尿草酸的的测定

一、离子色谱法

离子色谱分离的原理是基于离子交换树脂上可离解的离子与流动相中具有相同电荷的溶质，离子之间进行的可逆交换和分析物溶质对交换剂亲和力的差别而被分离。适用于亲水性阴、阳离子的分离。离子色谱仪分离测定常见的阴离子是它的专长，一针样品打进去，约在20分钟以内就可得到7个常见离子的测定结果，这是其他分析手段所无法达到的，关于阳离子的测定离子色谱法与AAS和ICP法相比则未显示出优越性。

离子色谱仪包括离子交换柱和电导检测，离子交换柱需经过0.036mol/L硫酸再生液和高纯水处理，洗脱液为17.5mol/L碳酸钠和3.5mmol/L碳酸氢钠配制而成。经常检测的常见离子有：

阴离子：F-, Cl-, Br-, NO2-,PO43-, NO3-, SO42-，甲酸，乙酸，草酸等。

阳离子：Li+, Na+, NH4+, K+,Ca2+, Mg2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+,Fe3+等。 样品处理：先将24小时尿标本以30ml,6mol/L浓盐酸处理，使其pH 为1.0-2.5。取部分样本，用高纯水以20：1 比例稀释，装于注射器中，以0.2μm 有机系微孔滤膜过滤以清除可能阻塞的离子交换柱的杂质，每次推注2ml。标本经过离子交换柱的分离和浓集后进入分析程序。

取10μg/L浓度的溴酸根离子标准溶液，在上述条件下重复进样9次，计算其的相对标准偏差(RSD)。草酸离子的保留时间、峰高、峰面积的RSD分别为：0．20％,0.69％,0.63％。该方法的线性范围为0.1-1.0mg/L，平均回收率为96.5%-105.2%，CV=3.1%，其检测下限浓度为1.0μg/L，日内和日间精密度RSD＜6.1%.张泽的研究发现，其最小检测值为0.04ppm，RSD＜1.5%。该法操作简单，检测精度高，可以批量检测，同时可以测定尿液枸橼酸。

二、 高效液相色谱法

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \\ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液

相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。

样品处理：先将24 小时尿标本以30ml 6mol/L 浓盐酸，使其PH 为1.0-2.5。然后以0.22mm孔径有机滤过膜滤过。取续滤液0.5ml，加入25mg 磺基水杨酸溶解，混匀，4℃放置30min后，12000r/min离心10min，取清亮尿液供作样本，再以0.45μm 聚丙烯滤膜过，即可进样测定。测定色谱条件为：检测波长210nm，反相C18 色谱柱，流动相为0.25%磷酸二氢钾（含0.0025mmol/L 四丁基硫酸氢铵，硼酸调PH至2.0）。测定草酸和枸橼酸的浓度范围分别为0.0-4.0mmol/L和0.0-16mmol/L，最低定量限为0.2μmol/L 和1.0μmol/L，回收率为97%和102%，日内和日间精密度RSD＜4.0%。该法的优点也是可以同时测定尿液中草酸和枸橼酸。

三、毛细管电泳法

毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE),是近年来发展最快的分析方法之一，是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间滴度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm内径毛细管柱内用高电压进行分离,创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten建立了毛细管等电聚焦,Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。1988～1989年离相结合的产物。CE和高效液相色

谱法(HPLC)相比,其相同处在于都是高效分离技术,仪器操作均可自动化,且二者均有多种不同分离模式。二者之间的差异在于：CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间,CE的分析时间通常不超过30min,比HPLC速度快；对CE而言,从理论上推得其理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比。检测器则除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外,其它类型检测器均已和CE实现了连接检测；一般电泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自动化程度比普通电泳要高得多。总之,CE的优点可概括为三高二少：高灵敏度,常用紫外检测器的检测限可达10-13～10-15mol,激光诱导荧光检测器则达10-19～10-21mol；高分辨率,其每米理论塔白质,1.7min分离19种阳离子,3min内分离30种阴离子；成本低,只需少量(几毫升)流动相和价格低廉的毛细管。由于以上优点以及分离生物大分子的能力,使CE成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。

CE和高效液相色谱法(HPLC)相比,其相同处在于都是高效分离技术,仪器操作均可自动化,且二者均有多种不同分离模式。二者之间的差异在于：CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间,CE的分析时间通常不超过30min,比HPLC速度快；对CE而言,从理论上推得其理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比,对扩散系数小的生物大分子而言,其柱效就要比HPLC高得多；CE所需样品为nl级,最低可达270fl,流动相用量也只需几毫升,而HPLC所需样品为μl级,流动相则需几百毫升乃至更多；但CE仅能实现微量制备,而HPLC可作常量制备。

样品处理：24 小时尿液中加入30ml 6mol/L 盐酸防腐，硼酸调节尿液PH1.5-2.5，无法立即测定的样本保存于4℃，测定前50-60℃水浴10min溶解草酸结晶，分析前以去离子水稀释100 倍。测定条件使用聚胺覆膜的熔融硅胶毛细管作为载体，汞灯254nm 检测，电解液含130mg/L 氯化钠，22mg/L 硫酸钠，155mg/L磷酸。本法回收率为94%-101%，日间和日内RSD＜5.6%。

四、酶法

酶分析法是一种生物药物分析方法。酶分析法在生物药物分析中的应用主要有两个方面：①以酶为分析对象，根据需要对生物药物生

产过程中所使用的酶和生物药物样品所含的酶进行酶的含量或酶活力的测定，称为酶分析法；②利用酶的特点，以酶作为分析工具或分析试剂，用于测定生物药物样品中用一般化学方法难于俭测的物质，如底物、辅酶、抑制剂和激动剂(活化剂)或辅助因子含量的方法称为酶法分析。

酶是一种专一性强、催化效率高的生物催化剂。利用酶的这些特点来进行分析的酶法分析，与其他分析方法相比有许多独特的优点。当待测样品中含有结构和性质与待测物十分相似(如同分异构体)的共存物时，要找到被测物特有的特征性质或者要将被测物分离纯化出来，往往非常困难。而如果有仅作用于被测物质的酶，利用酶的特异性，不需要分离就能辨别试样中的被测组分，从而对被测物质进行定性和定量分析。所以，酶法分析常用于复杂组分中结构和物理化学性质比较相近的同类物质的分离签定和分析，而且样品一般不需要进行很复杂的预处理。酶法分析具有特异性强，干扰少，操作简便，样品和试剂用量少，测定快速精确，灵敏度高等特点。通过了解酶对底物的特异性，可以预料可能发生的干扰反应并设法纠正。在以酶作分析试剂测定非酶物质时，也可用偶联反应，而且偶联反应的特异性，可以增加反应全过程的持异性。此外，由于酶反应一般在温和的条件下进行，不需使用强酸强碱，它还是一种无污染或污染很少的分析方法。很多需红使用气相色谱仪、高压液相色谱仪等贵重的大型精密分析仪器才能完成的分析检验工作，应用酶法分析方法即可简便快速地进行。

样品处理：24小时尿液样品加入30ml 浓盐酸，酸化尿液PH至1.0-2.0，取10ml 尿液以10mmol/L EDTA 稀释至PH5.0。取1ml 稀释尿液，加入300mg 活性碳后行低速离心，取上清液0.05ml 进行酶试剂反应，反应液于590nm 测定吸光度。测定试剂中的草酸氧化酶能氧化草酸生成过氧化氢和二氧化碳，过氧化物酶对生成的过氧化氢进行定量，从而计算出草酸的量。该法线性范围为0-2.0mmol/L，精密度RSD＜2.18%，平均回收率100.5%。

五、比色法

比色法(colorimetry)是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来

确定待测组分含量的方法。早在公元初古希腊人就曾用五倍子溶液测定醋中的铁。1795年，俄国人也用五倍子的酒精溶液测定矿泉水中的铁。但是，比色法作为一种定量分析的方法，大约开始于19世纪30～40年代，以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。比色法作为一种定量分析的方法，开始于19世纪30～40年代。比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。

常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律(A=εbc)为基础。常用的目视比色法是标准系列法，即用不同量的待测物标准溶液在完全相同的一组比色管中，先按分析步骤显色，配成颜色逐渐递变的标准色阶。试样溶液也在完全相同条件下显色，和标准色阶作比较，目视找出色泽最相近的那一份标准，由其中所含标准溶液的量，计算确定试样中待测组分的含量。光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。但光电比色计采用钨灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能得到一定波长范围的复合光，而不是单色光束，还有其它一些局限，使它无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。20世纪30～60年代，是比色法发展的旺盛时期，此后就逐渐为分光光度法所代替。

样本处理：按1ml浓盐酸：100ml尿加入浓盐酸保存24h尿。取尿0.5ml加水1.5ml，麝香草酚蓝指示剂一滴，用1mol/L 碳酸氢钠调PH 至7.0。加饱和硫酸钙溶液2ml，摇匀后加入无水乙醇14ml，摇匀，密闭，常温下放置3 小时以上。2000r/min离心10min，弃上清液，倒入1mol/L 硫酸2ml 中。加入锌粒，沸水浴30min。蒸发至剩余液少于0.5ml。用小勺的玻璃棒移锌粒至管扣，用10g/L 变色酸液

0.5ml 冲洗锌粒，冲洗液全部入管内，移出锌粒。缓慢向试管中加入浓硫酸，混合，沸水浴30ml。冷却，用1mol/L 硫酸补至10ml，混合，离心取上清液，570nm 波长比色，回收率在89%-98%之间。