蛋白质工程在农业或医药方面的应用

蛋白质工程在农业或医药方面的应用

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蛋白质工程的研究进展及其农业医药应用展望

摘要：蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术，是生物工程中五大工程之一，本文对蛋白质工程作了简要概述，介绍了蛋白质工程的特点，并从蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测 、蛋白的创造和改造等方面对蛋白质工程研究内容进行详细论述，并以实例作了蛋白工程的应用。随着社会和技术的不断发展，蛋白质工程技术在农业和医药方面的作用越来越突出，必将为社会的发展和许多重大社会问题的解决提供极大的支持。

关键词：蛋白质工程特点；研究内容；农业应用；医药应用；展望

蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。

蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新

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的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。

目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。

1 概念

按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等。为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功能，常对已知的其他蛋白质进行模式分析或采取分子进化等手段。

2 蛋白质工程基本途径

从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸（基因）

3 蛋白质工程研究内容

3.1 蛋白质结构分析

蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与

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功能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础。三维空间结构的测定是验证蛋白质设计的假设即证明是新结构改变了原有生物功能的必需手段。晶体学的技术在确定蛋白质结构方面有了很大发展，但是最明显的不足是需要分离出足够量的纯蛋白质（几毫克～几十毫克），制备出单晶体，然后再进行繁杂的数据收集、计算和分析。

另外，蛋白质的晶体状态与自然状态也不尽相同，在分析的时候要考虑到这个问题。核磁共振技术可以分析液态下的肽链结构，这种方法绕过了结晶、X－射线衍射成像分析等难点，直接分析自然状态下的蛋白质的结构。现代核磁共振技术已经从一维发展到三维，在计算机的辅助下，可以有效地分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理。从某种意义上讲，核磁共振可以更有效地分析蛋白质的突变。国外有许多研究机构正在致力于研究蛋白质与核酸、酶抑制剂与蛋白质的结合情况，以开发 具有高度专一性的药用蛋白质。

3.2 结构、功能的设计和预测

根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以预测一定氨基酸序列肽链空间结构和生物功能；反之也可以根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过基因重组等实验可以直接考察分析结构与功能之间的关系；也可以通过分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。虽然这方面的工作尚在起步阶段，但可预见将来能建立一套完整的理论来解释结构与功能之间的关系，用以设计、预测蛋白质的结构和功能。

蛋白质的改造，从简单的物理、化学法到复杂的基因重组等等有多种方法。物理、化学法：对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改变表面电荷

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分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等；生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等。以上方法只能对相同或相似的基团或化学键发生作用，缺乏特异性，不能针对特定的部位起作用。采用基因重组技术或人工合成DNA，不但可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质。

蛋白质是由不同氨基酸按一定顺序通过肽键连接而成的肽构成的。氨基酸序列就是蛋白质的一级结构，它决定着蛋白质的空间结构和生物功能。而氨基酸序列是由合成蛋白质的基因的DNA序列决定的，改变DNA序列就可以改变蛋白质的氨基酸序列，实现蛋白质的可调控生物合成。在确定基因序列或氨基酸序列与蛋白质功能之间关系之前，宜采用随机诱变，造成碱基对的缺失、插入或替代，这样就可以将研究目标限定在一定的区域内，从而大大减少基因分析的长度。一旦目标DNA明确以后，就可以运用定位突变等技术来进行研究。

4 蛋白质工程的实际应用

4.1 提高蛋白质的稳定性

葡萄糖异构酶（GI）在工业上应用广泛，为提高其热稳定性，朱国萍等人在确定第138位甘氨酸(Gly138)为目标氨基酸后，用双引物法对GI基因进行体外定点诱变，以脯氨酸（Pro138）替代Gly138，含突变体的重组质粒在大肠杆菌中表达，结果突变型GI比野生型的热半衰期长一倍；最适反应温度提高10～12℃；酶比活相同。据分析，Pro替代Gly138后，可能由于引入了一个吡咯环，该侧链刚好能够填充于Gly138附近的空洞，使蛋白质空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。

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4.2 蛋白质活性的改变

通常饭后30～60min，人血液中胰岛素的含量达到高峰，120～180min内恢复到基础水平。而目前临床上使用的胰岛素制剂注射后120min后才出现高峰且持续180～240min，与人生理状况不符。实验表明，胰岛素在高浓度（大于10－5mol/L）时以二聚体形式存在，低浓度时（小于10－9mol/L）时主要以单体形式存在。设计速效胰岛素原则就是避免胰岛素形成聚合体。类胰岛素生长因子－I(IGF－I)的结构和性质与胰岛素具有高度的同源性和三维结构的相似性，但IGF－I不形成二聚体。IGF－I的B结构域（与胰岛素B链相对应）中B28－B29氨基酸序列与胰岛素B链的B28－B29相比，发生颠倒。因此，将胰岛素B链改为B28Lys－B29Pro，获得单体速效胰岛素。该速效胰岛素已通过临床实验。

4.3 治癌酶的改造治癌酶的改造治癌酶的改造治癌酶的改造

癌症的基因治疗分二个方面：药物作用于癌细胞，特异性地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞免受化学药物的侵害，可以提高化学治疗的剂量。疱症病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶(TK)可以催化胸腺嘧啶和其他结构类似物如GANCICLOVIR和ACYCLOVIR无环鸟苷磷酸化。GANCICLOVIR和ACYCLOVIR缺少3｀端羟基，就可以终止DNA的合成，从而杀死癌细胞。HSV－TK催化GANCICLOVIR和ACYCLOVIR的能力可以通过基因突变来提高。从大量的随机突变中筛选出一种，在酶活性部位附近有6个氨基酸被替换，催化能力分别提高43和20倍。O6－烷基－鸟嘌呤是DNA经烷基化剂（包括化疗用亚硝基药物）处理以后形成的主要诱变剂和细胞毒素，所以这些亚硝基药物的使用剂量受到限制。O6－烷基－鸟嘌呤－DNA烷基转移酶O6－Alkylguanine－DNAalkyltransferase(AGT)能够将鸟嘌呤O6上的烷基去除掉，起到保护作用。通过反向病毒转染，人类AGT在鼠骨髓细胞中表达并起到保护作用。通过突变处理，得到一些正突变AGT基因且活性都比野生

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型的高，经检查发现一个突变基因中的第139位脯氨酸被丙氨酸替代。

4.4 嵌合抗体和人缘化抗体

免疫球蛋白呈Y型，由二条重链和二条轻链通过二硫键相互连接而构成。每条链可分为可变区（N端）和恒定区（C端），抗原的吸附位点在可变区，细胞毒素或其他功能因子的吸附位点在恒定区。每个可变区中有三个部分在氨基酸序列上是高度变化，在三维结构上是处在β折叠端头的松散结构（CDR），是抗原的结合位点，其余部分为CDR的支持结构。不同种属的CDR结构是保守的，这样就可以通过蛋白质工程对抗体进行改造。

5 蛋白质工程进展

当前，蛋白质工程是发展较好、较快的分子工程。这是因为在进行蛋白质分子设计后，已可应用高效的基因工程来进行蛋白的合成。最早的蛋白工程是福什特（Forsht）等在1982—1985年间对酪氨酰—t—RNA合成酶的分子改造工作。他根据XRD（X射线衍射）实测该酶与底物结合部位结构，用定位突变技术改变与底物结合的氨基酸残基，并用动力学方法测量所得变体酶的活性，深入探讨了酶与底物的作用机制。佩里（Perry）1984年通过将溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)，并进一步氧化生成 Cys(3)-Cys（97）二硫键，使酶热稳定性提高，显著改进了这种食品工业用酶的应用价值。1987年福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，而导致了活性中心His（64）质子pKa从7下降到6，使酶在pH＝6时的活力提高10倍。工业用酶最佳pH的改变预示可带来巨大经济效益。蛋白工程还可对酶的催化活性、底物专一性、抗氧化性、热变性、碱变性等加以改变。由此可以看出蛋白工程的威力及其光辉前景。上述各例是通过对关键氨基酸残基的置换与增删进行蛋白工程的一类方法。另一类是以某个典型的折叠进行“从头设计”的方法。1988年杜邦公司宣布，成功设计并合成了由四段反平行α—螺旋组成为73个氨

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基残基的成果。这显示，按人们预期要求，通过从头设计以折叠成新蛋白的目标已是可望又可及了。预测结构的模型法，在奠定分子生物学基础时起过重大作用。蛋白的一级结构，包含着关于高级结构的信息这一点已日益明确。结合模型法，通过分子工程来预测高级结构，已成为人们所瞩目的问题了。

6 蛋白质工程在农业领域的应用

蛋白质工程正在成为改造农业，大幅度提高粮食产量的新途径。如植物光合作用是利用白光能将二氧化碳转化成贮成能量淀粉，在植物叶片中普遍存在着一种重要的起催化作用的酶，它能固定住二氧化碳，这种酶叫核酮糖-１．５-二磷酸羧化酶。而这种酶具有双重性：它既能固定二氧化碳，又会使二氧化碳在光照条件下通过光呼吸作用损失一半，即光合效率只有５０％。现在。这种酶的三维结构已经搞清楚了。参与研究的工作人员认为，可以通过蛋白质工程改造这种酶，控制其不利于人需要的一面，从而大大提高其光合作用效率，增加粮食产量。

近年来，美国坎布里奇的雷普里根公司的科研人员立题，以蛋白质工程作为设计优良微生物农药的新思路，他们实施对微生物蛋白质结构进行修改，仅此一举，使微生物农药的杀虫率提高了１０倍。

7 蛋白质工程在农业领域的应用

许多蛋白质工程的目标是设法提高蛋白质的稳定性。在酶反应器中可延长酶的半衰期或增强其热稳定性，也可以延长治疗用蛋白质的贮存寿命或重要氨基酸抗氧化失活的能力。在这个领域已取得了一些重要研究成果。用蛋白质工程来改造特殊蛋白质为制造特效抗癌药物开辟了新途径。如人的β-干扰素和白细胞-２是两种抗癌作用的蛋白质。但在它们的分

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子结构中，有一个不成对的基因，是游离的，因而很不稳定，会使蛋白质失去活性。当通过蛋白质工程修饰这种不稳定的结构就可以提高这两种抗癌物质的生物活性。美国的Ｃｅｔｕｓ公司成功地修饰了这两种治疗癌瘤的蛋白质，大大提高了它们的稳定性，已用于临床试验并取得了良好的效果。具有抗癌作用的蛋白质工程产品免疫球蛋白质是一种高效治癌药物，它能成为征服癌症的“生物导弹”，即具有对准目标杀死特定癌细胞而不伤害正常细胞的特效。近年来，澳大利亚医学科学研究所的一个微生物研究课题组经过多年的研究后发现了激发基因开始或停止产生癌细胞的蛋白质。这种蛋白质在癌细胞生长过程中对癌基因起着开通或关闭的作用。这个发现，对于通过蛋白质工程研制鉴别与控制多种类型的血液癌、固体癌的蛋白质有很好的作用，并为诊断和治疗癌症提供了新的方法。目前，应用蛋白质工程研究开发抗癌及抗艾滋病等重大疑难病症等方面，均取得了重大进展。

另据实验，蛋白质工程还可以改变α１抗胰蛋白（ＡＴＴ）。运用此工程技术在ＡＴＴ的Ｍｅｔ３５８和Ｓｅｒ３５９之间切开后，可以与嗜中性白细胞弹性蛋白酶迅速结合而引发抑制作用。在病理学的氧化条件下可导致Ｍｅｔ３５８变成蛋氨酸硫氧化物使ＡＴＴ不可能与弹性蛋白酶的弹性位点相结合。通过位点直接诱变，Ｍｅｔ３５８被Ｖａｌ代替就成为抗氧化疗法的ＡＡＴ突变体。含ＡＡＴ突变体的血浆静脉替代疗法已经用于ＡＡＴ产物基因缺陷疾病患者的治疗，并已取得明显疗效。

总而言之，蛋白质工程作为生物工程领域的一向重要技术和发展方向，在21实际的社会发展中将会有更多的蛋白质工程的技术和产品应用到我们的日常活动中，为我们提供极大的便利，解决许多重大的难题，为社会进步和经济发展起到重大的推动作用。

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