mL-1 NO3--N溶液,将此液准确稀释10倍,即为10μg·mL-1 NO3--N标准溶液。
(3)硫酸钙(CaSO4·2H2O,分析纯、粉状)、碳酸钙(CaCO3,分析纯、粉状)、氢氧化钙[Ca(OH)2,分析纯、粉状]、碳酸镁(MgCO3,分析纯、粉状)、硫酸银(Ag2SO4,分析纯、粉状)、活性碳(不含NO3-)。
(4)1:1氨水:氨水(NH3,密度0.90g·mL-1,化学纯)与水等体积混合。 4.操作步骤 (1)浸提
称取50.0g(准确到0.1g)新鲜土样【1】放在500mL三角瓶中,加入0.5g 硫酸钙【2】和250mL蒸馏水,加塞,用振荡机振荡10min。将悬液的上部清液用干滤纸过滤,澄清的滤液收集地干燥洁净的三角瓶中。如果滤液因有机质而呈现颜色,可加活性碳除去【3,4】。 (2)测定
吸取清液 25~50mL(NO3--N 含量不小于)于瓷蒸发皿中,加约0.05g碳酸钙【5】,在水浴上蒸干【6】,到达干燥时不应继续加热。冷却,迅速加入2 mL酚二磺酸试
剂,将皿旋转,使试剂接触到所有的蒸干物。静置10min使其充分作用后,加水20 mL,用玻璃棒搅拌直到蒸干物完全溶解。冷却后缓缓加入1:1 氨水【7】并不断搅混匀,至溶液呈微碱性(溶液显黄色)再多加2mL,以保证氨水过量。然后将溶液全部转入100mL容量瓶中,加水定容。在分光光度计上用光径1cm比色杯在波长420nm处比色,以空白溶液作参比,调节仪器零点。 (3)NO3-工作曲线绘制
分别取10μg·mLNO3-N标准液0,1,2,5,10,15,20mL于蒸发皿中,在水浴上蒸干,与待测液相同操作,进行显色和比色,绘制成标准曲线。 5.结果计算
W(N)式中:
W(N)——土壤中NO3-含量,mg·kg-1;
cVts
mK2-1
-
c——从标准曲线上查得的显色液NO3--N质量浓度,μg·mL-1; V——显色液的体积(mL); ts——分取倍数,[ts待测液体积(mL)250]; 测定时吸取待测液体积(mL)25~50m——风干土样质量,g;
K2——土样换算成烘干土样的水分换算系数。 6.注意事项
【1】土壤经风或烘干易引起NO3-变化,故一般都用新鲜土样测定。如需用干土计算,应同时测定水分含量。
【2】用酚二磺酸法测定硝态氮,首先要求浸提液清彻,不能混浊,但是一般中性或碱性土壤滤液不易澄清,且带有机质的颜色,为此在浸提液中应加入凝聚剂。凝
聚剂的种类很多,有CaO、Ca(OH)2、CaCO3、MgCO3、KAl(SO4)2、CuSO4、CaSO4等,其中CuSO4有防止生物转化的作用,但在过滤前必须以氢氧化钙或碳酸镁除去多余的铜,因此以CaSO4法提取较为方便。
【3】如果土壤浸提液由于有机质而有较深的颜色,则可用活性炭除去,但不宜用H2O2,以防最后显色时反常。
【4】土壤中的亚硝酸根和氯离子是本法的主要干扰离子。亚硝酸和酚二磺酸产生同样的黄色化合物,但一般土壤中亚硝酸含量极少,可忽略不计。必要时可加少量尿素、硫尿和氨基磺酸(20g·L-1NH2SO3H)以除去之。例如亚硝酸根如果超出了1μg·mL-1时,一般每10mL待测液中加入20mg尿素,并放置过夜,以破坏亚硝酸根。
检查亚硝酸根的方法:可取待测液5滴于白瓷板上,加入亚硝酸试粉0.1g,用玻璃棒搅拌后,放置10min,如有红色出现,即有超过1mg·L-1亚硝酸根存在。如果红色极浅或无色,则可省去破坏亚硝酸根的步骤。
Cl-对反应的干扰,主要是加酸后生成亚硝酰氯化合物或其它氯的气体。如果土壤中含氯化合物超过15mg·kg-1,则必须加Ag2SO4除去,方法是每100mL浸出液中加入0.1g Ag2SO4(0.1g Ag2SO4可沉淀 Cl-),摇动15min,然后加入0.2g Ca(OH)2及0.5g MgCO3,以沉过量的银,摇动5min后过滤,继续按蒸干显色步骤进行。 【5】在蒸干过程中加入碳酸钙是为了防止硝态氮的损失。因为在酸性和中性条件下蒸干易导致硝酸根的分解,如果浸出液中含铵盐较多,更易产生负误差。 【6】此反应必须在无水条件下才能完成,因此反应前必须蒸干。
【7】碱化时应用NH4OH,而不用NaOH或KOH,是因为NH3能与Ag+络合成水溶性的[ (NH3)2]+,不致生成Ag2O的黑色沉淀而影响比色。
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