基于宏基因组技术分析自然发酵高粱菌群结构

研究中心，黑龙江大庆163319)摘 要：由于高粱自然发酵过程中微生物菌群结构较复杂，代谢途径较难确定，使高粱自然发酵工艺较难控制，难以

实现工厂化生产，通过高通量测序的宏基因学对高粱不同发酵时期的菌群结构、代谢通路的多样性进行分析，结果表 明：自然发酵过程中的优势菌种为胚芽乳杆菌、乳酸乳球菌、费比恩毕赤酵母、醋酸杆菌、固氮葡糖醋杆菌等，高粱自

然发酵的过程是酵母菌慢慢富集的过程，而乳酸菌的大量存在增加酵母菌的代谢潜能,在发酵后期醋杆菌属的大量

富集使酵母菌丰富度下降,说明毕赤酵母等酵母菌耐酸性较差。通过宏基因组序列的代谢重建,揭示蛋白质和碳水化

合物异养发酵的特征，通过碳水化合物代谢途径可知，有机酸的积累使整个发酵体系呈酸性，使优势菌醋杆菌属丰富

度增加，说明自然发酵过程中的优势菌为乳酸菌和酵母菌，其中乳酸菌起主导作用。关键词：高粱；自然发酵;宏基因组;微生物多样性;7谢通路The Analysis of the Structure of Natural Fermented Sorghum Microbial Flora Based on

Metagenomics TechnologyGE Yun-fei1, ZHAO Shu-ting1, LIU De-zhi1, WANG Wei-hao1，2, CAO Long-kui1，2，**

(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China;2. National Coarse Cereals Engineering Research Center, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing

163319, Heilongjiang, China)Abstract: Because of the complex structure of the microbial flora in the natural fermentation process of

sorghum, the metabolic pathways are more difficult to determine, making it difficult to control the natural

fermentation process of sorghum, and it is difficult to achieve industrial production. Through the high - throughput sequencing of metagenomics, the changes in the structure of the microbial flora and the diversity of

the metabolic pathways in different fermentation periods were analyzed. The results showed that the dominant基金项目：国家重点研发计划(2017YFD0401203)作者简介:葛云飞(1993—),女(汉)，硕士，研究方向侬产品加工。*通信作者:曹龙奎(1965—),男，教授，博士，研究方向:农产品加工,to titanium dioxide nanoparticle on brain development minus; brain region information [J]. The Journal of Toxicological Sciences, 2012,

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cause apoptosis in BEAS-2B cells through the caspase 8/t-Bid-in- dependent mitochondrial pathway[J]. Toxicology Letters, 2010, 196(1)：

and Toxicology, 2013, 64(4)： 545-55321-27收稿日期：2019-01-08[20] Zhang L Y, Liang Z, Yang K G, et al. Mesoporous Ti'2 aerogel for基础研究葛云飞，等：基于宏基因组技术分析自然发酵高粱菌群结构—-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------27-—strains in the natural fermentation process were Lactobacillus plantarum, Lactococcus (act's, Pichia pastor's, Acetobacter, and Nitrogen-fixing Glucoacetobacter xylinum etc. The process of natural fermentation of sorghum was the process of slowly enriching yeast, while the large amount of lactic acid bacteria increased the metabolic potential of yeast, and the enrichment of Acetobacter in the late stage of fermentation reduced the yeast rich­

ness. It indicated that yeasts such as Pichiapastor's had poor acid resistance. Through the metabolic reconstruc­tion of the metagenomic sequence, the characteristics of protein and carbohydrate heterotrophic fermentation

were revealed. Through the metabolic pathway of carbohydrates, the accumulation of organic acids made the whole fermentation system acidic, and the richness of dominant bacteria such as Acetobacter was increased. It

showed that the dominant bacteria were lactic acid bacteria and yeast, and lactic acid bacteria played a leading role in the natural fermentation process.Key words: sorghum; natural fermentation; metagenomics; microbial diversity; metabolic pathway引文格式：葛云飞，赵舒婷,刘德志，等.基于宏基因组技术分析自然发酵高粱菌群结构[J#.食品研究与开发,2019,40(24):26-32 GE Yunfei, ZHAO Shuting, LIU Dezhi, et al. The Analysis of the Structure of Natural Fermented Sorghum Microbial Flora

Based on Metagenomics Technology[J]. Food Research and Development, 2019,40( 24 ) ： 26-32高粱又名蜀黍，因其高产性、高抗逆性及其在发 酵、制糖、饲料行业中用途广泛而被大量种植,其种植 面积及产量仅次于小麦、玉米、水稻和大麦，成为世界

物的 性叫随着分子生物学的发展，发酵微生物落 在需 通 纯 养技术进行,大大减供契了试工作量并为不可培养微生物的

上第五大粮食作物［1］，是一种富含膳食纤维，蛋白质， 脂肪，叶酸，铁和其他微量元素的天然高营养功能性 食品。高粱具有凉血、解毒之功，常吃高粱 和高粱米

机。宏基因组学利用现代基因技术,涵盖生物信息 计分析和基因组学两方面的意义和技术冏,宏基因组

学 基因组技术为基础通 全面的 因组技术

环境中全部DNA系统, 积食 发酵料”［3］及“高粱

，用于 种 叫产品叫而在国 于揭示发酵 中微物的菌落交替、在西方国家通常将高粱进行发酵生产“高粱粥”、“高粱 相互作用关系及 功能％因本文利用宏基然发酵高粱 中的

高粱的 性 膳食纤维的含量高而代谢通路，为工厂化自发酵高粱产品调控 供理论基

通将其用于饲料行业中其 、

营养

制 发酵是 国

物 及础与数据支持。性质的方 因 通过将高粱进行 然发酵1材料与方法1.1材料与试剂高粱:山东临沂;DNA 取试剂盒:上海科兴责任 有限公司:Tris硼酸、琼脂糖凝胶、核酸染料、TE缓冲

仅 大高粱的 用 食用品质。 国 ［6#

能 高高粱的发酵高粱

酵高粱 的性质

， 发酵高粱的微 物性［及产生的有酸'中在发液和DNA Marker：青岛高科园海博生物技术有限公 司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒:AXYGEN公司；蒸

高粱。发酵 中微生物

小 物质作用于高粱 的 性质，高粱的营养

I水:国家杂粮技术 中心重

1.2

与制。上海森信实验仪高， 发酵高粱产品 其 。Dgg-9053A

有公司;MJ-10A

种，

于于 发酵 中的微 物 通 用

:上海 恒信息科技养，

养的微生物种类仅

左右，因通

有限公司;PTC-200型梯度扩增PCR仪、CDS-8000型

成像析系统:美国Bio-Rad公司；GS-FLX型高

品环境的1 %~10 %纯养能进一步析 发通量测序仪:美国Roche454公司；DYY-12型电泳仪：

酵 中的微生物群落 成 落演替 及各种微生一 厂；Qubit® 2.0 计:沃德生物 学仪葛云飞，等：基于宏基因组技术分析自然发酵高粱菌群结构基础研究28器公司;LS-3781L-PC型高压灭菌锅:日本松下健康医

疗器械株式会社。1.3试验方法1.3.1样品处理将高粱进行自然发酵0-15 d,取发酵前期（3 d）、 发酵中期（8d）、发酵后期（14 d）,装入无菌离心管中，

送去宏基因组高通量测序。1.3.2样品总DNA的提取根据DNA试剂盒说明书所示标准步骤，进行提 取,具体操作步骤如下：1） 称取发酵液样品1 g于2mL离心管中，加入0.8 mL SLX Mlus 缓冲溶液，

5 min。2） 加入80 “LDS缓冲液 。3）

70 °C裂解 10 min。4） 25 C室温下离心 5 min（13 000 r/min）。5 ）吸取离心后上清液600 !L于2mL无菌离心管

中，加入200 “LSP2缓冲液，

。6） 加入100 ^L HTR试剂， 10;后进行冰浴

5 min。7） 25 C 离心 5 min 13 000 r/min）。8） 吸取离心后上清液400 !L于2mL无菌离心管 中，加入 450 “L Binding 缓冲液和 40 “LMagsi Particles液，

，25 C下静置2 min。9） 将2 mL离心管放置在磁力架上吸附5 min，小心 上层清液，并10） 加入500 !L Binding缓冲液，振荡混匀，25 C

室温放置2 min。11） 将2 mL离心管放置在磁力架上吸附5 min，小

心吸弃上清液，12） 加入1 000 !L PHB缓冲液，振荡混匀磁珠，放置在磁 5 min，上清。13） 加入1 000 !L SPM Wash缓冲液，混匀磁珠， 放置在磁力架5 min,弃上清。14）

步骤（13）即加入1 000 !L SPM缓冲液，

混匀磁，放置 磁 5 min，弃上清。15） 将2mL离心管于55 C

中烘10 min,使残发16） 加入60 !L Elution缓冲液到离心管中，充分， 65 C 10 min17） 磁

5 min， 心 取上清 DNA 液体

新的1.5 mL离心管中。1.3.3样品DNA测序文库构建1.3.3.1样品基因组DNA将 发酵 期发酵液样品进行 DNA ,备插入片段长度为500 bp左右的文库，初始DNA总量

为800 ng,使用Elution缓冲液将DNA稀释到130 uL,

装入0.5 mL的DNA 管中，将DNA

，即最后打断的DNA片段大小集中在300 bp-500 bp范

磁 将 后的 DNA回收。1.3.3.2样品基因组DNA浓度测定Qubit ® 2.0

进行DNA浓度测定。1.3.3.3样品基因组DNA通过Illumina公司试剂盒进行 ，其具体操作步骤如下:1 ）将超端准备酶和末端修复反应缓冲液置于冰

上 92）

加入N ）端预酶混合物试剂3.0 !L、（绿缓冲试剂6.5 !L、

DNA试剂55.5 !L于

发酵 期样品 后DNA中。3

液器 ， 离心将 液离心 管4） 将上述聚合酶链式反应（polymerase chain reac­tion ,PCR）管置于PCR仪，热盖设置为！ 75 C,并运行

以下程序：20 C保持30 min、65 C保持30 min。5） 将DNA

, 增强剂和转接酶置于冰上解冻。6） 分别加入（红色）DNA连接酶试剂15 ”L、（红色）连接增强剂试剂1 “L、转

试剂2.5 “L。7

液器

，并短暂离心将 液离心 管8）将上述PCR管置于PCR仪，并运行以下程序：20 C保持 15 min。1.3.3.4

后的 产物进行PCR扩增富集1） 涡旋

磁2） 根据DNA片段长度要求,向100 !L DNA上清液中两次加入磁，涡旋 液器吹打10次混匀,25 C孵育5 min。3） 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄

清后（约5 min）,心 除上清，加入200 !L 鲜配制

的80 %乙醇漂洗磁 两次。4） 将PCR管从磁

中取出，加入适量21 ^L双蒸水，涡旋

，25 C静置5 min。5） 将PCR管

离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,将20 !L上清液转

干净无菌管中。6） 向无菌管中加入DNA

试剂20 ng、（蓝 热启动聚 链反应母液试剂20 !L、Index

Primer/i7 Primer（50 “mol/L）和 Universal PCR Primer/i5基础研究葛云飞，等：基于宏基因组技术分析自然发酵高粱菌群结构29Prime] 50 |xmol/L)试剂各 1 |xLo7＞用 ，并将

o

后将PCR 于PCR 进行8)所得PCR产物用2 g/100 mL的琼脂糖凝胶电o

134数据过不同软件对微生物多样性、基因组装及基因

功注释技术路线将品序得到的原始序列经过

数据质控 后，进行组装、注释公共数据库等 。2结果与分析10 0008 0006 0005 0004 0003 5003 0002 5002 0001 5001 2001 000900800700600500400300200100图中点样顺序从左至右依次为:发酵时间3 \"8 \"14 d，Markero2.1 品总DNA的提取品总DNA

结果如图

1所示。图1发酵样品总DNA的提取图1可知发酵样本主条带清晰，无明显拖尾且浓

Fig.l Extraction of total DNA from fermentation samples表l发酵样品总DNA的浓度Table l Total DNA concentration of fermentation sample度较，

解,污染,3个品对位的条带大正确，度合适，后续试验的准确

品不存

供了保障， 此 证 片段 用于Illumina发酵样品发酵前期(3 d)发酵中期(8d)总 DNA 浓度/(ng/^L)双末端测序。品的DNA浓度检测结果如表1所示。品总DNA的度达到了序标准，因此

7.6813.8后(14 d)9.08可以构建二代测序文库，以进行下一步验。2.2

品Illumina 序数据处理不同发酵时期所得序列数分别为4.7x107、7.9!107、4.5x107, 了保证信息

品的高通量序 结果如表2所示。质量，将测序得到的原表2高通量测序结果Table 2 High throughput sequencing results序列 长度伽间总序列数GC含量/%46.85拼接重叠 数目重叠 GC 含量/%预所得 重叠数目预 GC 含量/%香维纳 指数辛普森指数前 (3 d)发酵中期(8d)后 (14 d)4.7X1077.9X1074.5X1071501501503 56649.6844.9313 69253 29554 22250.4544.938.109.769.624x10^47.0163.8310 4649.4x10」1.3x10^14 71053.2354.35始数据进行过滤,得到清晰数据，将所得优质reads利 森(Simposon)指数被用来表征微生物基因多样性。香

农维纳指数物种种数目， 度 种

用拼接软件IDBA_UD进行拼接组装，根据序列间的

重叠关系,获得一定数目的重叠数,并对多个组装结 果进行了综合评定，选择最佳组装结果,10/。对拼接的拼

接重叠数序列进行开放阅读框(open reading frame, ORF)预测，选择长度大于等于100 bp的基因，并将其

个 的 ， 种 数目多，其 的多o ，种 间个 的多 的 。果一个个都于 的

种,多 指数 最大 果 个个 都 于 一种, 多 个个

翻译成蛋白序列以便后续物种注释及京都基因百科全 指数 最 o 普 指数

， 种

的多， 种个o 书与基因组(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，

KEGG)功注释进行

o

于 种的

，指数 ， 多

其香维纳指数

2基因 间 基因个数及 度后 差异的现象,香农维纳(Shannon-Wiener)指数与 普的， 普指数 后，葛云飞，等：基于宏基因组技术分析自然发酵高粱菌群结构30酵时间的延长,发酵液中的微生物群落中种属类别呈

基础研究­

技术信息中心（National Center of Biotechnology Infor先增加后降低的趋势，在发酵中期微生物种属较多、

菌属的丰富度较大即发酵样本多样性较高。2.3发酵样品菌群结构及菌种比例分析mation ，NCBI）的微生物分类学信息数据库，获得基因

的物种分类注释信息，其中高粱在不同发酵时期的

微生物菌群在物种分类学水

的对丰度 2将基因集蛋白序列与数据库进行同源性比对，得

到功能注释和同源物种信息。同时根据美国国家生物°在高粱自然发酵前期过程中，丰富度大于1 %的菌细菌菌落种群分布40 35 30 25 02 51 0150&*、亲

W50「45 - C80 -A.高粱自然发酵前期（3d）；B.高粱自然发酵中期（8d）；C.高粱自然发酵后期（14d）图2自然发酵过程中菌群结构变化Fig.2 Changes in bacterial structure during natural fermentation群结构如下:乳酸乳球菌的丰富度较高，达到26.54 %、 酸菌的主要菌种,其中植物乳杆菌的丰富度较发酵前

期高 7.26%, 菌属丰富度 发酵后期即

2.65%、在乳菌属 1.59 %、

22.68 %、其 菌属含量发酵时间的延菌株丰富度为5.27 %, 发酵14 d时 菌属丰富度长当发酵时间8d即发酵中期时酵 菌的丰富度高 达36.47 %、植物乳杆菌及戊糖片球菌为发酵中期乳咼，其中 Gluconacetobacter diazotrophicus （固氮葡糖醋菌）菌种含量为45.54 %，醋杆菌属的丰富度 发酵基础研究葛云飞，等：基于宏基因组技术分析自然发酵高粱菌群结构31 -----程中的优势菌种为胚芽乳杆菌（Lactobacillus plan­tarum 0乳酸乳球菌（Lactococcus lactis ）、费比恩毕赤酵

时间的延长而增加至11.38 %，此时发酵液产生较大

的刺激性酸味、酸度

酵过程中 酸 酵 Michael G 问通过将酵生产酸

母（Cyberlinderafabianii0醋酸杆菌（Acetobacter malo-

rum）、固氮葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter diazotrophi-

其中酵物 cus0 酵的 程中酵酵后期

菌,棒状乳杆菌等,而Sedjro Emile Tokpohozin等问通

基质辅激解 子 质 的 质分

Xu 913：通

的程 酵程之中酸的大量了酵 的代谢能网 量 酵

度下降

的大中的 基因分

酵

中物 ■酵 酵菌,瑞士乳杆菌,副干酪乳杆菌和短乳杆菌等,Jialiang 耐酸性较差。2.4

酵样品群 代谢通路分成分分析结果如胞菌属酵样品中 代谢通路

通过 酵 其 酵过表3所示。表3发酵样品中主要代谢通路及主成分分析Table 3 Main metabolic pathways in fermentation samples样品代谢通路基因数目（条）发酵前期（3 d）发酵中期（8 d）代谢通路信息细胞生长和死亡代谢通路发酵后期（14 d）细胞过程细胞过程细胞过程2078153586027959206细胞运动细胞群落膜运输8232 6011 6207552 2721 463环境信息处理环境信息处理遗传信息处理遗传信息处理遗传信息处理人类疾病人类疾病人类疾病新陈代谢新陈代谢新陈代谢新陈代谢新陈代谢新陈代谢新陈代谢新陈代谢新陈代谢新陈代谢新陈代谢新陈代谢635信号转导折叠分类和降解261175527785959765821复制和修复翻译268333661 353

致癌性耐药性传染性疾病氨基酸代谢2416264482775815352 1403762 9961 406149642 428383510其他次生代谢物的生物合成106961384135碳水化合物代谢能量代谢3 1171 584聚糖的生物合成和代谢脂质代谢5287781 618

5389021 480256364200138431643辅因子和维生素的代谢其他氨基酸的代谢砧类和聚酮化合物的代谢酸代谢概观7627074881 3975251 3142 5805642 357生素生物降解新陈代谢473137使用GhostKOALA〔1p将基因集蛋白序列与KEGG

数据库

对到序列对应的基因数据库（KEGGorthology, K0）基因号，根据KO与通路和模块的联系

等，并统计KEGG各功能层级在各个样本中的丰富 度。其

：酵的程中,微生物菌群的代谢结

构 生变化，随着发酵 的 长，氨基酸代谢、碳水

得到序列的通路,模块注释信息,包括代谢通路、合成

通路、膜转运、信号传递、细胞周期以疾病相关通路化合物代谢 基因数目较大，而发酵后期基因数目有葛云飞，等：基于宏基因组技术分析自然发酵高粱菌群结构基础研究32一定程度的降低，通过宏基因组序列的代谢重建，揭

示了蛋白质和碳水化合物异养发酵的特征，与检测到

乙醇和pH值下降相符即发酵随着发酵时间的延长醋

酸菌属的丰富度增加，使整个发酵体系的酸度增加pH 值下降，使微生物生长的抑制效应逐渐增强，其中乳

酸菌和醋酸菌自身具有一定的醋酸耐受力，逐渐成为

丰度较高的主体微生物，而通过代谢途径 ，碳水化合物代谢主途径为 酸

酸代谢酸 和酵解途径两，其中间代谢产物

生大量的柠檬酸、乙酸、丁酸等有机酸亦使 液的pH值逐 渐降低 因 ， 加 化， 化 ，高组成之外,发酵生的代谢产物(有机酸，醇)和pH 值 因 定了发酵 微生物菌3结论通过 宏基因组

高 自 发酵过程中菌 化 菌 的代谢途径和特定的基因 ， 发 发酵过程中 菌 为

乳杆菌(Lactobacillus plantarum\\ 乳酸乳球菌(Lacto­

coccus (act's)、费比恩毕赤酵母(Cyb erlinde rafab ianii)、

醋酸杆菌(Acetobacter malorum 醋杆菌{Gluconacetobacter diazotrophicus)等，其中酵母菌的丰

富度随着发酵时间的延长而增加，而发酵 醋菌

属的大量富集使整个发酵体系酸性， 发酵过程中的 菌为耐酸性菌，其中发酵体系中醋酸菌

的丰度较高， 其具有较强的 化 力， 较乙醇 化为醋酸呵，使发酵液pH值降低。通过功，高 自 发酵过程中主

微生物代谢通 合成通相通 ，其中间代谢

产物有机酸为微生物的 生长 了有通过高通量测序的宏基因 高 发酵过

程中的微生物菌

化， 一 发酵高 中微生物的 相互作用，同 定各种微生物的丰度,通过了 高粱自 发酵过程中的代谢机

理,并挖掘出新的 基因，对高自发酵的工厂

化生 品质调控提供理论基础与数据支持。参考文献：[1] 王红育，李颖.高粱营养价值及资源的开发利用[J].食品研究与

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