高山红景天叶片愈伤组织诱导与植株再生

第３５卷第２期　东北林业大学学报　Ｖｏ１．３５　Ｎｏ．２　２００７年２月　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＮＯＲＴＨＥＡＳＴ　ＦＯＲＥＳＴＲＹ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　Ｆｅｈ．２ｏｏ７　高山红景天叶片愈伤组织诱导与植株再生　’　刘剑锋　阎秀峰　李　霞程云清　（东北林业大学，哈尔滨，１５００４０）　（吉林师范大学）　摘要以高山红景天叶片作为外植体，研究了影响愈伤组织诱导、芽增殖、生根的主要因素。结果表明：高　山红蒂天叶片切堤诱导愈伤组织的最佳培养基为ＭＳ＋６一ＢＡ　２　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．５　ｍｇ／Ｌ，诱导率达８８．３３％；高山红　景天叶片切块经诱导可产生３种色泽的愈伤组织，其中只有绿色愈伤组织诱芽容易，绿色愈伤组织在附加１　ｍｇ／Ｌ　６一ＢＡ＋０．１　ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ的Ｍｓ培养基中有利于芽的分化和增殖，培养７周左右，平均每个外植体分化形成的再生　小植株数迭到２１．３３个；增殖苗转入１／２　ＭＳ培养基中生根率高迭１００％。　关键词高山红舌天；组织培养；叶片　分类号Ｑ９４５．７９　Ｃａｌｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｌａｎｔｌｅｔ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｌｅａｆ　Ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｏｆ鼢。饿。　ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ　Ａ．Ｂｏｒ．／Ｌｉｕ　Ｊｉａｎｆｅｎｇ．　Ｙａｎ　Ｘｉｕｆｅｎｇ（Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１　５００４０，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）；Ｌｉ　Ｘｉａ，Ｃｂｅｎｇ　Ｙｕｎｑｉｎｇ（Ｊｉｌｉｎ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉ　ｖｅｒｓｉｔｙ）／／Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．一２００７，３５（２）．一３３—３４　Ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　ｃａｌｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｂｕｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｒｈｏｄｉｏｌａ　ｓａｃｈａ—　ｌｉｎｅｎｓｉｓ　ａｓ　ｅｘｐｌａｎｔｓ．Ｒｅｓｕｈ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｃａｌｌＵＳ　ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｆ　ｓｅｇｍｅｎｔｓ　ｗａｓ　ＭＳ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎ—　ｔｅｄ　ｗｉｔｈ　２　ｍｒ，／Ｌ　６一ＢＡ　ａｎｄ　０．５　ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃａｌｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ　ｒａｔｅ　ｒｅａｃｈｅｄ　８８．３３　ｐｅｒｃｅｎｔ．Ｙｅｌｌｏｗ，ｇｒｅｅｎ　ａｎｄ　ｒｅｄ　ｃａｌｌｕｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｆ　ｓｅｇｍｅｎｔｓ，ｈｕｔ　ｏｎｌｙ　ｇｒｅｅｎ　ｃａｌｌｕｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｏ　ｂｕｄ　ｅａｓｉｌｙ．Ｔｈｅ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｓｕｐｐｌｅ—　ｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　１　ｍｇ／Ｌ　６一ＢＡ　ａｎｄ　０．１　ｎｌｇ／Ｌ　ＮＡＡ　Ｗａｓ　ｆａｖｏｒａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｕｄｓ．ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｖｅｒ—　ａｇｅ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｐｌａｎｄｅｔｓ　ｆｏｒ　ｅａｃｈ　ｅｘｐｌｎａｔ　ｗａｓ　２１．３３　ａｆｔｅｒ　７　ｗｅｅｋｓ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅ．Ａｌｌ　ｔｈｅ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｃｏｕｌｄ　ｔａｋｅ　ｒｏｏｔ　ａｆｔｅｒ　ｂｅｉｎｇ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｔｏ　１／２　ＭＳ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｒｈｏｄｉｏｌａ　ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ　Ａ．Ｂｏｒ．：Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌｅａｖｅｓ　高山红景天（Ｒｈｏｄｉｏｌａ　ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ）是景天科（Ｃｒａｓｓｌｕａｃｅ—　０．５　ａｍ的小块，转接到附加不同质量浓度植物生长调节剂的ＭＳ　ａｅ）红景天属（Ｒｈｏｄｉｏｌａ）多年生草本植物”　，也是我国著名药　培养基上进行不定芽诱导。待诱导出的不定芽长至２—３　ａｍ，切　用植物。它具有抗疲劳、抗衰老、抗缺氧、抗辐射等功能，在运　下接入增殖培养基ＭＳ中，添加不同质量浓度植物生长凋节剂进　动医学、军事医学、航天医学等领域备受重视　Ｊ。但高山红　行培养。每个处理接５瓶，每瓶接２个不定芽，重复３次。　景天生境特殊，分布区范围十分狭窄，经济贮量少，自然萌发　生根培养：将增殖培养所得的２　ｅｍ以上的健壮苗切割下来，　率低，加之近年来一些地区大量收购，致使其资源遭到严重破　转入生根培养基中，进行生根培养，基本培养基选用１／２　ＭＳ。　坏，蕴藏量急剧下降，种群处于严重濒危状态　。因此，组织　移栽：移栽前将生根苗的三角瓶盖打开，于２５℃、散射光　培养快繁与离体保存相结合是进一步开发利用高山红景天的　下炼苗３—４　ｄ，然后取出小苗洗净根部培养基，移栽于疏松腐　重要途径。本研究以叶片为外植体，对影响高山红景天愈伤　殖质壤土中，并加盖透光塑料杯，１周后移栽至大田。　组织诱导、芽诱导及生根条件进行了探讨，为高山红景天的快　培养条件：以上培养基ｐＨ值均为５．８，琼脂６　ｇ／Ｌ，蔗糖　速繁殖及离体保存研究提供依据。　２５　Ｌ，在１．２　ｋｇ・ｅｍ　压力下灭菌２０ｍｉｎ　接种后置于培养　１材料和方法　温度（２２±２）℃，光照强度为１　０００—１　５００　ｌｘ，每天光照１２　ｈ　的ＧＸＺ一１６０型智能光照培养箱（北京北方科仪）中培养。　１，１试验材料　２００４年２月取来长白山的高山红景天２年生苗，移栽于　２结果与分析　吉林师范大学生命科学学院药用植物标本园中，３月芽体开　２．１　不同生长调节剂组合的培养基对愈伤组织诱导的影响　始萌动，５月取小苗顶端幼嫩叶片作为供试材料。　高山红景天叶片外植体在接种至附加不同质量浓度植物　１．２试验方法　生长激素的ＭＳ培养基后，经过一段时问培养均可产生愈伤　材料清毒处理：将高山红景天叶片剪下，在流水下冲洗１　组织，但叶片在不同培养基上愈伤组织诱导率存在十分明显　ｈ，在无菌工作台上，用７０％的酒精浸泡３０　Ｓ，再用０．１％的升　的差异（表１）。培养８周后，在添加１．０　ｍｇ／Ｌ　６一ＢＡ和０．２　汞溶液浸泡８—１０　ｍｉｎ，无菌水冲洗５次。　ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ的Ｍｓ培养基上开始形成绿色愈伤组织，但愈伤组　愈伤组织诱导：用消毒滤纸吸干叶片的表面水分，将其基　织诱导率很低，仅为２１．６７％；而在添加２．０　ｍｇ／Ｌ　６一ＢＡ和　部剪成１　ｃｎｌ×１　ａｍ左右的小片，以ＭＳ为基本培养基，添加不　０．５　ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ的ＭＳ培养基上形成了黄、红、绿等不同色泽　同质量浓度的植物生长调节剂进行愈伤组织诱导培养。　的愈伤组织，其中黄色与红色愈伤组织结构疏松，而绿色愈伤　不定芽诱导与增殖：将绿色颗粒状愈伤组织切成０．３　ｃｍ×　组织相对致密，且诱导率高达８８．３３％（图１中ａ—ｃ），其中绿　色、黄色与红色愈伤组织分别占６５．９８％、１２．６７％与９．６７％。　１）黑兜江省　士后琏金资助（Ｎｏ．ＬＢＨ—Ｚ０５０１４）。　随着６一ＢＡ与ＮＡＡ质量浓度的上升，愈伤组织诱导率迅速　第一作者简介：刘剑锋，男，１９７６年１０月生，东北林、　Ｉ大学生命　科学学院做博士后研究。现任吉林省师范大学生命科学学院，副教授　下降，其形成的愈伤组织色泽有黄、绿２种，且生长较为迅速。　通讯作者：　秀峰，东北林业大学生命科学学院，教授。　添加不同质量浓度的２，４一Ｄ对愈伤组织的诱导能力较低，　收稿口期：２００６年４月７　Ｈ。　生成的愈伤组织均为绿色，生长十分缓慢。综上所述，不同植　责任编辑：潘华。　物激素组合的培养基对叶片外植体的愈伤组织牢均有明显影　维普资讯 http://www.cqvip.com

东北林业大学学报　第３５卷　响，但添加２．０　ｍ＃Ｌ　６～ＢＡ和０．５　ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ的Ｍｓ培养基　分裂素浓度与生长素浓度的比值控制　Ｊ。在本研究中，以高　对叶片愈伤组织诱导最为有效。　表１　不同质量浓度的生长调节剂对叶片Ｊ敷伤组织形成的影响ｍｇ・Ｌ一　２．２不同生长调节剂组合的培养基对愈伤组织出芽率的影响　以添加２．０　ｍ＃Ｌ　６一ＢＡ和０．５　ｍ＃Ｌ　ＮＡＡ的ＭＳ培养基　诱导产生的愈伤组织作为外植体，以相同成分的培养基进行　３次继代培养后，愈伤组织生长十分旺盛，此时将不同色泽的　愈伤组织转移到不同的芽分化培养基上进行培养，结果表明　黄色与红色的出芽率均极低，在不同芽分化培养基上平均每　个外植体出芽数低于３个，而绿色的出芽率相对则要高得多；　将绿色愈伤组织转至不同诱导培养基后，２周内愈伤组织体　积显著增大，４～５周后形成丛生不定芽（图１中ｄ），部分产　生白色不定根，不同培养基对愈伤组织出芽率的影响如表２　所示，在不添加６一ＢＡ和ＮＡＡ的培养基上，出芽外植体数目　很少，在附加１．０　ｍ　Ｌ　６一ＢＡ和０．１　ｍ＃Ｌ　ＮＡＡ或２．０　ｍ吕／Ｌ　６一ＢＡ和０．２　ｍ　Ｌ　ＮＡＡ的ＭＳ培养基上，外植体出芽率均达　到１００％；但在附加１　ｍ＃Ｌ　６一ＢＡ和０．１　ｍｓ／Ｌ　ＮＡＡ的ＭＳ培　养基上，平均每个外植体出芽数目较后者高得多。此后，随着　６一ＢＡ和ＮＡＡ质量浓度的升高，出芽外植体比例明显降低，　平均每个外植体出芽数目很少。因此，附加１．０　ｍ＃Ｌ　６一ＢＡ　和０．１　ｍ＃Ｌ　ＮＡＡ的ＭＳ培养基作为高山红景天诱芽培养基　是较为适宜的。　表２高山红景夭愈伤组织在不同培养基的成芽率　洼：外植体出芽数中相同字母表示邓肯氏新复极差法检验在０．０５水　平上差异不显著。　２．３继代培养　将愈伤组织产生的丛芽分别接种到附加１．０　ｍｇ／Ｌ　６一　ＢＡ和０．１　ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ的ＭＳ培养基上，芽开始增殖，每３Ｏ一６Ｏ　ｄ继代１次，增殖４—６倍。分生芽逐渐形成独立小植株，部　分丛芽可长出幼根。　２．４生根与移栽　切取高２—３　ｃｍ的芽体，接种于１／２　ＭＳ培养基上，５—７　ｄ　即可产生根原基突起。１Ｏ～１５　ｄ后，根长５～６　ｃｍ，平均每株　生根９条，生根率达１ｏ０％（图１中ｅ）。待苗高达４　ｅｍ以上　进行移栽，移栽成活率达９５％以上（图１中ｆ）。　３讨论　激素是植物组织培养器官分化的关键因素，形成器官的　类型由培养基中不同激素的相对浓度控制，而不是这些物质　的绝对浓度决定　。Ｓｋｏｏｇ和Ｍｉｌｌｅｒ在１９５７年的经典实验已　表明在烟草组织培养中，器官的形成可由培养基中所含细胞　山红景天叶片作为外植体，全面研究其愈伤诱导形成的适宜　条件：在愈伤组织诱导方面，以附加２．０　ｍ＃Ｌ　６一ＢＡ和０．５　ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ的ＭＳ为愈伤诱导培养基，６一ＢＡ与ＮＡＡ比值为　４，愈伤组织诱导容易，诱导率可达８８．３３％，在形成不同颜色　的愈伤组织中，分化成芽能力存在巨大差异，其中以绿色愈伤　组织最易诱导成芽；在芽诱导与增殖方面，采用附加１．０　ｍｒ：／　Ｌ　６一ＢＡ＋０．１　ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ的ＭＳ作为芽分化和增殖培养基，６　一ＢＡ与ＮＡＡ比值为１Ｏ，可促进芽的大量形成；在根诱导方　面，使用简单１／２　ＭＳ培养基可使芽体１００％生根。本研究过　程中所获得的大量愈伤组织和试管苗，直接为高山红景天种　质资源离体保存提供了材料；其愈伤诱导、芽诱导增殖及根诱　导条件为高山红景天离体保存材料的植株再生与快速繁殖提　供了技术平台。　图１　高山红景关叶片组织培养　ａ．黄色愈伤；ｂ．绿色愈伤，表面形成大量的芽；ｃ．红色愈伤；ｄ．愈伤　诱导形成从生芽，愈伤下面已经有根形成；ｅ．芽经根诱导形成大量根　系；￡移栽后成活的高山红景天试管苗　参考文献　［１］张萍，申家恒．高山红景天胚胎学研究［Ｊ］．植物研究，１９９８，１８　（１）：３８—４５．　［２］　明海泉，夏光成，张瑞钓．红景天研究进展［Ｊ］．中草药，１９８８，１８　（５）：３７—４２．　［３］　吴双秀，尚辛亥，戴绍军，等．高【ＩＪ红景添年龄与根部红景天甙　含量的关系［Ｊ］．植物研究，２００１，２１（２）：２５２—２５７．　［４］　祖元刚，庸艳．高山红景天有性生殖过程放濒危原因的生态学　分析［Ｊ］．植物研究，１９９８，１８（３）：３３６—３４０．　［５］摧澄　植物激素与细胞分化及形态发生的关系［Ｊ］．细胞生物学　杂志，１９８３，５（２）：１—５．　［６］Ｓｋｏｏｇ　Ｆ，Ｍｉｌｌｅｒ　Ｃ　０．Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｒ％ｎａｌａｔｉｏｎ　ｏｆｔ：ｇｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｏｒｇａｎ　ｆｏｒ－　ｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｅｔｌｏｎ　ｏｆ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ，Ｓｙｒｕｐ　Ｓｏｃ　Ｅｘｐ　Ｂｉｄ，１９５７，ｌ１：ｌ１８—１３１．