张立成;吴春蓉;佟恩来
【摘 要】The Nitrosation denitrifying phosphorus accumulating organisms (NDPAOs) with nitrite as electronic acceptors can realize the simultaneous removal of nitrogen and phosphorus, reduce the demand of carbon source and oxygen to the greatest extent, so it will greatly reduce the energy consumption and save the cost. The characteristics of phosphorus release of seven varieties of NDPAOs: Ent., Sta, Par., Pan., Kle., Bac. and Mor. were studied through the experiment, and the growth characteristics of those organisms were studied by pure culture. The results showed that, after 20 h of anoxic reaction, the phosphorus uptake of Sta., Bac., Par., Kle., Pan., Ent. and Mor. were 1.98 × 10-11, 1.64 × 10-11, 1.43 × 10-11, 1.13 × 10-11, 9.59 × 10-12, 7.72 × 10-12 and 6. 28 × 10-12 mg/cfu respectively. The lag phase of Ent., Kle., Bac., Pan., Par., Sta. and Mor. were almost all in 0 - 6 h, and the logarithmic phase of them were 6 - 144, 6 - 72, 6 - 96, 6 - 52, 6 - 31, 6 - 96 and 6 - 72 h respectively. The logarithmic phase growth rates of Par., Sta., Pan. and Mor. were smaller than that of Ent., Bac. and Kle. The growth characteristics of different NDPAOs were also incompletely the same; especially the growth rates and the maintenance time in logarithmic phase were in large difference.%亚硝化反硝化聚磷菌(NDPAOs)以亚硝酸盐为电子受体,具有同时脱氮除磷的特点,能够最大程度地减少碳源和氧气需求,因此可以大大减少能耗,节约成本.试验研究了7种NDPAOs——肠杆菌属(Ent.)、葡萄球菌属(Sta.)、副球菌属(Par.)、泛菌属(Pan.)、克雷伯氏菌属(Kle.)、芽孢杆菌属(Bac.)
和莫拉氏菌属(Mor.)的释磷特性,并以纯培养的方式研究了它们的生长特性.结果表明,缺氧反应20 h后,Sta.、Bac.、Par.、Kle.、Pan.、Ent.和Mor.的单位细胞吸磷量分别为1.98×10-11、1.64×10-11、1.43×10-11、1.13×10-11、9.59×10-12、7.72×10-12 和6.28×10-12 mg/cfu.Ent.、Kle.、Bac.、Pan.、Par.、Sta.和Mor.的缓慢期几乎都处于0～6h之间,对数期分别为6～144、6～72、6～ 96、6～ 52、6～31、6～96和6～72h.Par.、Sta.、Pan.和Mor.的对数期的生长速率较Ent.、Bac.和Kle.的小.不同菌属的亚硝化反硝化聚磷菌的生长特性也不完全相同,特别是对数期的生长速率以及维持的时间相差较大. 【期刊名称】《工业用水与废水》 【年(卷),期】2012(043)004 【总页数】5页(P16-19,32)
【关键词】亚硝化反硝化聚磷菌;亚硝化反硝化除磷;生长曲线;吸磷特性 【作 者】张立成;吴春蓉;佟恩来
【作者单位】沈阳建筑大学市政与环境工程学院,沈阳 110168;沈阳建筑大学建筑设计研究院,沈阳 110168;沈阳建筑大学市政与环境工程学院,沈阳 110168;营口隆晟市政工程有限公司,辽宁营口 115001 【正文语种】中 文 【中图分类】X172
反硝化除磷已经成为国内外污水处理领域研究的重点和热点，反硝化除磷即聚磷和反硝化脱氮这2个生物过程在缺氧环境下由同一类微生物一并完成［1－3］。目前国内外关于反硝化除磷的研究大多是以硝酸盐为电子受体，既然能以硝酸盐为电
子受体，那么就有可能以亚硝酸盐为电子受体。蒋轶锋等［4］采用序批式污泥培养方式证明了反硝化聚磷菌（DPAOs）对较高浓度NO2－－N（以N计，30 mg/L）的有效利用。
对以亚硝酸盐为电子受体的反硝化除磷特性的研究只停留在活性污泥的培养方式上，对于以纯培养的方式来研究亚硝化反硝化聚磷菌（NDPAOs）的特性的试验还很少。大多数生物工艺利用的是处于稳定期的微生物活性，因为缓慢期的微生物不能适应新环境进而不能很好地起作用；对数期的微生物具有很高的能量水平，因而不能形成良好的污泥絮体，出水仍然不能满足要求；衰退期的微生物活性已经大大降低，处理污水的速率也就变慢，耗时较长；微生物只有处于稳定期时才既有较好的活性，又能相互粘附，形成沉降性能好的污泥，处理污水可达到出水要求。本试验研究了7种NDPAOs的生长特性，确定了各种菌的缓慢期、对数期、稳定期以及衰退期，为亚硝化反硝化除磷奠定了理论基础。 1.1 菌种来源
取连续流双污泥亚硝化反硝化除磷系统的缺氧池中污泥接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，待长出菌落后，挑取菌落特征明显的10个菌落进行分离纯化，并对纯化后的菌株进行革兰氏染色、接触酶、氧化酶、柠檬酸盐利用、葡萄糖氧化发酵、糖醇类发酵、甲基红（M.R）、V－P测定、硝酸盐还原、亚硝酸盐还原、吲哚和明胶液化等一系列生理生化试验，试验结果根据文献［5－6］进行检索鉴定，最终得到了肠杆菌属（Ent.）、葡萄球菌属（Sta.）、副球菌属（Par.）、泛菌属（Pan.）、克雷伯氏菌属（Kle.）、 芽孢杆菌属（Bac.）和莫拉氏菌属（Mor.）7种菌。对以上7种菌进行缺氧反硝化吸磷试验，试验结果表明其为NDPAOs。 1.2 培养基
（1）牛肉膏蛋白胨固体培养基［7］：每升蒸馏水中加入10 g蛋白胨、3 g牛肉膏、5 g NaCl和20 g琼脂条，pH值为7.2。
（2）牛肉膏蛋白胨液体培养基［8］：每升蒸馏水中加入10 g蛋白胨、3 g牛肉膏和5 g NaCl，pH值为7.2。
（3）限磷培养液［9］：每升蒸馏水中加入3.32 g CH3COONa·3H2O、22.98 mg Na2HPO4·2H2O、152.76 mg NH4Cl、81.12 mg MgSO4·7H2O、17.83 mg K2SO4、11 mg CaCl2·2H2O、7 g HEPES缓冲溶剂和2 mL微量元素，pH值为7.0。微量元素构成：每升蒸馏水中加入50 g EDTA、5 g FeSO4·7H2O、1.6 g CuSO4· 5H2O、5 g MnCl2·4H2O、1.1 g（NH4）6Mo7O24·4H2O、50 mg H3BO3、10 mg KI和50 mg CoCl2·6H2O。
（4）富磷培养液：每升蒸馏水中加入 0.2 g NaNO2、35.11 mg K2HPO4·2H2O、305.52 mg NH4Cl、91.26 mg MgSO4·7H2O、25.68 mg CaCl2·2H2O、8.5 g PIPES缓冲溶剂和2 mL微量元素，pH值为6.8。 1.3 菌种吸磷试验
将本试验分离纯化出来的亚硝化反硝化聚磷菌首先在限磷培养液中厌氧培养24 h（摇床，30℃，150 r/min），以消耗菌体内的聚磷颗粒。厌氧培养后的菌液先离心（15 min，4 000 r/min），将离心后的菌液用无菌水洗涤后再离心，将菌液放在富磷培养液中缺氧培养20 h以上，检测培养液中亚硝态氮和磷的浓度变化。 1.4 菌种生长曲线研究
取菌株Ent.、Sta.、Par.、Pan.、Kle.、Bac.和Mor.接种至牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基中，放入30℃恒温培养箱中培养24 h。取斜面菌苔接种至150 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，缺氧培养（摇床，30℃，150 r/min）48 h后，菌悬液离心（15 min，4 000 r/min），弃去上清液，沉淀用无菌水洗涤2次后，用少量无菌水配成菌悬液，并用可见分光光度计在600 nm下测定其光密度（OD）值，并进行浓度调节，使菌株菌悬液的OD值相等。
分别取各菌种的菌悬液3 mL接种至300 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中缺氧培养
（摇床，30℃，150 r/min），定时取样测定菌液的OD值。 2.1 菌种吸磷试验
分别将Ent.、Sta.、Par.、Pan.、Kle.、Bac.和Mor.在限磷培养液中厌氧培养24 h，然后在富磷培养液中缺氧培养20 h以上，富磷培养液中磷酸盐和亚硝态氮的浓度变化如图1、图2所示。
由于各种菌的初始浓度不同，因此图1、图2中只能反映出7种菌都具有反硝化吸磷的能力，吸磷能力的强弱可以从表1中得知。
从表1可以看出，单位细胞的反硝化量均大于吸磷量，但单位菌株的吸磷量与反硝化量的比值并不确定；反硝化能力强的菌株吸磷能力同样强，反之亦然。缺氧20 h后，Sta.的吸磷能力最强，Mor.最弱。Sta.的反硝化和吸磷的效果都是最好的；Pan.的反硝化能力比Kle.强，但吸磷能力却比它弱，分析原因可能是Kle.的菌株可以硝态氮为电子受体也可以亚硝态氮为电子受体来聚磷，因为在亚硝化池也能很容易产生硝态氮的积累；与李相昆［9］、鲍林林［10］以硝态氮为电子受体的连续流双污泥系统相比，吸收单位质量的磷酸盐需要的亚硝态氮明显多于硝态氮的结论相一致。 2.2 菌种生长曲线研究
Ent.、Kle.、Bac.、Pan.、Par.、Sta.和Mor.的生长曲线如图3所示。菌种的生长曲线大致分为缓慢期、对数期、稳定期和衰亡期，从图3可以看出7种菌的生长曲线都有较明显的这4种时期。7种菌的缓慢期几乎都处于0～6 h之间，表明7种菌的适应时间均为6 h左右，而Sta.较其它6种菌能更快地适应新的环境，大概在4 h左右就开始有了明显的增长趋势。在缓慢期，菌体增长趋势不明显，但也有所增长，因为细菌刚接种到新的培养液中，不能很快适应新环境，一时缺乏分解底物的酶，需要一定的时间来合成。对数期的菌种因为营养丰富呈几何级数增长，7种菌的对数期不完全相同，Ent.、Bac.和Kle.生长曲线中对数期的斜率较Par.、
Sta.、Pan.和Mor.小，说明后者在对数期的生长速率较前者小。
Ent.在对数期虽然生长速率不及Par.、Sta.、Pan.和Mor.，但是它的对数期时间较长，从图3可知它的对数期处于6～144 h之间。Kle.的对数期处于6～72 h之间，但是在72～144 h之间菌体也有少量的增长。Bac.的生长曲线起伏较其它几种菌大，可以认为对数期处于6～96 h之间，在45～52 h之间的生长速率很慢，但52～72 h之间增长速率有所提高，72～77 h之间出现了负增长，可能是由于取样的时候没有充分摇匀，取到的是悬浮菌体较少的上清液，也可能是测数过程中的偶然因素造成的（经再次试验验证菌体的增长速率是正值）。Pan.的对数期为6～52 h之间，增长速率是7种菌中最快的。Par.的对数期处于6～31 h之间，在此期间增长速率很快，但是对数期的时间是7种菌中最短的，只有1 d左右。Sta.的对数期处于6～96 h之间，6～22 h之间的增长速率最快。Mor.的对数期处于6～72 h之间，较其它7种菌的优势是生长速率快并且维持时间长。
稳定期由于营养物质已经被对数期大量增长的菌体消耗将尽，不能为菌体的继续生长提供充足的营养，使得菌体数量仅有少量的增长或没有增长，维持稳定。从图3可以看出处于稳定期的各种菌菌体量从大到小依次为 Pan.、Ent.、Mor.、Bac.、Sta.、Kle.、Par.。
Ent.的生长曲线在144 h之后出现了下降，继之呈现出了稳定趋势，并且稳定时已经有了较高的菌体浓度，Kle.在稳定期时菌体还有少量增长，Bac.在稳定期时菌体几乎没有增长，Pan.在稳定期时有着最高的菌体量，Par.的稳定期处于31～127 h之间，稳定期较长，Sta.的稳定期趋势与Ent.相同，在96 h之后出现了下降继之呈现出了稳定趋势，Mor.在72 h之后菌体量几乎保持不变。
由于此生长曲线测定的是菌悬液中活菌和死菌的总悬浮浓度，因此生长曲线不能明显体现出衰亡期活菌的下降趋势，而是维持在稳定期时的OD值。但是Par.的生长曲线却出现了明显的下降趋势，这是由于Par.的对数期较短，只有1 d左右，
并且在对数期之后有4 d左右的稳定期，在稳定期的103～127 h之间已经有少量的菌体开始死亡，死亡的菌体在三角瓶中培养时间较长就会上浮至培养液表面，此现象在三角瓶中能很明显地观察到。而取样时虽然混合了菌体，但是上浮的菌体尸体并不能混合到菌悬液中，因此测得的OD值基本是由活菌引起的，这与理论上衰亡期的活菌数量会不断减少相符。
(1）7种NDPAOs——Sta.、Bac.、Par.、Kle.、Pan.、Ent.和Mor.具有不同程度的吸磷能力，且其吸磷能力依次降低。
（2）不同种属的 NDPAOs的生长特性不同。缓慢期几乎都处于0～6 h之间，Ent.的对数期为6～144 h，Kle.的对数期为6～72 h，Bac.的对数期为6～96 h，Pan.的对数期为6～52 h，Par.的对数期为6～31 h，Sta.的对数期为6～96 h，Mor.的对数期为6～72 h。
（3）确定了7种NDPAOs的稳定期的起点时间以及维持的时长，不仅为以纯培养的方式研究NDPAOs的其它特性提供了理论依据，也为亚硝化反硝化除磷工艺的某些条件控制提供了理论依据。
（4）Ent.、Sta.、Pan.、Kle.、Bac.和Mor.的生长周期大致为7 d，而Par.的生长周期大致为5 d。
【相关文献】
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