鱼金口服液体外抗病毒实验研究

４０　西北药学杂志２０１０年２月　第２５卷第１期　鱼金口服液体外抗病毒实验研究　赵　进　，王　莉　，田日升。，王宇鹏　（１．西安交通大学医　学院机能实验中心，陕西西安７１００６１；２．陕西省高陵县计化　生育服务站，陕西高陵７１０２００；３．陕西省高陵县人民医院，　陕西高陵７１０２００；４．陕西省杨凌东科麦迪森制药有限公司，　陕西杨凌７１００２１）　２　方法＿１］　根据中药“新药研究指南”，采用鸡胚培养法和血　球凝集实验检测药物抗流感病毒作用；采用组织培养　法检测药物抗腺病毒作用。全部实验设立病毒、阳性　药物及正常对照。　２．１体外抗流感病毒ＦＭ１株作用测定　２．１．１药物对鸡胚毒性作用的观察＿２　将鱼金口服　液用Ｈａｎｋ　Ｓ液进行５倍连续梯度稀释，每一稀释度　分别接种３个鸡胚尿囊腔，每胚０．２　ｍＬ。同时用　摘要：目的研究鱼金口服液的体外抗病毒作用。方法　采　用鸡胚培养法和血球凝集实验检测鱼金口服液抗流感病毒作　用；采用组织培养法检测鱼金口服液抗腺病毒作用。结果　以１　ｍＬ相当于生药计，对流感病毒ＦＭ１的最小直接灭活浓　度、对ＦＭ１在鸡胚内增殖的最小抑制浓度以及对ＦＭ１在鸡　胚内增殖的最小有效预防浓度均为０．１　ｇ；对Ａｄ３的最小直　接灭活浓度为Ｏ．０２　ｇ，对Ａｄ３在Ｈｅｐ一２细胞内增殖的最小抑　制浓度为Ｏ．Ｏ１　ｇ，对Ａｄ３在Ｈｅｐ一２内增殖的最小有效预防浓　度为０．０４　ｇ。结论鱼金口服液有一定的体外抗病毒作用。　关键词：鱼金口服液；甲型流感病毒ＦＭ１株；腺病毒３型（Ａｄ３）　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４—２４０７．２０１０．０１．０２３　中图分类号：Ｒ９６５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００４－２４０７（２０１０）０１—００４０－０２　鱼金口服液是由鱼腥草、金银花提取的纯中药制　剂，具有抑菌、抗病毒、解热之功效，临床主要用于支　气管肺炎、病毒性肺炎、上呼吸道感染等。笔者主要　通过多项实验观察其体外抗病毒作用。　１仪器与材料　１．１　仪器ＤＹ—ＩＩ酶标测定仪（华光光学仪器厂）；　ＣＯ　培养箱（Ｅ一１９１ＴＣ，德国ＳＩＭ公司）；普通培养箱　（ＧＮＰ一９１６０型，上海精宏实验设备有限公司）；ＤＩＣ—　ＣＯ一２０Ａ二氧化碳培养仪（日本ＤＩＣＣＯ株式会社）。　１．２　药物　鱼金口服液（１　ｍＬ相当生药１　ｇ，西安新　通药物研究有限公司，规格１０　ｍＬ／支，批号　０８０７１８）；病毒唑注射液（华北制药秦皇岛有限公司，　规格０．１　ｇ／支，批号０８１０５６）。　１．３　动物及病毒株　鸡胚（９～１１日龄胚），购自西　安集秦肉鸡公司；Ｈｅｐ－２传代细胞株，本室常规传代保　存；鸡红细胞：采健康公鸡血，抗凝，以生理盐水（１　５００　ｒ·ｍｉｎ　）洗涤３次后配成０．５　鸡红细胞悬液；甲　型流感病毒ＦＭ１株，腺病毒３型（Ａｄ３），购自中国医　科院北京病毒研究所，由西安交通大学机能实验中心　传代保存。　病毒株复毒及效价测定：将流感病毒ＦＭ１株接　种于９日龄鸡胚尿囊腔，３７℃孵育７２　ｈ，收获尿囊　液，用血球凝集实验测定尿囊液中流感病毒滴度。将　腺病毒３型接种于Ｈｅｐ一２细胞单层，３７℃孵育７２　ｈ。　收获感染细胞，超声粉碎。１０倍连续梯度稀释后接　种Ｈｅｐ一２细胞，测定空斑形成单位。病毒液分装后　４Ｏ℃保存备用。流感病毒ＦＭ１株滴度：５　１２０血凝　单位／ｍＬ。腺病毒３型滴度：５．１×１０　ＰＦＵ·ｍＬ＿。。　Ｈａｎｋｓ液接种作为正常对照。３７。Ｃ孵育７２　ｈ，观察　鸡胚发育状况。以鸡胚健康存活组药物最大浓度作　为实验最大用药浓度。　２．１．２药物对流感病毒ＦＭ１株增殖的抑制作用测　定设受试药物梯度浓度实验组、阳性药物对照组、　病毒对照组和正常对照组。　Ａ组：测定药液对病毒的最小直接灭活浓度。用　Ｈａｎｋｓ液将流感病毒ＦＭ１株病毒液稀释为２　０００血凝　单位／ｍＬ，分别与各梯度稀释的实验药液、对照药液（２　ｇ·Ｌ　病毒唑）等体积混合，于室温下作用４　ｈ；用　Ｈａｎｋｓ液将作用液稀释５０倍后接种于鸡胚尿囊腔，０．２　ｍＬ／胚，每一作用液平行接种６个鸡胚。病毒对照组接　种４０血凝单位／ｎ１ＩＪ，ＦＭ１病毒液０．２　ｍＬ／胚。于３７℃　孵育７２　ｈ，收获鸡胚尿囊液，用血球凝集实验测定ＦＭ１　滴度。与病毒对照组比较，能明显降低病毒滴度的最　小药物浓度为对病毒的最小直接灭活浓度。　Ｂ组：测定药液对病毒在鸡胚内增殖的最小抑制　浓度。用Ｈａｎｋ＇ｓ液将流感病毒ＦＭ１株病毒液稀释为　４０血凝单位／ｍＬ，接种于鸡胚尿囊腔０．２　ｍＬ。２　ｈ后，　将不同梯度稀释的实验药液以及对照药液（２　ｇ·Ｌ　病毒唑）再接种于已接种过病毒的鸡胚尿囊腔，０．２　ｍＬ／胚，同一浓度药液平行接种６个鸡胚。病毒对照　组接种Ｈａｎｋ　Ｓ液。３７。Ｃ孵育７２　ｈ，收获鸡胚尿囊　液，用血球凝集实验测定ＦＭ１滴度。与病毒对照组　比较，能明显降低病毒滴度的最小药物浓度为对病毒　增殖的最小抑制浓度。　Ｃ组：测定药液对病毒在鸡胚内增殖的最小有效　预防浓度。先将各梯度稀释的实验药液以及对照药液　（２　ｇ·Ｌ　病毒唑）Ｏ．２　ｍＬ接种于鸡胚尿囊腔，同一浓　度药液平行接种６个鸡胚。病毒对照组接种Ｈａｎｋ　Ｓ　液。于３７℃孵育１２　ｈ后，接种４０血凝单位／ｍＬ，ＦＭ１　病毒液０．２　ｍＬ。于３７。Ｃ孵育７２　ｈ，收获鸡胚尿囊液，　用血球凝集实验测定ＦＭ１滴度。与病毒对照组比　较，能明显降低病毒滴度的最小药物浓度为对病毒增　殖的最小有效预防浓度。　２．２　体外抗腺病毒（Ａｄ３）作用测定　２．２．１　药液对Ｈｅｐ一２细胞的毒性测定＿３　将药液　用细胞培养液进行连续５倍梯度稀释。每一梯度稀　释液分别加到６孔已长好的Ｈｅｐ一２细胞单层（２４孔　西北药学杂志２０１０年２月　第２５卷第１期　４１　表１鱼金口服液对流感病毒ＦＭ１株的作用（ｉ士　，ｎ＝６）　细胞培养板），每孔１．０　ｍＬ。同时设正常细胞对照，　置５　ＣＯ：、３７。Ｃ培养，逐日倒置显微镜下观察。５　ｄ　后细胞形态学典型，无细胞病变（ＣＰＥ）出现的药物最　大浓度为药物对细胞最大无毒浓度。　２．２．２药液对Ａｄ３致细胞病变的抑制作用　Ａ组：　测定药液对病毒的最小直接灭活浓度。将ＡＤ３与各　梯度稀释药液、对照药液混合，于室温下作用４　ｈ，接种　Ｈｅｐ－２细胞单层，每稀释度平行接种６孔（２４孔细胞　培养板），０．５　ｍＬ／￣Ｌ。于３７℃吸附３０　ｍｉｎ，Ｈａｎｋ　Ｓ　液冲洗３次。加入融化保温于５０℃的０．５　琼脂糖　细胞维持凝胶液１．０　ｍＬ。　Ｂ组：测定药液对病毒在细胞内增殖的最小抑制　浓度。将腺病毒３型接种至Ｈｅｐ一２细胞单层，（０．５　ｍＬ），３７℃吸附３０　ｍｉｎ，弃去病毒液，Ｈａｎｋ　Ｓ液冲洗　３次。用融化保温于５Ｏ℃的０．５　琼脂糖细胞维持　凝胶液快速将实验药液以及对照药液做梯度稀释，趁　热加入到已接种过病毒的Ｈｅｐ一２细胞单层，（１．０　ｍＬ），同一稀释度药液平行加６孔。　Ｃ组：测定药液对病毒在细胞内增殖的最小有效　预防浓度。将各梯度稀释药液以及对照药液加于　Ｈｅｐ一２细胞单层（１．０　ｍＬ／￣Ｌ）每一稀释度平行加６　孑Ｌ。５　ＣＯ　、３７℃孵育１２　ｈ，弃去药液。用Ｈａｎｋ　Ｓ　液冲洗２次。接种腺病毒３型０．５　ｍＬ，３７。Ｃ吸附３Ｏ　ｍｉｎ，弃去病毒液，用Ｈａｎｋ　Ｓ液冲洗３次。加入融化　保温于５０℃的０．５　琼脂糖细胞维持凝胶液（１．０　ｍＬ）。设病毒对照、阳性药物对照和正常细胞对照。　５　，ｏ４　ＣＯ　、３７。Ｃ培养５　ｄ。０．５　台盼兰染色，镜下计　数形成的病毒空斑数。与病毒对照组比较，能明显降　低病毒空斑数的最小药物浓度为对病毒增殖的最小　有效预防浓度。　３　结果　３．１　鱼金口服液体外抗流感病毒ＦＭ１株实验结果　３．１．１　药物对鸡胚的最大无毒浓度　接种药物后每　日观察鸡胚发育存活情况，２４　ｈ内死亡属于非特异　性死亡。７２　ｈ后取胚观察。正常对照组鸡胚全部存　活，发育良好。１００　药液实验组中鸡胚死亡，胚体　小，并有明显出血斑点，以下各浓度组中的鸡胚发育　正常。　鱼金口服液对９日龄鸡胚的最大无毒浓度为１　ｍＬ相当于生药０．２　ｇ（０．２　ｍＥ／胚）。　３．１．２对甲型流感病毒ＦＭ１株的抑制作用　见表　１。由表１可知，鱼金口服液对流感病毒ＦＭ１的最小　直接灭活浓度、对ＦＭ１在鸡胚内增殖的最小抑制浓　度以及对ＦＭ１在鸡胚内增殖的最小有效预防浓度均　为１　ｍＬ相当于生药０．１　ｇ。　３．２　鱼金口服液体外抗腺病毒（Ａｄ３）作用　３．２．１对Ｈｅｐ一２细胞的毒性作用结果见表２。　表２鱼金口服液对Ｈｅｐ．－２细胞的毒性作用　注：（一）细胞生长良好，形态基本正常；（＋）细胞轻度病变；（＋＋）细胞圆缩　由表２可知，鱼金口服液对Ｈｅｐ一２细胞的最大　无毒浓度为１　ｍＬ相当于生药０．２　ｇ。阳性对照药病　毒唑实验浓度对Ｈｅｐ一２细胞无毒性作用。　３．２。２对Ａｄ３的作用　结果见表３。由表３可知，　鱼金口服液对Ａｄ３的最小直接灭活浓度为１　ｍＬ相　当于生药０．０２　ｇ，对Ａｄ３在Ｈｅｐ－２细胞内增殖的最　小抑制浓度为１　ｍＬ相当于生药０．０１　ｇ，对Ａｄ３在　Ｈｅｐ一２内增殖的最小有效预防浓度为１　ｍＬ相当于　生药０．０４　ｇ。　表３鱼金口服液对腺病毒Ａｄ３作用测定结果（ｉ士　，ｎ＝６）　注：与霸毒对照组相比，　Ｐ＜０．０５　４　结论　以１　ｍＬ相当生药计，鱼金口服液对流感病毒　ＦＭ１的最小直接灭活浓度、对ＦＭ１在鸡胚内增殖的　最小抑制浓度以及对ＦＭ１在鸡胚内增殖的最小有效　预防浓度均为０．１　ｇ。鱼金口服液对Ａｄ３的最小直　接灭活浓度为０．０２　ｇ，对Ａｄ３在Ｈｅｐ一２细胞内增殖　的最小抑制浓度为０．０１　ｇ，对Ａｄ３在Ｈｅｐ－２内增殖　的最小有效预防浓度为０．０４　ｇ。　参考文献：　［１］中药新药研究指南Ｅｚ］．１９９８：６７—６８，７１，１１８．　［２］陈奇．中药药理研究方法学［Ｍ］．北京：人民卫生出版　社，１９９３：２３９，２６５—２６８，２８２－２８６．　［３］徐叔云．药理实验方法学．３版．北京：人民卫生出版社，　２００２：８８２，１３６３，１４２６—１４３３，１７２０－１７２９．　（收稿日期：２００９—０８—０１）