siRNA说明书

使用前须知

为避免外界因素(包括酶，极端pH或者温度条件等)导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。 细胞实验方法

为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议： a.转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔；

b.接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。 1.转染浓度：

siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24~72h。最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。 2.转染步骤：

以lipofectamine?2000(简称lipo2000)转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。

1)转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50%(不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)。注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。 2)对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-lipo2000混合液：

a.稀释siRNA：用50μl不含血清培养基Opti-MEM?Ⅰ(v1)稀释1.25μl20μM的siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min；

b.稀释lipo2000：用50μl不含血清培养基Opti-MEM?Ⅰ(v1)稀释1μllipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min； c.将a与b轻轻混匀，室温孵育20min(溶液可能会有浑浊，但不会影响转染)。

注意：稀释好的lipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25min之内与稀释好的siRNA混合。另在混合试剂时，请勿剧烈吹打或振荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏脂质体的结构，甚至影响siRNA-lipo2000混合物的形成。

3)将siRNA-lipo2000混合液加入含有细胞的400μl培养基(v2)的培养孔中，轻轻混匀； 4)(可选)培养4~6h后，将孔中含siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基； 5)(可选)进行其他必要的特殊处理(如加药处理)；

12.5 25 50 100 250 1000 6)将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24~96h(培养时间与实验目的相关)。 表2?使用lipo2000(invitrogen)转染siRNA产品用量参考 v1：Opti-MEM?I(无血清、无抗生素，转染专用)；v2：完全或不完全培养基 96-well 100μl(25μl+25μl+50μl) 100μl(25μl+25μl+50μl) 100μl(25μl+25μl+50μl) 100μl(25μl+25μl+50μl) 100μl(25μl+25μl+50μl) 24-well * 500μl(50μl+50μl+400μl) 500μl(50μl+50μl+400μl) 500μl(50μl+50μl+400μl) 500μl(50μl+50μl+400μl) 500μl(50μl+50μl+400μl) 12-well 1mL(100μl+100μl+800μl) 1mL(100μl+100μl+800μl) 1mL(100μl+100μl+800μl) 1mL(100μl+100μl+800μl) 1mL(100μl+100μl+800μl) 6-well 2mL(250μl+250μl+1500μl) 2mL(250μl+250μl+1500μl) 2mL(250μl+250μl+1500μl) 2mL(250μl+250μl+1500μl) 2mL(250μl+250μl+1500μl) 100nM 50nM 30nM 20nM 10nM 100nM 50nM 30nM 20nM 10nM 100nM 50nM 30nM 20nM 10nM 100nM 50nM 30nM 20nM 10nM 0.5μl 0.25μl 0.15μl 0.1μl 0.05μl 2.5μl 1.25μl 0.75μl 0.5μl 0.25μl 5μl 2.5μl 1.5μl 1μl 0.5μl 10μl 5μl 3μl 2μl 1μl 0.25μl 0.25μl 0.25μl 0.25μl 0.25μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 2μl 2μl 2μl 2μl 2μl 5μl 5μl 5μl 5μl 5μl 10~100ng 10~100ng 10~100ng 10~100ng 10~100ng 100~200ng 100~200ng 100~200ng 100~200ng 100~200ng 200~400ng 200~400ng 200~400ng 200~400ng 200~400ng 500~1000ng 500~1000ng 500~1000ng 500~1000ng 500~1000ng *：实验参考用量示例;?：当实验涉及DNA共转时参考 3.效果检测：

转染完成后24~72小时均可进行siRNA沉默效果检测，最佳检测时间与细胞类型，转染试剂，检测目的等相关。

1)RNA水平的检测：mRNA是检测siRNA沉默效率的最佳指标，siRNA转染后24~72h即可检测到靶基因mRNA表达明显降低，检测方法宜采用qPCR检测方法。注：引物设计质量很重要；

2)蛋白水平的检测：蛋白是RNAi沉默效率的重要指标，其检测手段主要为Western-blot等。检测时间受细胞内蛋白质表达量、半衰期等因素的影响，一般为48~96h，甚至更长时间之后多点采样； 3)功能筛选：应用EdU细胞增殖、EdUTP细胞凋亡等检测方法进行siRNA对细胞功能的直接筛选。