人类轮状病毒微生物学检测

人类轮状病毒微生物学检测

顾雪峰 2011293231

摘要: 轮状病毒（Rotavirus）属于呼肠科病毒（Reoviridae）轮状病毒属（Rotavirus），由澳大利亚Bishop等于1973年首先从腹泻患者的十二指肠超薄切片中发现，该病毒呈世界性分布，是人类、哺乳动物和鸟类腹泻的重要病原体。特别是A组轮状病毒是世界范围内婴幼儿重症腹泻最重要的病原体，是婴幼儿死亡的主要原因之一。据估计全球每年患轮状病毒肠炎的儿童超过14亿，造成数十万儿童死亡。本文着重针对轮状病毒的分子生物学、流行病毒学、检测方法等方面内容进行了介绍。

关键词:轮状病毒；轮状病毒感染；分子生物学；流行病毒学；检测方法

1. 引言

1973年由澳大利亚科学家Bishop首次发现［１］。轮状病毒总共有七个种，以英文字母编号为A、B、C、D、E、F与G。其中，A和B是最为常见的两种，能引起人感染，称人类轮状病毒，HRV分为A组和B组。A组轮状病毒易引起6-12个月婴幼儿急性肠胃炎。临床表现潜伏期24-72h，发病急，表现为腹泻，淡黄色水样便，部分患儿可伴发热、呼吸道感染症状。B组轮状病毒引起成人腹泻，呕吐常先于腹泻出现，伴有腹痛、腹胀、呕吐、脱水、乏力等。呈“三多”症状（水分多、次数多、量多）。主要经粪-口途径传播，它会感染与小肠连结的肠黏膜细胞（enterocyte）并且产生肠毒素（enterotoxin）［２］，肠毒素会引起肠胃炎，导致严重的腹泻，有时候甚至会因为脱水而导致死亡。是秋冬季最常见的病原。

2. 人类轮状病毒的病毒学特点 1) 形态结构与理化性质

病毒颗粒呈球形，为双链RNA病毒，径约为60-80nm。外被双层衣壳包裹蛋白核心，外壳辐射呈车轮状。完整的病毒粒子表面光滑，无囊膜，二十面体对称，病毒颗粒在大便样品和细胞培养中以两种形式存在：一种是含有完整外壳的实心光滑型颗粒，大约70—75nm，另一种是不含外壳且仅含有内壳的粗糙型颗粒，大约50。60nm，实心颗粒具有传染性。

人类轮状病毒具有较强抵抗力，在粪便中可存活数日到数周，耐乙醚、耐酸碱。55℃加热30min可灭活。

2) 基因结构与蛋白质构成

轮状病毒基因组包括11个双链RNA(dsRNA)片段，这11条中总共有18,555个核苷碱基对。每一条螺旋或是分段即是一个基因，并且依照分子尺寸由大到小依次编号为1到11。每一个基因都可以编码成一种蛋白质，而其中第9基因与第11基因比较特别，它们都可以编码成两种蛋白质。核糖核酸外围则是包围了三层二十面体的蛋白质壳体。病毒颗粒大约直径76.5 nm，并且并没有病毒包膜。

［３］

具有Vp1～Vp7及五个非结构蛋白。根据衣壳蛋白组特异性抗原Vp6不同，可分为七个血清型（A～G)。儿童感染多为A型。

3. 人类轮状病毒的流行病学

在全世界各地流行的轮状病毒A种据统计是人类轮状病毒肠胃炎案例中超过90%以上的病媒，轮状病毒是引起腹泻的主要角色并没有受到广泛的被公共卫生社群所承认，特别是发展中国家。几乎每个儿童在五岁以前都曾感染过轮状病毒。它是婴儿与幼儿严重腹泻的主要单一原因，其中大约20%的婴幼儿腹泻案例是归因于此，而统计大约50%的案例需要住院治疗。在温带地区，轮状病毒感染

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症主要发生于冬季，但是在热带地区则是一年全年都会发生［４］；其中的不同之处有部分可以用温带地区温度与湿度季节性的变化来解释。对于可归因食物污染的数据尚未清楚。

（1）传染源腹泻患儿和无症状的带病毒者是主要的传染源，42%的RV感染是无症状的。

（2）易感人群5岁以下的儿童几乎人人都遭受过轮状病毒的侵染［７］。

（3）传播途径粪—口传播——腹泻患儿和无症状的带病毒者，与儿童的密切接触进行传播。通过其污染的水、土壤、食物、玩具、衣物、用具间接传播。水源污染可造成成人腹泻轮状病毒的爆发流行；呼吸道传播——从动物实验中证实病毒通过呼吸道也可在动物体内引起消化道病变［５］。

4. 人类轮状病毒致病机制

RV主要感染宿主小肠绒毛的成熟上皮细胞。被感染的细胞的内质网中有增大池，同时微绒毛减少、缩短。上皮细胞死亡后脱落造成绒毛发育不良，从而吸收功能减弱引起腹泻。在脱落上皮处的腺管上皮细胞代偿性增生并伴有分泌过多，进一步造成腹泻［６］。

此外，微循环的改变造成局部缺血引起宿主肠绒毛结构改变，在RV致病性中也起很重要的作用。人轮状病毒会感染与小肠连结的肠黏膜细胞并且产生肠毒素，肠毒素会引起肠胃炎，导致严重的腹泻，有时候甚至会因为脱水而导致死亡。

5. 微生物学检验方法

根据腹泻发生的季节为秋冬季，如水样便，呕吐发热等临床症状，可疑似为轮状病毒感染，但是这些并不是论证病毒所特有的，因此确诊病例还得借助于实验室技术检测手段。

1) 电镜法（electronic microscope，EM）

用吸管将水样便吸至塑料或玻璃容器里，密封后送至实验室。

称取粪便，加9倍PBS制成10%悬液，3000r/min离心10min，取上清液冻存。取粪便抽出液超速离心，取沉渣经醋酸钠染色电镜观察（或免疫电镜观察），由于病毒颗粒聚集而易被检出。 2) 病毒核酸检测

可应用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)、核酸杂交法及聚合酶链反应(PCR)方法。 PAGE： 电泳后经硝酸银染色，根据11个基因片段电泳位置进行判断病毒RNA。

该法简便快速敏感，且特异性高。

［８］

核酸杂交：用地高辛等标记VP4或VP7基因型特异性序列来检测轮状病毒RNA。 PCR技术：可用于诊断和分型。灵敏度因受抑制逆转录物质而受影响。 3) 病毒分离培养

用元代猴肾细胞和传代非洲绿猴肾细胞培养粪便标本，轮状病毒经过几代培养后可出现ＣＰＥ。

6. 研究的目的与意义

人类轮状病毒是腹泻的重要病原，对轮状病毒进性快速、准确的检测，对于疾病检测和疫情控制极为重要。先阶段轮状病毒实验室检测多采用RT-PCR法，虽然灵敏度高，定量精确，但影响因素较多。故核酸杂交技术不失为一种值得推广的额技术。PCR技术与核酸杂交技术相互补充将进一步提高轮状病毒诊断的准确性。

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参考文献

[l] 任文华，崔志洪潴轮状病毒概述．畜牧兽医杂志．2005，24(5)：21～25． [2] 陈强，B组轮状病毒核酸杂交检测方法的建立及其初步应用，中国卫生检验杂志，2007,17(5):807-809．

[3] 王军，孙杰．猪轮状病毒的感染和防治．中国动物检疫．2005，22(7)：43-44．

[4] 源宣之．轮状病毒感染环的研究进展．广西畜牧兽医，2000，16(4)：41. [5] 戴国珍．轮状病毒的基因结构及抗原特性研究进展．微生物学报．2000，4(3)：120—123．

[6] 张静．轮状病毒的分子流行病学研究进展．国外医学·儿科学分册，1999，26(3)：120—121．

[7] 李泳．轮状病毒腹泻的免疫学研究概况．外医学·儿科学分册，l992，l9(3)：l35．

[8] 王慕逖主编．JLft学．第5版．北京：人民卫生出版社，2001．265-266．

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