siRNA说明书

使用前须知

为避免外界因素(包括酶，极端pH或者温度条件等)导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。 细胞实验方法

为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议： a.转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔；

b.接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。 1.转染浓度：

siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24~72h。最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。 2.转染步骤：

以lipofectamine2000(简称lipo2000)转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。

1)转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50%(不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)。注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。 2)对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-lipo2000混合液：

a.稀释siRNA：用50μl不含血清培养基Opti-MEMⅠ(v1)稀释μl20μM的siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min；

b.稀释lipo2000：用50μl不含血清培养基Opti-MEMⅠ(v1)稀释1μllipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min； c.将a与b轻轻混匀，室温孵育20min(溶液可能会有浑浊，但不会影响转染)。

注意：稀释好的lipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25min之内与稀释好的siRNA混合。另在混合试剂时，请勿剧烈吹打或振荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏脂质体的结构，甚至影响siRNA-lipo2000混合物的形成。

3)将siRNA-lipo2000混合液加入含有细胞的400μl培养基(v2)的培养孔中，轻轻混匀； 4)(可选)培养4~6h后，将孔中含siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基； 5)(可选)进行其他必要的特殊处理(如加药处理)；

25 50 100 250 1000 6)将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24~96h(培养时间与实验目的相关)。 表2使用lipo2000(invitrogen)转染siRNA产品用量参考 v1：Opti-MEMI(无血清、无抗生素，转染专用)；v2：完全或不完全培养基 96-well 100μl(25μl+25μl+50μl) 100μl(25μl+25μl+50μl) 100nM 50nM μl μl μl μl 10~100ng 10~100ng 24-well * 100μl(25μl+25μl+50μl) 30nM μl μl 10~100ng 100μl(25μl+25μl+50μl) 20nM μl μl 10~100ng 100μl(25μl+25μl+50μl) 500μl(50μl+50μl+400μl) 500μl(50μl+50μl+400μl) 500μl(50μl+50μl+400μl) 10nM 100nM 50nM 30nM μl μl μl μl μl 1μl 1μl 1μl 10~100ng 100~200ng 100~200ng 100~200ng 12-well 500μl(50μl+50μl+400μl) 20nM μl 1μl 100~200ng 500μl(50μl+50μl+400μl) 1mL(100μl+100μl+800μl) 1mL(100μl+100μl+800μl) 10nM 100nM 50nM μl 5μl μl 1μl 2μl 2μl 100~200ng 200~400ng 200~400ng 6-well 1mL(100μl+100μl+800μl) 30nM μl 2μl 200~400ng 1mL(100μl+100μl+800μl) 20nM 1μl 2μl 200~400ng 1mL(100μl+100μl+800μl) 2mL(250μl+250μl+1500μl) 2mL(250μl+250μl+1500μl) 10nM 100nM 50nM μl 10μl 5μl 2μl 5μl 5μl 200~400ng 500~1000ng 500~1000ng 2mL(250μl+250μl+1500μl) 30nM 3μl 5μl 500~1000ng 2mL(250μl+250μl+1500μl) 20nM 2μl 5μl 500~1000ng 2mL(250μl+250μl+1500μl) 10nM 1μl 5μl 500~1000ng *：实验参考用量示例;：当实验涉及DNA共转时参考

3.效果检测：

转染完成后24~72小时均可进行siRNA沉默效果检测，最佳检测时间与细胞类型，转染试剂，检测目的等相关。

1)RNA水平的检测：mRNA是检测siRNA沉默效率的最佳指标，siRNA转染后24~72h即可检测到靶基因mRNA表达明显降低，检测方法宜采用qPCR检测方法。注：引物设计质量很重要；

2)蛋白水平的检测：蛋白是RNAi沉默效率的重要指标，其检测手段主要为Western-blot等。检测时间受细胞内蛋白质表达量、半衰期等因素的影响，一般为48~96h，甚至更长时间之后多点采样； 3)功能筛选：应用EdU细胞增殖、EdUTP细胞凋亡等检测方法进行siRNA对细胞功能的直接筛选。