FQ-PCR和ELISA法检测HBV标志物的比较

维普资讯 http://www.cqvip.com 检验医学与临床２００７年８月第４卷第８期Ｌａｂ　Ｍｅｄ　Ｃｌｉｎ，Ａｕｇｕｓｔ　２００７，Ｖｏｌ　４，Ｎｏ　８　７０５　ＦＱ．ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ法　检测ＨＢＶ标志物的比较　徐星洋　（江苏省靖江市人民医院靖城分院检验科２１４５００）　【摘要】　目的　了解乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染不同血清学标本酶联免疫吸附反应（ＥｕＳＡ）阳性与ＨＢＶ～ＤＮＡ　阳性结果的比较情况。方法对２００例血清同时进行荧光定量聚合酶链反应（ＦＱ－ＰＣＲ）检测ＨＢＶ－ＤＮＡ及ＥＬＩＳＡ　方法测定ＨＢＶＭ。结果　乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）阳性组ＨＢＶ—ＤＮＡ阳性率为８Ｏ．７　（１４６／１８１），ＨＢ—　ｓＡｇ（一）组ＨＢＶ—ＤＮＡ阳性率为５．６　（１／１８），二者差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．００１）。其中７５例ＨＢｓＡｇ、乙型肝炎　病毒ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）、乙型肝炎病毒核心抗原（ＨＢｃＡｇ）均为阳性的血清ＨＢＶ—ＤＮＡ阳性率为１００．０　（７５／７５），　ＨＢｓＡｇ、乙型肝炎病毒抗体（抗一ＨＢｅ）、乙型肝炎病毒核心抗体（抗一ＨＢｃ）均为阳性组血清ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率为　７７．９　（４６／５９），ＨＢｓＡｇ（＋）、抗一ＨＢｃ（＋）组血清ＨＢＶ—ＤＮＡ阳性率为５３．２　（２５／４７），乙型肝炎病毒表面抗体（抗一　ＨＢｓ）阳性、抗一ＨＢｅ（＋）、ＨＢｃＡｇ（＋）组血清ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率为１２．５　（１／８）。结论ＥＬＩＳＡ检测结果相同的患　者，其体内ＨＢＶ—ＤＮＡ的复制情况存在很大的差别。判断肝脏中ＨＢＶ复制及有无传染性依据ＨＢｓＡｇ阳性或　ＨＢｅＡｇ阳性是不够的，易造成部分乙型肝炎的漏诊。对于ＨＢｓＡｇ阴性只要有ＨＢＶ感染后的任何血清学依据，都　应检测血清ＨＢＶ－ＤＮＡ作为诊断乙型病毒性肝炎的进一步筛选，必要时应同时行肝活检加以证实。　【关键词】　乙型肝炎病毒；　聚合酶链反应；　脱氧核糖核酸　中图分类号：Ｒ５１２．６２　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７２—９４５５（２００７）０８－７０５—０２　Ｔｈｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ＦＱ－ＰＣＲ　ａｎｄ　ＥＬＩＳＡ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ＨＢＶ　ｍａｒｋｅｒｓ　ＸＵ　Ｘｉｎｇ—ｙａｎｇ．Ｄｅｐａｒｔｍａｎｔ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏ—　ｒｙ，ｊｉｎｇｃｈｅｎｇ　Ｂｒａｎｃｈ，ｔｈｅ　Ｐｅｏｐｌｅ　ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｊｉｎｇｊｉａｎｇ　Ｃｉｔｙ，Ｊｉｎｇｊｉａｎｇ　２１４５００，Ｃｈｉｎａ　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＬＩＳＡ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ＨＢＶ　ｍａｒｋｅｒｓ　ａｎｄ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ　ｔｈｅｍ　ｗｉｔｈ　ＨＢＶ—ＤＮＡ　ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＦＱ－ＰＣＲ　ａｎｄ　ＥＬＩＳＡ　ａｓｓａｙ　ｗｅｒｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｔｏ　ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　２００　ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｆｏｒ　ＨＢＶＭ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ＨＢＶ—ＤＮＡ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＨＢｓＡｇ（＋）ａｎｄ　ＨＢｓＡｇ（一）ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　８０．７％（１４６／１８１）ａｎｄ　５．６　（１／１８），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ＨＢＶ—ＤＮＡ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜Ｏ．００１）．Ｔｈｅ　ＨＢＶ—ＤＮＡ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＨＢｓＡｇ（＋）／ＨＢｅＡｇ（＋）／ＨＢｃＡｇ（＋）ｇｒｏｕｐ，　ＨＢｓＡｇ（＋）／ａｎｔｉ—ＨＢｅ（＋）／ａｎｔｉ—ＨＢｃ（＋）ｇｒｏｕｐ，ＨＢｓＡｇ（＋）／ａｎｔｉ—ＨＢｃ（＋）ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ　ａｎｔｉ—ＨＢｓ（＋）／ａｎｔｉ—ＨＢｅ　（＋）／ＨＢｃＡｇ（＋）ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　１００．０　（７５／７５），７７．９　（４６／５９），５３．２　（２５／４７）ａｎｄ　１２．５　（１／８），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎ－　ｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅｒｅ　ｍａｙ　ｂｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ＨＢＶ－ＤＮＡ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｗｈｅｎ　ＥＬＩＳＡ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ．Ｓｉｍｐｌｅ　ＨＢｓＡｇ（＋）ｏｒ　ＨＢｅＡｇ（＋）ｉｓ　ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｔｏ　ｄｉｇｎｏｓｅ　ＨＢＶ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＨＢＶ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｅｖｅｎ　ｔｏ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＨＢ—　ｓＡｇ（一），ｉｆ　ｔｈｅｒｅ　ｉｓ　ａｎｙ　ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ＨＢＶ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｓｅｒｕｍ　ＨＢＶ—ＤＮＡ　ｏｕｇｈｔ　ｔｏ　ｂｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｖｉｒａｌ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ，ａｎｄ　ｌｉｖｅｒ　ｂｉｏｐｓｙ　ｍａｙ　ｂｅ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　ｃｏｎｆｉｒｍ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｉｆ　ｎｅｃｅｓｓａｒｙ。　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　ｖｉｒａｌ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ；　ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｄｅｉｃ　ａｃｉｄ　目前，用于检测乙型肝炎的常用方法很多，临床上证实存　于采用荧光技术和闭管检测，克服了常规ＰｃＲ的缺点，并取代　以往ＥＬＩＳＡ定性方法对于ＨＢＶ的检测。本文采用此法对　在乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染的最简便易行的方法是ＨＢＶ标　志物的检测。ＨＢＶ—ＤＮＡ检测经历了直接杂交法、ＤＮＡ信号　扩增技术及聚合酶链反应（ＰＣＲ）和酶联免疫吸附试验　（ＥＬＩＳＡ）等［１　］，由于其灵敏度低、试剂成本高或易导致交叉污　染等原因，近年发展起来的荧光定量ＰＣＲ（ＦＱ－ＰＣＲ）技术，由　２００例肝胆科住院患者进行了ＨＢＶ检测，同时对照ＥＬＩＳＡ分　析其检测结果，现报道如下。　１资料与方法　１。１　临床资料　血清标本取自２００３年２月至２００４年２月　得商榷。　本研究例数少，可能存在实验误差，需更大规模、多中心同　类实验来证实，且更需要病理、分子生物学等多学科的研究依　据来支持，相信这将成为研究的又一方向。　ＥＪ－Ｉ．中华内科杂志，２００３，４２（５）：４５１—４５２．　２朱元珏，陈文彬．呼吸病学［Ｍ－Ｉ。北京：人民卫生出版社，　２００３。８５４．　（收稿日期：２００７—０３—１９）　参考文献　１　赖克方，钟南山．加强不明原因慢性咳嗽的病因诊断研究　维普资讯 http://www.cqvip.com ７０６　检验医学与Ｉ临床２００７年８月第４卷第８期Ｌａｂ　Ｍｅｄ　Ｃｌｉｎ，Ａｕｇｕｓｔ　２００７，Ｖｏｌ　４，Ｎｏ　８　２００例肝胆科住院患者，其中肝癌１７例、肝硬化门脉高压症１９　例、肝硬化１８例、急性肝炎９５例、慢性肝炎３３例、胆石症５　例、胆囊炎３例、其他疾病１Ｏ例。　１．２仪器与试剂　ＦＸ９９０　ＰＣＲ荧光检测仪由上海三科仪器　有限公司生产。ＨＢＶ核酸扩增荧光定量检测试剂盒内含拷贝　数分别为２．５×１０　、２×１Ｏ　、２×１Ｏ　、２×１Ｏ　的阳性标准品；　ＨＢＶ阴性对照血清；临界阳性对照血清。其中引物序列为：　Ｐ１：５＇－ＡＴＣ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＡ　ＴＧＣ　ＣＴＣ　ＡＴＣ　ＴＴ＿３　，Ｐ２：５　一　ＨＢＶ被清除的标志，并且机体出现了抵抗ＨＢＶ的免疫力［３］。　但是许多专著报道了ＨＢｓＡｇ阴性的ＨＢＶ感染，如Ｌｕｏ等在　一组ＨＢｓＡｇ阴性的慢性肝病患者中检测ＨＢＶ－ＤＮＡ，抗一ＨＢｓ　阳性者血清检出率为２９　（９／３１），肝内检出率为６５　（１３／　２０），李成忠等报道５例抗－ＨＢｓ阳性的慢性肝病患者经肝活检　在肝组织中检出乙型肝炎病毒抗原。Ｐａｏ等以ＰＣＲ法检测近　千例非肝病门诊患者中，ＨＢｓＡｇ阴性组ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率为　１１．０　，其中单一抗一ＨＢｓ阳性者ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率１１．８　（９／７６）　］。本文通过ＦＱ－ＰＣＲ法检测ＨＢＶ感染后不同血清　ＡＣＡ　ＧＴＧ　ＧＧＧ　ＧＡＡ　ＡＧＣ　ＣＣＴ　ＡＣＧ　ＡＡ＿３　；荧光探针序列　为：５　一ＴＧＧ　ｃＡＧ　ＴＴＴ　ＡＣＴ　ＡＧＴ　ＧＣＣ　ＡＴＴ　ＴＧ－３　（匹基生物　技术公司）。ＨＢＶ　ＥＬＩＳＡ试剂盒为上海科华试剂公司产品。　学指标ＥＬＩＳＡ阳性组合ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率，结果表明７５例　ＨＢｓＡｇ（＋）、ＨＢｅＡｇ（＋）、ＨＢｃＡｇ（＋）血清ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性　率为１００　（７５／７５），提示ＨＢＶ复制活跃与传染性强，易于检　出。另有１例（１２．５　）ＨＢｓＡｇ（一）患者ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性，表　１．３　ＨＢＶ－ＤＮＡ检测方法　采用定量聚合酶链反应结合　Ｔａｑｍａｎ荧光技术，对ＨＢＶ的特异性ＤＮＡ核酸片段进行定量　检测，阴性对照、阳性标准品、临界阳性对照血清及各样品共同　进行ＦＯ－ＰＣＲ，步骤按操作说明书进行。　２　结　果　明单凭ＥＬＩＳＡ检测ＨＢｓＡｇ是不够的。少数ＨＢｓＡｇ（一）患者　血清中仍含有一定的病毒量，可能由于ＨＢＶ的ｓ区点突变，　从而导致ＨＢｓＡｇ抗原性改变，使ＨＢｓＡｇ不能被检出，而　ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性标准　２．１　ＨＢＶ－ＤＮＡ的ＦＱ－ＰＣＲ标准曲线ＨＢＶ前Ｃ区基因变异，使ＨＢｅＡｇ不能表达但病毒本身复制　不受影响。ＨＢｓＡｇ（＋）组有３５例（１９．３　）ＨＢＶ－ＤＮＡ阴性，　可能是ＨＢＶ－ＤＮＡ整合于宿主细胞基因组，或基因变异，所用　品以起始拷贝数的自然对数为横坐标，以循环数（ＣＴ）为纵坐　标，能够得出一条直线型标准曲线，其斜率ｋ一一３．５，相关系　数ｒ一０．９９９。　２．２　ＨＢＶ的ＥＬＩｓＡ和ＦＱ－ＰＣＲ检测结果见表１。　表１　两种方法检测肝胆科ＨＢＶ标志物的比较　ＰＣＲ引物不匹配，未能检出，但仍可表达ＨＢｓＡｇ。一般观点　抗一ＨＢｓ（＋）、抗一ＨＢｅ（＋）、抗一ＨＢｃ（＋）表明患者进入恢复期　或痊愈期，但本文结果此组患者中仍有一人阳性，其原因可能　是由于ＨＢＶ病毒由野生株变为突变株所导致。判断肝脏中　ＨＢＶ复制及有无传染性依据ＨＢｓＡｇ（＋）或ＨＢｅＡｇ（＋）是不　够的，易造成部分乙型病毒性肝炎的漏诊ｌ＿５］。对于ＨＢｓＡｇ　（一）只要有ＨＢＶ感染后的任何血清学依据，都应检测血清　ＨＢＶ－ＤＮＡ作为诊断乙型病毒性肝炎的进一步筛选，必要时应　对可疑患者ＨＢｓＡｇ（一）、ＨＢＶ－ＤＮＡ（＋）进行肝活检，明确病　变性质。因此动态监测ＨＢＶ－ＤＮＡ的含量对治疗、控制乙肝　病情的发展显得尤为重要。　参考文献　１　黄呈辉，刘德恭，汪俊滔．ＨＢＶ　ＤＮＡ定量检测及临床应用　的研究进展Ｉ－Ｊ］．国外医学流行病学与传染病学分册，１９９６，　２．３　ＨＢＶ检测结果与临床疾病的关系　２００例患者中，肝癌　１７例，ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性１４例（８２．４　）；肝硬化门脉高压症１９　例，ＨＢｖ＿ＤＮＡ阳性１３例（６８．４　）；肝硬化１８例，ＨＢｖ＿ＤＮＡ　２３（３）：１５４—１５７．　２　陶志华，陈晓东，王忠永，等．乙型肝炎病毒ＤＮＡ荧光定量　ＰＣＲ的建立与应用［Ｊ］．临床检验杂志，２００２，２０（５）：２８２—　２８４．　阳性１５例（８３．３　）；急性肝炎９５例，ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性２４例　（７２．７　）；慢性肝炎３３例，ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性２４例（７２．４　），与　乙型肝炎有密切关系。另１８例为其他疾病，与乙型肝炎无关。　３李玉华，张忠英，刘莉莉，等．荧光定量ＰＣＲ检测ＨＢＶ－　ＤＮＡ的临床意义［Ｊ］．临床检验杂志，２００１，１９（４）：２３４．　４　Ｐａｏ　ＣＣ，Ｙａｏ　ＤＳ，Ｌｉｎ　ＣＹ，ｅｔ　ａ１．Ｓｅｒｕｍ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ　ｉｎ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ　ｐａ—　２．４　ＨＢＶ感染的不同血清学指标ＥＬＩＳＡ阳性组合与ＨＢＶ－　ＤＮＡ的检测结果ＨＢｓＡｇ（＋）组检出ＨＢＶ－ＤＮＡ（＋）１４６　例，阴性３５例；ＨＢｓＡｇ（一）组检出ＨＢＶ－ＤＮＡ（＋）１１例、阴性　１８例。ＨＢｅＡｇ（＋）组检出ＨＢＶ－ＤＮＡ（＋）７５例，阴性０例；　ＨＢｅＡｇ（一）组检出ＨＢＶ－ＤＮＡ　性７２例，阴性５３例。　３讨　论　ｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｎｏｒｍａｌ　ｌｉｖｅｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｐａｔｈｏｌ，　１９９１，９５（４）：５９１－５９６．　５杨世明，杨伥林，王春霞，等．ＨＢｓＡｇ阴性血液ＨＢＶ检测　及其意义探讨［Ｊ］．第四军医大学学报，２０００，２１（８）：９６３．　（收稿日期：２００７—０３—２３）　ＥＬＩＳＡ方法的检测结果反映患者体内的ＨＢＶ感染情况，　传统认为ＨＢｓＡｇ（＋）、ＨＢｅＡｇ（＋）提示ＨＢＶ复制活跃和传　染性强，ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ转阴，抗－ＨＢｓ及抗－ＨＢｅ的出现是