体液microRNA作为新的无创伤性生物标志物的意义

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•述 评•体液microRNA作为新的无创伤性生物标志物的意义

张春妮1★ 张辰宇2

[摘 要] microRNA（miRNA）是一类能降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻译从而在转录后水平调控基因表达的非编码RNA。miRNA在多种生理、病理过程中发挥重要作用，组织细胞miRNA表达谱与多种病理尤其是肿瘤密切相关。最近的研究发现，血循环及其他体液中也存在丰富而稳定的miRNA，并且在某些疾病状态下，体液中的一些miRNA表达量会发生特异性改变，提示体液miRNA作为一种新的无创伤性生物标志物的潜力和良好的临床应用前景。本文就体液miRNA与疾病关系的研究进展作一综述。

[关键词] microRNA；体液；血循环；生物标志物

The study of microRNAs in body fluid as a novel invasive biomarker

ZHANG Chunni1★, ZHANG Chenyu2

(1. Department of Clinical Laboratory, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command, Jiangsu, Nanjing 210002, China; 2. State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing University, Jiangsu, Nanjing 210093, China)

[ABSTRACT] microRNAs (miRNAs) are a class of small non-coding RNA that regulate gene expression at the posttranscriptional level by either degrading or blocking translation of messenger RNA targets. MiRNAs play important regulatory roles in a variety of physiological and pathological conditions. MiRNA profiles in tissue or cell exhibit close relation with some diseases, especially tumor. Recently, it has been found that miRNAs also stably express in serum, plasma and other body fluids. Moreover, the expression levels of some circulating miRNAs specifically change in patients with certain diseases, revealing their great potential as a class of novel invasive biomarkers for diseases and promising clinical application future. This review summarizes the literatures on the body fluid miRNAs in different disease.

[KEY WORDS] microRNA; Body fluid; Circulation; Biomarker

microRNA（miRNA）是1993年发现的一类长度为19~24个核苷酸的非编码单链核糖核酸分子，它通过与靶mRNA 3'端完全或部分互补结合，导致靶

2]

，mRNA降解或翻译抑制从而调控靶基因的表达[1，

中一样，会发生特征性的改变，这些特定的miRNA表达谱可构成疾病的“指纹”，成为一种新的无创伤性诊断标志物以助于疾病的预测、诊断和预后。 1 体液miRNA的发现和特性

2008年Lawrie等[4]第一个发现人血清中含有miRNA。紧随其后，Mitchell等[5]和Chen等[6]几乎同时报道人血浆或血清中存在稳定的miRNA。经PAGE将Mitchell研究小组[5]从血浆提取RNA，

18~24 nt的部分分离出来，对其进行RT-PCR得到

体内30%的蛋白质编码基因的表达是由miRNA调miRNA在细胞发控的。组织和细胞的研究证实[1~3]，

育、凋亡、分化、增殖等重要的生理病理过程中发挥重要作用。最近的研究发现，人体液（包括血液、尿液、唾液、羊水、胸腹水等）中也存在miRNA，在肿瘤等病理状态下人体液miRNA表达谱与在组织细胞

基金项目：国家重点基础研究发展计划（973计划）（2006CB503909）；国家自然科学基金（30950100）

作者单位：1. 南京军区南京总医院解放军临床检验医学研究所检验科，南京，江苏 210002

2. 南京大学医药生物技术国家重点实验室，南京，江苏 210093

★

通讯作者：张春妮，E-mail：zchunni27@hotmail.com

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cDNA分子，再将这些cDNA克隆、测序后与该物种基因组数据库中的数据进行比较，发现73%的序列和已知的miRNA序列一致。Chen等[6]采用高通量高灵敏度的Solexa测序技术对健康个体血清中所有的小RNA（<30 nt）进行了测序，发现血清和血细胞中虽含有包括miRNA、rRNA片段和mRNA片段等多种不同类型的小分子RNA（<30 nt），但miRNA是血清中小分子RNA的主要成分。进一步采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对测序结果进行验证，发现随机选择的几种miRNA在血清中皆有表达。接着，人的其他体液包括尿液、唾液、羊水、胸水、脑脊液、精液、阴道分泌物、经血中以及乳液等相继被检测到一定数量的miRNA[7~9]。

考虑到血清中含有RNA酶（RNase），人们担心miRNA不能稳定存在于其中。但研究结果出乎人们意料，miRNA在血清中相当稳定，血清/血浆中

6]

。将三种人工的miRNA能够抵抗RNase的降解[5，

2 体液miRNA的来源

据研究报道，在多种病理状态下血液或其他体液中的一些miRNA的表达水平或显著升高或明显降显示了其作为疾病特异性诊断标志物的潜能，有低，

些更表现出预后判断的能力，具有良好的临床应用前景。但体液尤其是血循环miRNA的来源及与患病组织细胞的关系目前尚不清楚。Chen等[6]观察到在健康人中，血清miRNA表达谱与血细胞有较高的一致性（R=0.9214），而在肝癌等疾病状态下，两者的一致性明显减小（R=0.4492）。由此说明在正常状态下，血清miRNA主要来自于血细胞，而在疾病状态下，部分血清中的miRNA可能来自于患病的组织细胞中。

至于miRNA如何从组织细胞进入血循环目前还

15]

，miRNA可能会像其他物不十分明了。据推测[14，

质一样从破碎的组织细胞或凋亡细胞中被动漏出，也可能从患病组织细胞主动分泌进入血循环，而后者被认为是主要方式。miRNA的主动分泌有两种形式，一种是游离的miRNA直接被细胞分泌；另一种则是miRNA先被选择性地包装在外泌体、微小体等膜性结构中，以包裹的形式从细胞分泌至胞外进入血循环。

14，16]

。目前已有一些研究结果证实了上述推测[10~12，

合成的与人类无同源序列的新秀丽小杆线虫miRNA（miR-39、miR-54和miR-238）加入到人血清或血浆中，在未对RNase灭活的情况下，这三种外源miRNA 2 min内即降解，而内源性的miRNA，如miR-15b、miR-16和miR-24的量在此过程没有明显的改变，说明内源性的miRNA以一种能抵抗血浆RNase的形式存在[5]。随机选择的几种miRNA经RNaseA消化3 h后有超过一半的分子仍保持完整结构，同时qRT-PCR检测表明，DNase I也不会影响血清miRNA的量[6]。这些试验结果均说明血清/血浆中的miRNA不易被RNase降解。其次，血清miRNA可长期放置，如置室温一星期或反复冻融后，miRNA仅有微量的改变[5]。另外，在各种极端条件下，如煮沸、强酸或强碱等， miRNA含量也无明显改变[6]。因此丰富而稳定的体液miRNA，较之成分复杂、易降解、易变性的蛋白类分子，更适宜作为生物标志物应用于临床。

miRNA如此稳定的原因目前尚不十分清楚。有研究显示，循环中的miRNA被包裹在外泌体（exosome）、微小体（microvesicle）或凋亡小体（apoptotic body）中，这些膜性结构对miRNA起血液中可能存在一些有效的保护作用[10~12]。另外，

物质对miRNA的结构进行了修饰而使其具有抵抗也不排除miRNA与某种蛋白分子RNase的能力[6]，

14]

。体液miRNA稳定的分或脂质结合而被保护[13，

miRNA可能通过一种依赖酰进一步有研究显示[17]，

基鞘氨醇的分泌机制释放。因为发现参与外泌体分泌的调节酰基鞘氨醇生物合成的中性鞘髓磷脂酶2（nSM-ase2）可控制miRNA分泌到细胞外。外泌体或微小体作为供体细胞将它们包裹的miRNA传递到其微循环中的免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞或其他的受体细胞中，影响这些受体细胞的功能。因此分泌的miRNA在受体细胞是可传递的并且是有功能的。3 体液miRNA与疾病

人们发现，miRNA不仅丰富而稳定地存在于血清等体液中，更重要的是其表达水平与疾病密切相关。在疾病状态下，miRNA表达谱与在组织细胞中一样，会发生特征性的改变，提示miRNA作为一种新的无创伤性生物标志物的可能性。3.1　肿瘤患者体液miRNA的变化

3.1.1 循环系统肿瘤血miRNA变化 Lawrie等[4]于2008年第一个报道血清miRNA是潜在的肿瘤标志物。他们用qRT-PCR方法检测到60例弥漫性大

子机制还有待阐明。

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B细胞淋巴瘤患者血清中miR-155、miR-210和miR-21表达量明显高于43例年龄性别匹配的正常对照，并且miR-21的水平与存活率相关。Tanaka等[18]先用微阵列扫描然后用qRT-PCR验证，发现miR-92a在54例急性髓性白血病和急性成淋巴细胞白血病患者血浆中的表达量较之16例正常对照明显上升。3.1.2 神经系统肿瘤血miRNA变化 Skog 等[12]报道miR-21高表达于成胶质细胞瘤癌细胞中，同时也高表达于患者血清中。

3.1.3 呼吸系统血miRNA变化 在实体瘤患者血液中一些miRNA的表达量也呈现特异性的改变。Chen 等[6]首先用Solexa测序方法发现非小细胞肺癌患者血清miRNA表达谱与健康人有较大差异。随后采用qRT-PCR方法进一步验证，发现miR-25和miR-223在152例癌患者中的表达量显著升高，提示这两种血清miRNA是非小细胞肺癌潜在的生物标志物。Hu等[19]研究了非小细胞肺癌血清miRNA表达谱与存活时间的关系。他们按存活时间将患者分为长存活组（150例，平均存活时间49.54个月）和短存活组（153例，平均存活时间9.54个月），采用Solexa测序初筛随之qRT-PCR验证的方法比较了两组miRNA表达水平，筛选出了4种与生存期明显相关的血清miRNA，分别为miR-496、miR-30d、miR-1和 miR-499，这4种血清miRNA组合在一起可作为非小细胞肺癌生存的预测标志物。Rabinowits在肺腺癌患者血循环中来自肿瘤的外泌等[20]报道，

体的miRNA含量明显高于正常对照组。

3.1.4　消化系统肿瘤血miRNA变化　Ng等[21]分析了90例结直肠癌和50例健康人血浆及组织中95种miRNA的表达，发现癌患者手术前血浆miR-17-3p和miR-92的表达量明显上调，而术后则显著下降。进一步大标本量（180例）验证，发现miR-92对结肠癌诊断的敏感性和特异性分别为89%和70%。另外，miR-92水平与肿瘤大小、迁移状态、肿瘤分级无相关性，提示检测miR-92对结直肠癌有较高的准确性，并有助于早期诊断。Huang等[22]也检测了晚期结肠瘤患者血浆miR-92a水平，同样发现明显升高的现象。

Tsujiura等[23]报道有4种在胃癌组织中表达上调的miRNA（miR-17-5P、miR-21、miR-106a和miR-106b），miRNA在69例患者血浆中的水平明显高于30例正常对照，而let-7a水平则显著下降。另外，4种表达上升的miRNA在患者术后一个月明显下降。该结

果显示这几种miRNA有助于胃癌的诊断和预后判断。

我们[24]也研究了食管鳞状细胞癌患者血清miRNA表达谱，共分析290例患者，同时以140例年龄、性别匹配的正常人作对照。采用Solexa初筛和qRT-PCR验证相结合的方案筛选出了7种在食管癌患者血清中表达显著上升的miRNA，它们是miR-10a、miR-22、miR-100、miR-148b、miR-223、miR-133a和miR-127-3p。这7种miRNA组合在一起的ROC曲线下面积（AUC）高达0.929，明显大于目前临床上使用的消化系统肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）（AUC=0.549）。miRNA组合对食管鳞状细胞癌诊断的特异性为96%，与CEA相近（100%），但敏感性（78.5%）远高于CEA（13.4%）。特别是miRNA组合也能将早期（临床I/II期）患者与正常对照区分开来（阳性预测值和阴性预测值分别为0.96，0.82），进一步相关性分析显示这7种miRNA的表达量与患者的组化分型和TNM分期无相关性，提示我们所筛选出的这7种miRNA对食管鳞状细胞癌有早期诊断潜能。

Yamamoto等[25]观察到肝细胞肝癌 （HCC）患者血清中miR-500水平增加，其中部分患者术后miR-500水平恢复到了正常。Shigoka等[26]发现miR-92a高表达于HCC组织中，并且miR-92a可促进HCC细胞株的增殖。另外，患者术前血浆中的miR-92a相对含量低于正常对照，术后则升高。提示miR-92a参与HCC的发生、发展，且可作为HCC诊断和预后的潜在指标。

Wang等[27]发现4种在胰腺癌组织中表达上调的miRNA包括miR-21，miR-210，miR-155和miR-196a在患者血浆中的表达也明显增高。他们共观察了28例患者，以19例健康人作对照。ROC曲线分析显示这4种miRNA组合在一起的AUC为0.82，对胰腺癌诊断的特异性和敏感性分别是89%和64%。另两个研究小组也分别观察到了miR-210和miR-196a在胰腺癌患者血浆中的高表达现象志物。

3.1.5 泌尿系统肿瘤尿液miRNA变化 最近，Hanke等[30]发现尿液中也含有miRNA。他们建立了一种准确测定尿液miRNA的qRT-PCR方法，并利用该方法分析了膀胱癌患者尿液中157种miRNA的

[28，29]

，证实这

两种miRNA能作为胰腺癌诊断和预后的潜在标

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含量。他们发现，根据尿液miR-126和miR-182 含量可将膀胱癌患者与正常人区分开来，ROC曲线分析显示这两种miRNA组合在一起的AUC为0.768， 对膀胱癌诊断的特异性和敏感性分别是82%和不同病期的泌尿道上皮癌72%。Weber等[31]报道，

患者尿液miRNA表达谱有差异。他们认为一些尿液miRNA含量的变化可作为检测和监控该类病病理过程的生物标志物。

3.1.6 头颈部肿瘤血和唾液miRNA变化 Wong等[32]发现舌鳞状细胞癌患者无论早期还是晚期，其血浆miR-184水平均明显上调，而术后则下降，提示miR-184的早期诊断和手术效果评估价值。

Liu等[33]观察到43例口腔鳞状细胞癌患者血浆AUC为0.82。miR-31水平显著增高，术后则下降，他们同时也分析了9例患者的唾液，发现唾液miR-31的变化趋势同血浆。Lin等[34]也报道了他们对口腔鳞状细胞癌研究的结果，他们发现患者血浆miR-24水平明显增加，miR-24对口腔鳞状细胞癌阳性预测值为0.82。

3.1.7　内分泌系统肿瘤血miRNA变化 Mitchell等[5]发现miR-141在25例前列腺癌患者血清中均高表达，并且与前列腺特异性抗原（PSA）的表达水平有一定的相关性。miR-141对前列腺癌诊断的敏感性和特异性分别为60%和100%。

Taylor等[11]通过分析血循环中来自于卵巢癌组织细胞的外泌体，发现有218种miRNA存在于其中，其中8种miRNA包括miR-21、miR-141、miR-200a、miR-200c、miR-200c、miR-200b、miR-203、miR-205和miR-214的水平与癌细胞相当。另外，癌患者外泌体miRNA表达谱与良性肿瘤有显著差异。该结果提示，循环中外泌体miRNA表达谱有可能替代组织细胞活检用于卵巢癌诊断。Resnick等[35]也研究了卵巢癌患者血清miRNA表达谱，通过初筛及进一步验证发现，miR-21、miR-92、miR-93、miR-126和miR-29a这五种miRNA表达量在患者组上升，而miR-155、miR-127 和miR-99b 则下降。

Zhu等[36]发现癌组织孕酮受体阳性的乳腺癌患者血清miR-156水平明显高于癌组织孕酮受体阴性患者。该结果提示血清miRNA表达谱不仅能将患者与正常人区分开来，也能用于辨别疾病的亚类。Heneghan等[37]也详细分析了乳腺癌患者血清miRNA的表达以及治疗前后的变化，同时也分析了

与病理指标的相关性。他们发现癌组织中上调的miR-195在患者血清中的表达也明显上升，而术后患者血清中miR-195和let-7a的含量降至正常。另外，雌激素受体阴性患者血清miR-10b和miR-21含量高于雌激素受体阳性患者。Wang等[38]观察到6种miRNA（包括miR-21、miR-106a、miR-126、miR-155、miR-199a和miR-335在乳癌组织和血中的表达水平高度一致，miR-21、miR-106a和miR-155在癌组， 而织及患者血清中的表达水平高于正常（P<0.05）miR-126、miR-199a和miR-335在患者中表达降低。其中miR-21、miR-126、miR-155、miR-199a和miR-335的表达与组化分期及性激素受体表达等临床病理特征密切相关。这些结果揭示，miRNA选择性地表达和调节是潜在的乳腺癌生物标志物。

3.1.8　软组织肿瘤血miRNA变化 最近，Miyachi等[39]探讨了一些肌肉特异性的miRNA作为横纹肌肉瘤生物标志物的可能性。该研究涉及的肌肉特异性的miRNA包括miR-1、miR-133a、miR-133b和miR-206。他们发现，这些miRNA在横纹肌肉瘤患者血清中的水平明显高于非横纹肌肉瘤的肿瘤患者，其中miR-206对横纹肌肉瘤诊断的敏感性达100%，特异性也高达91.3%。他们认为，肌肉特异性的miRNA，尤其miR-206可作为诊断横纹肌肉瘤的生物标志物。3.2 其他疾病体液miRNA的变化

最近的研究显示，不仅癌症患者体液miRNA有特异性的改变，非肿瘤的其他病理状态下，患者体液中的miRNA也呈现变化。3.2.1

糖尿病血miRNA变化 Chen等

[6]

采用

Solexa 方法全面分析了2型糖尿病患者血清miRNA表达谱并与健康人比较，发现两者的相关系数仅为0.4645，说明糖尿病患者血清miRNA表达谱与正常人有较大差异。

3.2.2 肝病血miRNA变化 Wang等[40]研究对乙酰氨基酚致肝损伤的小鼠发现，肝损伤后一些miRNA在血浆和肝组织的表达量发生了变化，miR-122和miR-192在血浆中表达量增加，并且有剂量和时间依赖性，提示血浆中某些miRNA也有可能作为药物所致肝损伤的生物标志物。Sidorkiewicz等[41]观察到miR-155前体在血清和外周血单核细胞中的表达量与肝炎C病毒（HCV）RNA存在与否密切相关，miR-155前体高表达于含有HCV RNA的血清或外周血单肝病患者（包核细胞中。最近另一项报道显示[42]，

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括肝癌、肝硬化和慢性肝炎）血清miR-885-5p表达水平明显高于胃癌和正常对照，提示miR-885-5p与肝病病理有关，是肝病的辅助诊断标志物。

3.2.3 脑病血miRNA变化 血miRNA表达谱可反应脑的病理状态。以往组织细胞的研究揭示脑特异性的miR-134可能是两极神经细胞狂躁症的潜在调节者。最近，Rong等[43]检测了21例两极神经细胞狂躁症患者血清miR-134水平，并与年龄、性别匹配的正常对照进行比较，发现患者治疗前以及治疗2周、4周后，miR-134水平明显低于对照组，且随治疗而下降。患者无论治疗与否，miR-134水平的降低都与病情呈负相关。该结果提示血浆miR-134水平与狂躁症的生理病理和严重程度有关，通过检测血浆miR-134能有助于判断急性狂躁症的发作和监控缺血中稳定剂药物的治疗。Liu等[44]分析了手术、风、脑出血和癫痫等几种不同的脑损伤病理状态下大鼠脑和全血中miRNA的表达情况，并与正常鼠作对照。结果发现，脑损伤鼠的脑和血中的多种miRNA表达水平变化超过1.5倍，其中miR-298、miR-155和miR-362-3p等上调或下调2倍之多。脑脊液miRNA表达谱也可反映脑的病理状态。Cogswell等[45]采用PCR方法从阿尔茨海默氏痴呆患者脑脊液中检测到201种miRNA，发现其中有60种在Brrak 5期和。一些与免1期患者中的表达量有差异（P<0.05）

疫细胞功能和T细胞活化及分化有关的miRNA如miR-146b、miR-181a和miR-142在Brrak 5期患者脑脊液中表达受到抑制。该结果提示这些miRNA在脑脊液中的表达量能将Brrak 5期和1期阿尔茨海默氏痴呆患者区别开来。

炎症疾病血和滑液miRNA变化 目前3.2.4 感染、

临床上还没有很好地能将脓毒病与其他非感染疾病引起的系统性炎症反应综合症（SIR）区分开来的指标。不过，最近Wang等[46]采用RT-PCR方法分析了7种与炎症或感染有关的miRNA在50例脓毒病患者血清中的表达水平，同时与30例SIR患者以及20例正常对照比较，他们发现，血清miR-146a和 miR-223脓毒病组的表达量显著低于其他两组，两种miRNA的AUC分别为0.858 和0.804，均高于IL-6的AUC（0.785），提示血清miR-146a和 miR-223可作为脓毒病新的生物标志物。

人的关节滑液中也存在miRNA，且滑液miRNA表达谱与血循环miRNA一样可作为类风湿关节炎

（RA）和骨关节炎（OA）的生物标志物。Murata等[47]在人的关节滑液中检测到miRNA，并发现滑液中的但滑液miRNA表miRNA与血浆miRNA同样稳定，

达谱与血浆miRNA有较大差异。进一步研究显示，滑液miRNA可能主要来自于滑液组织。另外，RA和OA患者血浆miR-132水平明显低于健康对照，RA 患者滑液miR-16、miR-146、miR-155和miR-223表达量则显著高于OA，并且RA血浆miRNA与RA的活动度相关。因此关节滑液和血浆miRNA有助于RA和OA的诊断和病理分析。

3.2.5　心脏疾病血miRNA变化 血循环中的miRNA在心肌细胞受损时也发生特异性改变。Li等[48]首先利用去甲肾上腺素诱导的大鼠心肌损伤模型观察到心肌受损时大鼠血浆miR-208 水平明显升高。Wang等[49]研究心肌梗死（AMI）大鼠的同时分析了AMI患者几种血浆miRNA的变化，研究的病例包括AMI 33例，非AMI冠心病16 例，其他心血管病17 例及30例正常对照，他们还对其中5 例AMI 患者进行了治疗前后的比较。他们发现血浆miR-208、miR-1、miR-133a和miR-499水平在AMI大鼠中增加，在AMI患者中也明显高于非AMI 患者和正常对照，且在患者治疗后下降。Ai等[50]通过对更多病例的观察发现，AMI患者（n=93例）血浆miR-1表达量显著高于正常对照（n=66例），治疗后（n=83例）则明显下降，并且血浆miR-1水平与QRS相关。

不仅AMI，心衰时血循环中的miRNA也呈现特征性改变。Tijsen等[51]采用Illumina珠芯片阵列扫描和qRT-PCR验证相结合的方法发现心衰（HF）患者（n=30例）血浆miR-423-5p表达量显著高于正常对照（n=30例），也明显高于非HF的呼吸困难患者（n=20例），提示血浆miR-423-5p对HF的潜在诊断价值。4 结语

体液miRNA作为生物标志物的研究尚处于初期，迄今研究的病种还不全面，所检测的病例数也有有miRNA的检测方法尚待改善和优化。此外，限，

关体液miRNA的来源、功能、分泌和变化机制等问题也有待进一步阐明。参考文献

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