痘苗病毒毒力测定及其免疫血清的制备

２００８年９月　中国比较医学杂志　ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００８　Ｖｏ１．１８　Ｎｏ．９　ｆ　）　第ｌ８卷第９期　研究报告　（　、口、　、　、　痘苗病毒毒力测定及其免疫血清的制备　谢军芳，侯丽波，佟　巍，乔红伟，丛　拮，王　卫，蒋　虹，魏　强　（中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，北京　１０００２１）　【摘要】　目的　测试痘苗病毒毒力，制备痘苗病毒免疫血清，为药物评价和病毒检测奠定基础。方法　鸡胚　绒毛尿囊膜培养痘苗病毒，测定病毒的ＴＣＩＤ　，和小鼠毒力。将痘苗病毒悬液稀释成１００ＴＣＩＤ５。，０．２％福尔马林灭　活，分别在０、７、１４　ｄ以腹腔注射的方式免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，用ＩＦＡ、ＩＥＡ、ＥＬＩＳＡ方法评价血清的敏感性和特异性。结　果　痘苗病毒ＴＣＩＤ　，／０．０　５　ｍＬ＝１．８×１０４，小鼠ＬＤ　。／０．２　ｍＬ＝１０６　；制备的免疫血清经ＩＦＡ法测定效价为１：３２０，ＩＥＡ　法测血清效价为１：１６０，ＥＬＩＳＡ测血清效价１：６４００。结论确定的细胞和小鼠毒力将为药物测定提供基础比对数　据；制备的痘苗病毒免疫血清具有高度的敏感性和特异性，可作为测试对照血清使用。　【关键词】　痘苗病毒；ＢＡＬＢ／ｃ小鼠；免疫血清　【中图分类号】Ｒ３９２．７　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６７１．７８５６（２００８）０９．００５３—０４　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏｕｓｅ　Ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｖａｃｃｉｎｉａ　Ｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｍｏｕｓｅ　ＸＩＥ　Ｊｕｎ－ｆａｎｇ，ＨＯＵ　Ｌｉ—ｂｏ，ＴＯＮＧ　Ｗｅｉ，ＱＩＡＯ　Ｈｏｎｇ—ｗｅｉ　ＣＯＮＧ　Ｚｈｅ，ＷＡＮＧ　Ｗｅｉ，ＪＩＡＮＧ　Ｈｏｎｇ，ＷＥＩ　Ｑｉａｎｇ　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００２１，Ｃｈｉｎａ）　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｔｅｓｔ　ｔｈｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｎ　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ｍｏｕｓｅ　ｗｉｔｈ　ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ，ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｓｅＩｄ＇ｍ　ｏｆｒ　ｄｒｕｇ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｖｉｕｓ　ｄｅｔｒｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ　ｗａｓ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｂｙ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ　ｍｅｍｂｒａｎｅ，　ＢＨＫ一２１　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ＢＡＬＢ／ｃ　ｍｏｕｓｅ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ＴＣＩＤ５ｏ　ａｎｄ　ＬＤｓ０，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＢＡＬＢ／ｃ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｏｎ　ｄａｙ　０、７、１４　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｂｙ　ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ　ｗｉｔｈ　１００ＴＣＩＤ５０　ｖｉｒｕｓ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｂｙ　０．２％ｆｏｒｍａｌｉｎ．Ｔｈｅ　ｈａｒｖｅｓｔｅｄ　ｓｅｒａ　ｗｅｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ　ｗｉｔｈ　ＩＦＡ，ｌＥＡ，ＥＬＩＳＡ　ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴＣＩ　０／０．０５　ｍＬ　ｉｓ　１．８×１０４　ａｎｄ　ＬＤ∞／０２　ｍＬ＝１０。　．．．　Ｔｈｅ　ｓｅｒａ　ｔｉｔｅｒ　ｉｓ　１：３２０　ｗｉｔｈ　ＩＦＡ，１：１６０　ｗｉｔｈ　ＩＥＡ　ａｎｄ　１：６４０ＨＤ　ｗｉｔｈ　ＥＬＩＳＡ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｂａｓｉｃ　ｄａｔａ　ｏｆ　ＴＣＩＤ５０　ａｎｄ　ＬＤ∞ａｒｅ　ｕｓｅｆｕｌ　ｆｏｒ　ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｓｅｒａ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ；ＢＡＬＢ／ｃ　Ｍｉｃｅ；Ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｓｅｒｕｍ　痘苗病毒是结构最为复杂的一类ＤＮＡ病毒，常　用于广谱抗病毒药物，尤其是中药的筛选评价。确　定该病毒同批次（ｖｉｒａｌ　ｓｔｏｃｋ）对细胞和动物的毒力、　的重要保证…。　痘苗病毒能敏感感染ＢＨＫ一２１细胞和小鼠。细　胞产生明显的病变，用ｌＥＡ（间接免疫酶法）和ＩＦＡ　（间接免疫荧光法）容易检测　。小鼠有明显的疾病　免疫学反应是药物评价中动物感染稳定性和重复性　［基金项目］中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金，项目号ＤＷＳ　２００７０１。　［作者简介］谢军芳，女，硕士生，从事实验动物病毒分子生物学研究工作。　［通讯作者］魏强，教授，博士生导师，研究方向：实验动物病毒学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｅｉｑｉａｎｇ０４３０＠ｓｏｈｕ．ｃｏｎｌ　５４　中国比较医学杂志２００８年９月第１８卷第９期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｏｍｐ　Ｍｅｄ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２００８．Ｖｏ１．１８．Ｎｏ９　．过程，包括临床症状、组织病理学改变，免疫小鼠能　获得高滴度抗体。本文研究了痘苗病毒细胞和动物　毒力，制备了痘苗病毒免疫血清，为药物评价和病毒　检测奠定基础。　１材料和方法　１．１材料　１．１．１　毒种：痘苗病毒，购自中国药品生物制品检　定所。　１．１．２鸡胚：ＳＰＦ级，１１日龄，购自梅丽亚公司。　１．１．３细胞：ＢＨＫ．２１，购自中国医学科学院基础医　学研究所细胞库。　１．１．４动物：ＢＡＬＢ／ｃ小鼠（动物合格证号：ＳＣＸＫ　（京）２００７—０００１），ＳＰＦ级，体重ｌ８～２２　ｇ，６～８周龄，　购自维通利华。　１．２方法　１．２．１病毒抗原制备：复苏痘苗病毒，接种到１１日　龄ＳＰＦ级鸡胚绒毛尿囊膜，０．１　ｍＬ／只，同时选择两　个鸡胚，注射生理盐水作为阴性对照。３６℃孵育３　ｄ，观察绒毛尿囊膜上是否有痘斑出现，把出现痘斑　的绒毛尿囊膜剪下，放入一次性无菌平皿中，用含　５％双抗的ＤＭＥＭ培养基漂洗干净，尽量去除残存　血液，按照１　ｇ组织加１０　ｍＬ无血清ＤＭＥＭ进行研　磨，制备病毒悬液。经５０００　ｒ／ｍｉｎ离心２０　ｍｉｎ后，用　０．２２　ｋｔｍ的过滤器过滤，一８０％保存备用。　１．２．２　ＴＣＩＤ　测定：预先接种ＢＨＫ一２１细胞至９６孔　细胞培养板，培养成单层，备用。痘苗病毒悬液从　１０　开始，作系列对倍稀释，到１０Ｉ４　，共１４个稀释　度。每个稀释度做８个复孔，每孑Ｌ加入稀释好的病　毒悬液５０　Ｌ，于３７　ｃＩ＝吸附培养１　ｈ，然后吸弃病毒　悬液，再加入无血清的ＤＭＥＭ培养基，３７℃５％ＣＯ：　培养箱培养３　ｄ，每天观察细胞病变情况　。根据　Ｒｅｅｄ　Ｍｕｅｎｃｈ法，计算ＴＣＩＤ５０ａ　１．２．３病毒抗原片的制备：用１０％胎牛血清ＤＭＥＭ　生长液培养ＢＨＫ．２１单层细胞。弃去瓶中的细胞培　养液，加入２％胎牛血清ＤＭＥＭ细胞维持液和０．１　ｍＬ痘苗病毒。每天观察细胞病变，待细胞病变达＋　＋，０．０２％ＥＤＴＡ消化，磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）洗涤，调　整细胞浓度至单层，涂片。干燥后，４℃冷丙酮固定　１５　ｍｉｎｌ４Ｊ，低温保存备用。　１．２．４痘苗病毒毒力测定：选择６—８周龄ＳＰＦ级　ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，随机分为９组，每组５只。将病毒悬　液做八个稀释度，分别为１：５０，１０～，ｌ０～，１０一，　１０～，ｌ０一，１Ｏ一　，１０～，每个稀释度腹腔注射１组　小鼠，每只０．２　ｍＬ，注射阴性对照组鸡胚绒毛尿囊　膜研磨液作阴性对照，每天观察小鼠情况。　１．２．５病理观察：取发病死亡小鼠的心脏、肝脏、脾　脏、肺脏和肾脏等组织，切成３～５　ｍｍ的组织块，经　１０％福尔马林固定，用不同浓度的乙醇逐级脱水，透　明，常规脱蜡包埋，组织切片，进行常规Ｈ．Ｅ染色，　光镜下观察记录各组织的病理变化　。　１．２．６免疫血清的制备：将痘苗病毒悬液稀释成　１００　ＴＣＩＤ　用０．２％福尔马林灭活２４　ｈ。选择６～８　周龄ＳＰＦ级ＢＡＬＢ／ｃ小鼠３０只。分别在０、７、１４　ｄ腹　腔注射０．２　ｍＬ病毒抗原，最后一次免疫后第７天，　尾尖采血，测定血清抗体效价。后痘苗病毒悬液稀　释成１００　ＴＣＩＤ　６０℃，１０　ｍｉｎ湿润条件下不完全灭　活，再次加强免疫。乙醚麻醉小鼠，摘眼球采血，血　样于室温存放２　ｈ，３　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１５　ｍｉｎ。吸取上　清液，移入１５　ｍＬ离心管中，混匀后，留出一部分以　备测定效价，剩下分装，一８０℃保存备用。　１．２．７免疫血清敏感性评价　１．２．７．１　间接免疫荧光法：痘苗病毒免疫血清从１：　ｌ０作系列对倍稀释，共做８个稀释度。工作流程和　相关的试剂和用品参照国标ＧＢ／ＴＩ４９２６．２０．５２—　２００１中的方法进行配置和操作。　１．２．７．２玻片免疫酶法：痘苗病毒免疫血清从１：１０　作系列对倍稀释，共做８个稀释度。工作流程和相　关的试剂和用品参照国标ＧＢ／Ｔ１４９２６．２０．５１—２００１　中的方法进行配置和操作　１．２．７．３间接免疫酶联吸附试验：痘苗病毒免疫血　清从１：１００作系列对倍稀释，共做８个稀释度，工作　流程和相关的试剂和用品参照国标ＧＢ／　Ｔ１４９２６．２０．５０—２００１中的方法进行配置和操作，最　后在敏感波长Ａ帖。和参考波长Ａ啪下读取光吸收　值。　’　１．２．８免疫血清特异性评价：将痘苗病毒免疫血清　滴加到小鼠肝炎病毒、小鼠肺炎病毒、仙台病毒和淋　巴细胞脉络丛脑膜炎病毒抗原片上，用间接免疫荧　光法查看是否有非特异反应，方法同１．２．７．１。　２结果　２．１病毒培养结果　培养３　ｄ的鸡胚绒毛尿囊膜上形成大而中心坏　死的痘斑，灰白色，并产生溃烂的病灶，大小不规则　（图１），而注射生理盐水作对照的鸡胚绒毛尿囊膜　中国比较医学杂志２００８年９月第ｌ８卷第９期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｏｍｐ　Ｍｅｄ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２００８，Ｖｏ１．１８．Ｎｏ．９　５５　则血管分布丰富，未见上述改变。　细胞上出现绿色荧光，荧光的最终稀释度为１：３２０。　２．２　ＴＣＩＤｓ　的测定和计算　正常细胞成砖红色，没有荧光（图３）。　根据Ｒｅｅｄ—Ｍｕｅｎｃｈ，计算收获的痘苗病毒　表１痘苗病毒毒力测定结果　ＴＣＩＤ５０／０．０５　ｍＬ＝１．８×１０　。　Ｔａｂ．１　Ｔｅｓｔ　ＯＮ　ｍｉｃｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ　２．３痘苗病毒毒力测定　痘苗病毒小鼠毒力测定过程中，共观察１４　ｄ，出　现的临床症状有弓背松毛，食欲减少，蜷缩一团不活　ｌ：５Ｏ　动，出现结膜炎，甚至分泌大量粘液而使眼睛难以睁　ｌ：１Ｏ　开，还表现典型的临床症状：四肢和尾部水肿性肿　１：ｌ０　１：１０４　胀，坏死甚至脚趾脱落。病毒浓度越高，动物死亡的　１：１０５　时间越早，在ｌ：１０７日寸小鼠只有２只死亡，在１：１０　１：１０６　时小鼠没有死亡，活动状态好，没有出现临床症状，　ｌ：ｌ０　具体见表ｌ。痘苗病毒ＬＤ　。／０．２　ｍＬ＝１０　。尸解可　１：１０　见明显的肝，脾坏死呈斑驳状。病理切片结果，肝脏　对照（Ｃｏｎｔｒｏ１）　中可见中央静脉扩张，肝细胞肿胀、颗粒样变性，灶　性的肝细胞固缩（图２）。脾脏：脾小体淋巴细胞崩　２　３　４　５　６　７　８　９　２．５．２间接免疫酶法：使用制备的痘苗病毒免疫血　溃减少，结构破坏，生发中心消失，在白髓内可见淋　清进行ＩＥＡ测定，在痘苗病毒感染的ＢＨＫ一２１细胞　巴细胞碎片，红髓充血、出血和结构破坏，髓细胞和　上呈现棕色或浅棕色，出现颜色的最终稀释度为１：　淋巴细胞数量明显减少（图２）。　１６０；正常细胞无色（图４）。　２．４免疫血清制备　２．５．３　ＥＬＩＳＡ结果：判定结果：Ｐ／Ｎ＝免疫血清特抗　３０只小鼠定期测定病毒抗体滴度，一月达到高　值／免疫血清正抗　值。阳性：Ｐ／Ｎ＞２．１；可疑：　峰，将收获的高滴度抗体合并成批次，每管ｌ　ｍＬ分　１．５＜Ｐ／Ｎ≤２．１；阴性：Ｐ／Ｎ≥１．５。痘苗病毒多价抗　装，一８０℃保存备用。　血清稀释倍数为６　４００时，ＰＩＮ＝３．１３＞２。１，结果判　２．５免疫血清敏感性评价　阳性；而１２８００时，Ｐ／Ｎ＝１．４９＜１．５，结果判阴性。　２．５．１　间接免疫荧光法结果：使用制备的痘苗病毒　由此可知，痘苗病毒免疫血清效价为１：６　４００（表２）。　免疫血清进行ＩＦＡ测定，在痘苗病毒感染的ＢＨＫ　２１　５　５　５　表２　ＥＬＩ５　５　ＳＡ法评价免疫血清的敏感性　５　２　Ｏ　Ｏ　Ｔａｂ．２　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ｉｎ　ＥＬＩＳＡ　２．６免疫血清特异性　此，在感染前，需要对不同批次的病毒进行毒力测　痘苗病毒免疫血清和小鼠肝炎病毒，小鼠肺炎　定，如我们用１００ＴＣＩＤ　病毒悬液（未灭活）感染小鼠　病毒、仙台病毒和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒抗原　制备免疫血清时，感染后第５天，５０只小鼠全部死　片中正常细胞抗原孑Ｌ无荧光反应，病毒抗原细胞也　亡，因而进行了痘苗病毒毒力试验，共观察１４　ｄ，发　没有荧光反应，制备的免疫血清与以上几种病毒无　现小鼠出现了典型痘病毒感染的临床症状。１：１０　非特异性反应，特异性好。　时，小鼠依然有半数死亡，用ＩＦＡ法检测不到抗痘苗　３讨论　病毒抗体的存在，故改用１００ＴＣＩＤ　病毒悬液，经　０．２％福尔马林２４　ｈ灭活，三次免疫，用ＩＦＡ法测血　由于痘苗病毒对小鼠非常敏感，常常造成动物　清效价为１：８０，抗体效价不高，随后对１００ＴＣＩＤ　病　死亡，而且，不同实验室毒种也会出现毒力不同，因　毒悬液，采取６０℃，１０　ｍｉｎ不完全灭活处理，加强免　５６　中国比较医学杂志２００８年９月第１８卷第９期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｏｍｐ　Ｍｅｄ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２００８，Ｖｏ１．１８．Ｎｏ．９　疫一次，血清效价提升为１：３２０。　另外，尽管目前国家标准中弃用痘苗病毒作为　［３］　殷震，刘景华．动物病毒学（第２版）［Ｍ］．北京：科学出版社，　１９８５：３２９—３３０．　替代检测小鼠鼠痘病毒，但鉴于生物安全和对动物　危害考虑，加之鼠痘病毒与痘苗病毒的ＤＮＡ序列和　抗原性存在广泛地同源性，应用补体结合试验、琼脂　扩散试验和抗体吸收试验难以鉴别　。　，因此，在进　一［４］　涂新明，吴小闲，蒋虹，等．免疫酶染色法（ＩＥＡ）检测试剂盒　的研制［Ｊ］．中国实验动物学杂志，１９９７，７（３）：１３５—１３９．　［５］　安学芳，胡薛英，余思义，等．鼠痘病毒的分子检测和病理学　研究［Ｃ］．中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十　三次学术研讨会论文集．２００６：２６８—２７２．　ｔ　Ｍ，Ａｒｃｈａｒｄ　ＬＣ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ　［６］　Ｍａｃｋｅｔ步比对研究后，如果检测结果符合性一致，可用痘　苗病毒代替鼠痘病毒制备诊断试剂　，制备的免疫　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ，１９７９，４５：６８３—７０１．　血清也可用于质量控制血清。（图１～４见插Ｘ）　参考文献：　田克恭．实验动物病毒性疾病［Ｍ］．北京：中国农业出版社，　１９９２：２２—３０．　［２］　钱琴，屈霞琴，陈天陪，等，鼠痘病毒检测方法的进展［Ｊ］．上海　畜牧兽医通讯，２００３，５：１０—１１．　［７］　Ｎｉｔｓｃｈｅ　Ａ，Ｅｌｌｅｒｂｒｏｋ　Ｈ，Ｐａｕｌｉ　Ｇ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ　ｂｙ　ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｒｉｏｌａ　ｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ　ｂｙ　ｍｅｌｔｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ，２００４，４２（３）：１２０７—１２１３．　［８］　Ｂｕｌｌｅｒ　ＲＭ，Ｂｈａｔｔ　ＰＮ，Ｗａｌｌａｃｅ　ＧＤ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ｅｎｚｙｍｅ．１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｅｔｒｏｍｅｌｉａ（Ｍｏｕｓｅｐｏｘ）　ａｎｔｉｂｏｄｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ，１９８３，１８（５）：１２２０—１２２５．　（修回日期２００８．０８．０８