齐 齐 哈 尔 大 学
题 目学 院专业班级学生姓名指导教师成 绩
毕业论文
生命科学与工程学院
食工
2009 年 6 月 20 日
I
齐齐哈尔大学毕业设计(论文)
摘 要
鸡蛋是比较理想的全价蛋白质，其结构与人体蛋白质组成结构相似，生物学价值高,但由于一些行业的特殊需求，蛋黄的需求量较大,在生产过程中，蛋清没有得到很好地利用，既造成了蛋清资源的极大浪费,又造成了环境的污染。酶法水解蛋清蛋白质制备活性肽能有效地利用我国丰富的蛋清资源，将产生巨大的经济和社会效益。
本论文以鸡蛋清为原料,研究了酶法水解鸡蛋白蛋白的工艺条件。通过筛酶实验，以水解度、抗氧化性为指标，筛选出酶解蛋清蛋白的最佳酶是复合蛋白酶（动物酶庞博公司)，通过单因素实验和正交实验得出复合蛋白酶（动物酶）酶解蛋清的最佳条件是：pH=8。5、温度=50℃、［s］=3%、[E]/［S］=4/100、T=5h。 关键词:鸡蛋白蛋白;蛋白酶；水解；多肽;水解度;抗氧化性
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Abstract
Eggs is the full price of a good protein。 Its structure and composition is similar to human proteins and the biological value is high。 but because of eating habits and some of the special needs of some industries， the demand for large egg yolk， the egg white has been discarded as waste in the production process ， causing a great waste of the egg white resources and caused environmental pollution。 Preparation of enzymatic hydrolysis of egg white protein peptides are effective in the using of egg white rich resources in China which will have a huge economic and social benefits．
In this paper， egg for raw materials to study the enzymatic hydrolysis of egg albumin conditions。 Enzyme experiments through sieve to yield peptide hydrolysis， the antioxidant enzyme selected as an index of the best egg white protease enzyme is a compound (animal enzymes）， by single factor experiments and orthogonal test compound derived protease (animal enzyme ） the best conditions for hydrolysis of egg white are：pH = 8.5, temperature = 50 ℃, [s］ = 3％, ［E］ / [S] = 4 / 100， T = 5h．
Key words: egg albumin； protease; hydrolysis； peptide； degree of hydrolysis; antioxidant
II
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目 录
摘 要 ....................................................................................................................................... I Abstract .................................................................................................................................... II 第一章 绪 论 ........................................................................................................................ 1
1。1 鸡蛋清蛋白概况 .................................................................................................... 1
1。1.1 鸡蛋 ............................................................................................................... 1 1。1.2 蛋白质种类与含量 ....................................................................................... 1 1。1。3 蛋白质营养价值 ........................................................................................ 3 1.2 蛋清的研究现状 ....................................................................................................... 3
1。2。1传统的理化加工法与蛋清产品[5］ ............................................................. 3 1。2。2微生物发酵与蛋清产品 ............................................................................. 4 1.2.3蛋清的冷杀菌技术 ........................................................................................... 4 1。2。4 蛋清酶水解物 ............................................................................................ 4 1.3 本课题的研究目的及意义 ....................................................................................... 4 1.4 本课题的主要研究内容 ........................................................................................... 5 第二章 实验材料与方法 ........................................................................................................ 6
2.1 主要实验材料 ........................................................................................................... 6
2。1。1 实验材料与试剂 ........................................................................................ 6 2。1.2 实验仪器与设备 ........................................................................................... 6 2.1。3 主要试剂的配制 ........................................................................................... 7 2.2 检测方法 ................................................................................................................... 9
2。2。1 蛋白酶活力测定法—福林法［11] ............................................................ 9 2.2。2 蛋白质含量测定法—福林—酚法[12] ........................................................ 10 2。2.3 水解度测定法—茚三酮比色法[13] ............................................................ 11 2。2.4 抗氧化性的测定方法-邻苯三酚自氧化法[14] ........................................... 12 2。3 实验方法 .............................................................................................................. 12
2.3。1 工艺流程 ..................................................................................................... 12 2.3。2蛋清蛋白水解酶的筛选 .............................................................................. 13 2。3。3 单因素实验 .............................................................................................. 14 2。3.4 确定蛋清蛋白酶解的最佳工艺条件 ......................................................... 15
第三章 实验结果与讨论 ...................................................................................................... 17
III
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3。1 七种酶活力测定实验 .......................................................................................... 17
3。1.1 标准曲线的绘制 ......................................................................................... 17 3.1。2 酶活力测定结果 ......................................................................................... 17 3。2 蛋清蛋白水解酶的筛选 ...................................................................................... 18
3.2。2 以原蛋清液为原料的蛋白水解酶的筛选 ................................................. 18 3。2。3 以碱处理蛋清液为原料的蛋白水解酶的筛选 ...................................... 20 3。3 复合蛋白酶（庞博公司）水解蛋清蛋白工艺条件的研究 .............................. 24 3.4 正交实验确定复合蛋白酶（庞博公司)水解蛋清蛋白的最佳工艺条件 ............ 32 第四章 结 论 ...................................................................................................................... 35 参考文献 .................................................................................................................................. 36 致 谢 ...................................................................................................................................... 37
IV
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第一章 绪 论
1。1 鸡蛋清蛋白概况 1.1。1 鸡蛋
鸡蛋的构成中，蛋壳(包括壳膜）约占9。5％，蛋白约占63％、蛋黄约占27。5％.鸡蛋的主要成分为水(75％）、蛋白质(12%）、脂质（12％）以及碳水化合物和矿物质.鸡蛋三个组成部分的主要化学组成见表1-1［1］.
鸡蛋是人类丰富而平衡的膳食营养来源，它富含蛋白质、脂肪酸、铁、磷、维生B1，B2，B6,B12，D,E，K和微量矿物质［1］。鸡蛋对人体有重要的营养和防治疾病作用。鸡蛋中的蛋白质对肝脏组织损伤有修复作用,可促进肝细胞的再生,食用鸡蛋保护肝脏的功能；鸡蛋中的ω—3脂肪酸被认为能预防心率失常，增强免疫力，增进人类大脑功能和视觉灵敏所必需的一种营养物；胆碱在促进大脑发育，维持正能和预防癌症方面有重要作用，卵磷脂的吸收可增加血浆和大脑的胆碱含量;维生素B2起到维持人体正常糖代谢、脂肪代谢的作用分解和氧化人体内的致癌物质，降低脑卒中、急性心肌梗死和猝死等心脑血管病发生率［2］；鸡蛋中的微量元素，如硒、锌等也都具有防癌作用。目前研究者已从蛋黄中已经提取了卵磷脂、甘油三酯、脑甘脂、胆固醇和卵黄素等生物活性提高了鸡蛋的利用价值，但蛋清的受重视程度还远远不够,甚至被作为废料弃掉费了宝贵的蛋白质资源，又污染了环境,因此有必要对蛋清进行开发研究。
表1—1鸡蛋的化学组成
部分 蛋壳 蛋清 蛋黄
蛋白质 3。3 10.6 16.6
脂类 — 0.03 32。6
碳水化合 — 0。9 1.0
矿物质 95。1 0.6 1.1
1。1。2 蛋白质种类与含量
蛋清中的蛋白质含量约为9.7％～10。6%,其蛋白质总含量占了鸡蛋蛋白总量的90%以上。蛋清中含有20多种蛋白质，且绝大多数为糖蛋白,少数为磷糖蛋白。蛋清中一些主要蛋白质的含量及理化特性等见表1—2。
卵清蛋白是蛋清中主要的蛋白质之一，占蛋清蛋白质的54％,由于它含碳水化合物,归类为磷糖蛋白，是蛋清中唯一含游离巯基的蛋白质，每个卵清蛋白分子含有4个巯基，并有一个双硫基团，是蛋清凝固和胶凝性质的主要因子。
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表1—2鸡蛋清中一些主要蛋白质的含量和理化特性
［3］
蛋白质名称 相对含量（％） PIa 相对分子质量 T(℃） 生物学特性 卵清蛋白 54 4。5 45,000 84.0 含磷糖蛋白 卵转铁球蛋白 12 6.1 76,000 61.0 结合金属离子 类卵粘蛋白 11 4。1 28，000 79.0 抑制胰蛋白酶 卵粘蛋白 3。5 4.5~5.0 5.5～8.3×106 — Sialoprotein，粘性 溶菌酶 3。4 10.7 14，300 75。0 溶解某些种类细菌
球蛋白G2 4.0 5.5 3.0～4。5×104 92.5 — 球蛋白G3 4。0 4.8 - - — 卵抑制物 1.5 5。1 49,000 - 抑制丝氨酸蛋白酶 卵糖蛋白 1。0 3。9 24，400 — — 卵黄素蛋白 0。8 4.0 32,000 — 结合核黄素 卵巨球蛋白 0。5 4。5 7。6~9。0×105 — 具有强烈抗原性
抗生物素蛋白 0.05 10 68,300 85。0 结合生物素（维生素H） a等电点；T水或缓冲液中的变性温度
卵转铁球蛋白占整个蛋清蛋白质的13%，为糖蛋白，不含磷或巯基。卵转铁球蛋白二价或者三价金属离子紧密地结合,质子磁共振研究表明卵转铁球蛋白上的酪氨组氨酸和精氨酸残基参与了金属、阴离子的结合.在pH 6以上时，每摩尔蛋白分别与两个Fe3+、Al3+、Cu2+、Zn2+形成稳定的复合物.卵转铁球蛋白与金属离子复合物后对热变性和水解具有耐受性[4］，卵转铁球蛋白在铁传递方面有重要作用，抗菌活性。
蛋清中溶菌酶（E.C。3.2。1。17）的含量在2～4％。溶菌酶的化学性质稳定，在广泛pH内(1.2～11。3）酶结构不受影响，在pH 4~7范围内100℃处理1 min仍有近100％的活力，在碱性环境条件下稳定性稍差.溶菌酶常被作为研究模型来了解蛋白质的结构、动力学和分子折叠性质。
类卵粘蛋白有9个双硫键，三个寡糖单位组成的碳水化合物组分通过天冬酰胺残基与蛋白质连接,因此热稳定性好。类卵粘蛋白抑制牛胰蛋白酶，它的二级结构组成是26％的α—螺旋，46%的β—折叠和10％的β-转角,呈现高度有序性。
卵抑制物与类卵粘蛋白相似，它抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和微生物来源的一些蛋白酶。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂对硫醇蛋白酶（如无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶）、半胱氨酸蛋白酶（包括组织蛋白酶B、C、H和L，木瓜凝乳蛋白酶，番木瓜蛋白酶Ⅲ)都具有抑制作用.半胱氨酸蛋白酶抑制剂与它抑制的蛋白酶形成稳固的复合体，离解常数在
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10—8～10—12mol/L之间.半胱氨酸蛋白酶抑制剂非常稳定,可以在pH 12和65℃加热的条件下进行提取.圆二色性分析显示二级结构中有20%的α—螺旋结构,其他是β—折叠和β-转角结构.抗生物素蛋白是一种糖蛋白,由4个相同的多肽亚基组成,能与生物素形成稳定的不被肠道吸收的复合体.抗生物素蛋白的每个亚基结合一个生物素，离解常数为10-15mol/L，抗生物素蛋白与生物素结合的极高的特异性、亲和性是高灵敏性免疫测定和组织化学定位技术的基础。卵巨球蛋白为糖蛋白,具有强抗原性，是蛋清蛋白质中在免疫学上唯一具有广谱交叉反应的成分。卵粘蛋白为一种硫化糖蛋白，它是引起蛋清粘性的成分.卵糖蛋白是一种酸性糖蛋白，卵黄素蛋白能紧密结合核黄素，对它们的功能与生物学性质还了解不多。
1.1。3 蛋白质营养价值
蛋白质是动物（人）生存所必须的日粮组分，其在营养中的最基本功能是为机体供充足的必需氨基酸（Essneati!amni.acids,EAA),而蛋白质的品质(营养价值)依赖蛋白质分子中所含的氨基酸种类和含量以及消化、吸收后特殊氨基酸的生理利用。研究究发现,鸡蛋清蛋白含有动物（人）所需的各种EAA,且含硫氨基酸所占比例较，是所有动植物蛋白质中氨基酸最平衡、营养价值最高的一种蛋白源,并常用作评价其它食物蛋白营养价值的参比蛋白。鸡蛋清蛋白的消化率（人)在98％以上,生物学价值(Biorogiealvarue,By）、蛋白质效率比(Porteinemeseney:atio，PER）、净蛋白比（Netprotei。.atio，NPR)和蛋白质消化率矫正氨基酸分数（Proteindi罗stibili妙correctedmainoacidSeore，PoeAAs)分别为93.7％、3。7、5。1和1。01'711,21，均为所有动植物蛋白之最，其中鸡蛋清蛋白的BV(93。7％）远高于牛乳(54。5%）、鱼(76%）、牛肉（74。3％）和猪肉（74%).
1。2 蛋清的研究现状
如何采用一些合理的方法对鸡蛋进行加工后再利用是目前蛋品研究者和生产者普遍
关心的问题.Stdaelmnna(1999）指出，在合理价格条件下深加工并消费蛋是目前蛋消耗量逐年增加的一个重要原因。随着加工技术和生产工艺的改进与创新，加工蛋品在总蛋消费中所占比例逐年增加,加工深度与技术含量也不断提高。到目前为止，主要有3种蛋清深加工方法,即传统的理化加工法、微生物发酵法以及蛋白酶体外酶解法.
1.2.1传统的理化加工法与蛋清产品［5］
采用一些较传统的物理、化学方法或两者相结合加工鸡蛋清，可制得大量的蛋清产品.主要包括:①加热干燥生产蛋白片或蛋清粉，用于食品和化工生产；②通风或鞭打生产含空气的轻质蛋清产品,如蛋白与糖的混合物(meringues）;③采用一些方法（如乙醇
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沉淀)生产含低卵类粘蛋白但仍保持蛋清功能特性（如鞭打性（whippbaliiyt）、起泡性等）的蛋清产品，用作卵类粘蛋白过敏人群的食品；④与其它一些物质反应生产食用胶，用于医药与食品生产;⑤直接从蛋清中提取一些生物活性蛋白如卵白蛋白、溶菌酶、卵转铁蛋白等并用于营养、生物化学、分子生物学、医药和食等研究。
1.2.2微生物发酵与蛋清产品
选用一些适宜的微生物对鸡蛋清进行发酵，不仅可生产蛋清饮料，还可生产具有
免疫调节作用的活化卵白蛋白.蒲万霞等人研究发现，小鼠口服经酵母发酵鸡蛋清制得的活化卵白蛋可促进其生长,提高小鼠抗感染能力和小鼠巨噬细胞的吞噬功能，显著缓解（冷、热)应激所致的小鼠淋巴器官（胸腺和脾脏)萎缩回,提高嗜中性粒细胞的吞噬和杀菌活性,增强红细胞免疫功能,以及促进脾淋巴细胞增殖.
1.2。3蛋清的冷杀菌技术
在收购、运输、储藏鸡蛋和分离蛋清的操作过程中，容易使液体蛋清污染沙门氏菌、大肠杆菌等有害细菌,引起食源性疾病的发生。因此必须在连续监控下生产液体蛋清，并在上市前杀菌。目前最常用的杀菌方法是巴氏杀菌，即加热一定时间使细菌失活.但是即使轻微的热处理也会引起蛋清起泡、乳化、胶凝功能性质的损失和改变,进而降低产品的质量。冷杀菌技术是一种新技术,既能杀灭食品中微生物，又能最大限度保持食品色泽、香味、营养成分及功能性质.冷杀菌技术包括超高压杀菌、高压脉冲电场杀菌、脉冲强光杀菌、臭氧杀菌、膜分离杀菌、紫外线杀菌等。
1。2.4 蛋清酶水解物
蛋清蛋白经过蛋白酶水解后，分子量降低,原来蛋白质的功能性质得到改善，蛋白质的致敏性降低,更易于消化，并且水解物还具有抗高血压、抗胆固醇等生物活性，这些优点使得蛋清水解物研究得到人们的重视。金嫘［5]、宿哲然［6]、孟祥晨[7］研究了蛋清酶解的工艺条件，张英君研究了酶解产物的功能性质［8］，刘静波等研究了高F值寡肽酶解产物的制备方法[9］.Lee等用木瓜蛋白酶水解蛋清，得到的蛋清水解物的起泡能力和蛋糕体积指数都得到提高［10］。
1。3 本课题的研究目的及意义
目前我国的禽蛋加工状况是蛋品加工水平低、技术陈旧，有些产品不进行加工而直接上市销售，在一定程度上降低了产品的销售等级,产品的附加值低。
鸡蛋清经适宜的蛋白酶酶解后,不仅可在一定程度上改善其功能特性（如溶解性、鞭打性、稳定性等),还可降低过敏原性蛋白的抗原性，进一步提高鸡蛋清的食用品质和
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营养价值.
过去数十年的大量研究表明，鸡蛋中的蛋白质和多肽在满足基本的营养需求以外还发挥着多种不同的生物学功能。现已认为鸡蛋的蛋白质具有一些生物学活性,包括新颖的抗菌活性、免疫调节活性、抗癌活性以及抗高血压活性.这些都体现出鸡蛋的蛋白质在人类健康以及疾病的预防和治疗中的重要作用。继续研究鸡蛋中蛋白质及其衍生的、新的以及已经判明的生物学功能，有助于开发出新的方法从而进一步提高鸡蛋的利用价值,使其成为有益人类和动物健康的、具有广泛生物活性物的来源，并探索其在治疗及预防慢性传染病中的重要作用。将蛋清进行酶解获得具有生物活性的寡肽，具有十分重要的价值。
本实验以鸡蛋蛋清为原料，研究了酶解鸡蛋清的适宜条件以制备蛋清抗氧化活性肽。
1。4 本课题的主要研究内容
本文的主要研究内容有：
1.测定各种酶的活力。用国际标准酶活力测定法测定了中性蛋白酶、碱性蛋白酶等七种酶的活力.
2。 筛选适合水解蛋清蛋白的蛋白酶。通过探讨影响蛋清蛋白水解物多肽得率、水解度、抗氧化性的因素,筛选出酶解蛋清蛋白的适宜蛋白酶。
3。 确定蛋清蛋白水解物的制备工艺条件.设计单因素实验和正交实验,研究水解物多肽得率、水解度、抗氧化性,确定酶解鸡蛋清的最佳工艺条件.
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第二章 实验材料与方法
2.1 主要实验材料
2.1。1 实验材料与试剂
新鲜鸡蛋 碱性蛋白酶（novozymes) 中性蛋白酶(novozymes） 风味蛋白酶(novozymes) 复合蛋白酶（novozymes) 复合蛋白酶(动物酶） 复合蛋白酶(FH-N—GA) 碱性蛋白酶（十万单位） 分析纯三氯乙酸 分析纯酒石酸钾纳 分析纯无水硫酸铜 分析纯无水碳酸钠 分析纯氢氧化纳 分析纯无水乙醇 茚三酮 分析纯浓盐酸 三羟甲基氨基甲烷 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 EDTA 2。1.2 实验仪器与设备
UV757CRT紫外可见分光光度计722可见分光光度计 电热恒温水浴锅 指针式电热恒温水浴锅 电子天平 购自齐齐哈尔市大润发超市 丹麦诺唯信公司 丹麦诺唯信公司 丹麦诺唯信公司 丹麦诺唯信公司
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2。1。3 主要试剂的配制
1。磷酸缓冲溶液（pH7.5）
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O） 3。01g，磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O) 0。25g混合,加水溶解并定容至500ml.
2。三氯乙酸0.4mol/L
称取三氯乙酸65.4g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。 3.碳酸钠溶液0。4mol/L
称取无水碳酸钠粉末42。4g,用蒸馏水溶解并定容至1000ml. 4。氢氧化钠溶液0.5mol/L
称取固体氢氧化钠2g，用蒸馏水溶解并定容至100ml。 5。酪素溶液
称取酪素2。000g,精确至0.002g,用少量0。1 mol/L10mlNaOH溶液润湿后（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴）,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后，加入适量的pH7。2缓冲液定容至100ml，此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天。
6.L-酪氨酸标准溶液100μg/ml
a。称取于105℃干燥至恒重的L—酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60ml溶解后定容至100ml,即为1mg/ml酪氨酸标准溶液.
b。吸取1mg/ml的酪氨酸标准溶液10.00ml,用0。1mol/L盐酸定容至100ml,即得到100μg/ml L-酪氨酸标准溶液。
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7。福林试剂的制备
于2000ml磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2WO4•2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)25g、 水700ml、85％磷酸50ml、浓盐酸100ml,小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50ml和数滴浓溴水（99％),在微沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有绿色需再加溴水,再煮沸出去过量的溴），冷却，加水定容至1000ml。混匀,过滤。制得的试剂应呈金黄色,贮存于棕色瓶内。
使用溶液:一份福林试剂与一份水混合，摇匀。 8。福林—酚甲液
a．称取1.000g无水碳酸钠粉末，溶于50ml0。1 mol/LNaOH溶液配制成B液。此溶液需现用现配.
b．称取1.000g硫酸铜，用蒸馏水定容至100ml,即得到1％的硫酸铜溶液。 c．称取2。000g酒石酸钾纳，用蒸馏水定容至100ml，即得到2%的酒石酸钾纳溶液.
等体积混合1%的硫酸铜溶液和2％的酒石酸钾纳溶液,移取1ml于B液中，即得到福林—酚甲液. 9.茚三酮显色剂
称取茚三酮0.5g，果糖0。3g、Na2HPO4·10H2O10g及KH2PO46g，用蒸馏水定容至100ml。 10。乙醇溶液
量取40ml无水乙醇，加入60ml蒸馏水混合,即得到40％乙醇溶液. 11。盐酸溶液
（在通风橱中操作）量取4。5ml原装弄Hcl,倒入装有半瓶水的500ml试剂瓶中,加蒸馏水稀释定容至500ml，充分摇匀。 12。 Tris—Hcl缓冲液(PH=8。2)
量取50ml0。1mol/l三甲基氨甲烷溶液，加入22。9ml0.1mol/l盐酸，用蒸馏水定容至100ml。
13。三甲基氨甲烷溶液
称取0。6057g三甲基氨甲烷溶液,用蒸馏水定容至50ml. 14。邻苯三酚溶液
称取0.0378g焦性没食子,用10mmol/lHCL定容至100ml. 15.亚油酸储备液
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量取15ul亚油酸溶于50ml0。2mol/l磷酸盐缓冲液中，10000r/min均质10min,使溶液呈乳白色，0℃保存，24小时内使用。 16。FeCl2—EDTA溶液
称取lFecl29。95g，EDTA18.6g用蒸馏水定容至1000ml。 17。乙醇（含0。3mol/LHCL) 溶液
量取75ml无水乙醇，加入0。3mol/LHcl25ml，即得到75%乙醇溶液(含0。3mol/LHCL）. 18。 FeCl2溶液
称取lFecl29。95g用蒸馏水定容至500ml。 19。硫氰酸钾溶液
称取40g硫氰酸钾, 用蒸馏水定容至100ml，即得到40%硫氰酸钾溶液。
2。2 检测方法
2。2。1 蛋白酶活力测定法—福林法［11］
(1)原理
蛋白酶在一定的温度与pH条件下,水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计测定,计算酶活力。 (2）测定步骤 ①标准曲线的绘制
按表2—1配制不同浓度的酪氨酸溶液
表2-1 a.L—酪氨酸标准溶液
管号
酪氨酸标准溶液的
浓度/μg/ml
０ １ ２ ３ ４ ５
0 10 20 30 40 50
取100μg/ml酪氨酸标准溶液的体积
/ml
0 2 4 6 8 10
10 8 6 4 2 0 取水的体积/ml
b.分别取上述溶液各1。00ml(须做平行样，2~3个），各加0.4mol/L碳酸钠溶液5。00ml,福林试剂使用液1.00ml,置于40±0。2℃水浴中显色20min,取出，用分光光度计
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于波长660nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白,分别测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）.
②测定各种酶活力
取15×100mm试管3支，编号1、2、3，每管内加入样品稀释液1ml,置于40℃水浴中预热2min，再加入经同样预热的酪蛋白1ml，精确保温10 min后加入2.0 mL的4％三氯乙酸溶液终止反应，在40℃水浴锅中静置20 min后过滤.取1。0 mL滤过液，依次加入5。0 mL的0。4 mol/L Na2CO3溶液，1。0 mL已稀释的福林试剂，混合后于40℃水浴中静置20 min。在660 nm波长下以空白管做参比测定吸光度。空白管在加入酪蛋白溶液和蛋清溶液后，先加入三氯乙酸溶液再加入酶溶液。实验重复3次，数据取平均值.
酶活的计算如下：
在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，定义为1个酶活力单位。
样品蛋白酶活力单位(干基）=样品蛋白酶活力单位=
A14N 101W式中,A ——由样品测得的OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数（或OD值×K）;
4 -—4ml反应液取出1ml测定(即4倍)； N —-酶液稀释的倍数； 10 ——反应10min； W ——样品水分含量； K-吸光常数；
2。2。2 蛋白质含量测定法-福林-酚法［12］
用福林—酚法测定试样中的蛋白质浓度。
1.标准曲线的绘制
按表2—2配制不同浓度的酪蛋白标准溶液
表2—2 酪蛋白酸标准溶液
管号
酪氨酸标准溶液的
浓度μg/ml
０ １ ２
0 40 80
取200μg/ml酪氨酸标准溶液的体积
ml 0 0。2 0。4
1。0 0。8 0.6 取水的体积ml
10 – –
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３ ４ ５
120 160 200
0。6 0。8 1。0
0。4 0.2 0
上表酪蛋白标准溶液与3 mL福林-酚甲液混合均匀，在25℃水浴锅中静置10 min.再加入0。3 mL 1 mol/L福林—酚乙液迅速混合，在25℃水浴锅中静置30 min后，以介质溶液调零，在750 nm下，以不含酪蛋白的0管为空白，分别测定吸光度，以吸光度A为纵坐标,酪蛋白的浓度C为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点）.
2.样品处理
取水解液6ml，沸水浴灭酶10min后,加入4％三氯乙酸2ml沉淀30min，然后4000r/min离心10min，取上清液1ml稀释50倍测蛋白质含量。 3.样品蛋白质的测定—福林-酚法［13]
1 mL样品稀释液与3 mL福林—酚甲液混合均匀,在25℃水浴锅中静置10 min。再加入0.3 mL 1 mol/L福林—酚乙液迅速混合，在25℃水浴锅中静置30 min后， 在750 nm下,以介质溶液调零,以不含酪蛋白的0管为空白，测定吸光度,根据作图或回归方程，与蛋白质标准液作对照,求出样品的蛋白质的含量.
本法在0～60mg/L蛋白质范围内呈良好线性关系。 利用标准曲线回归方程计算样液中多肽含量.
多肽得率(%)样品蛋白含量(g/ml)蛋清液蛋白总含量(g/ml)100%
2。2。3 水解度测定法-茚三酮比色法[13］ （1)标准曲线的绘制
取0.1000g干燥过的甘氨酸溶解后定容至100ml，取出2.00ml定容至100ml得20μg/ml的溶液。取此液再分别稀释成含量为2—20μg/ml的溶液用于标准曲线绘制.取2.00ml测定用稀释液于试管中加入1.00ml显色剂,混匀后沸水浴中加热15min,同时作空白试验;然后冷水冷却，加入5.00ml40%乙醇溶液混匀，放置15min后用1cm比色杯,以空白管调零于570nm处测定A值。以吸光度A为纵坐标，甘氨酸浓度C为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点）。
表2—3 甘氨酸标准溶液
管号 甘氨酸标准溶液的含量/μg 取显色剂的体积/ml
11 – –
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0 0 1 1 4 1 2 8 1 3 12 1 4 16 1 5 20 1 6 24 1
样液中一NH2基的测定：取样液2。0ml定容至100ml,取1。0ml稀释液于试管中并加入1。0ml蒸馏水、1。00ml显色剂,混匀后置沸水浴中加热15min。同时作空白试验。以后操作同标准曲线。利用标准曲线计算样液中一NH2的含量（μmol/ml）.
DH[NH2的含量（μmol/ml）0.33（mmol/g）]9.1438(mmol/g)100%（甘氨酸
6.25·N(mg/ml)的分子量为75.07g/mol）
2。2。4 抗氧化性的测定方法—邻苯三酚自氧化法[14］
多肽中具有抗氧化活性的物质。邻苯三酚自氧化法是测定SOD（超氧化物歧化酶）活性的常用的方法。采用3ml体系对各组分进行邻苯三酚自氧化的测定.取0。1ml样品溶液，加入0.1mol/L Tris—HCl缓冲液（pH8。2）2.8ml，25℃保温10min,然后加入3mmol/L邻苯三酚(10mmol/ L HCl）0。1mL混匀，开始记时，每隔30s读取A320,5min后结束。对照管以加蒸馏水0。1ml代替0。1ml样品溶液。作吸光度随时间变化的加回归方程,其斜率为邻苯三酚自氧化速率V，计算样品对超氧阴离子自由基的抑制率见下式：
抑制率V对照V样品100%
V对照式中 V对照---—表示对照组邻苯三酚自氧化速率
V样品——- 表示样品组邻苯三酚自氧化速率
2。3 实验方法
2。3。1 工艺流程
新鲜鸡蛋→搅打→调配→热处理→加酶→酶解→恒温磁力搅拌2h→取样6ml→沸水浴(或调pH）灭酶10min
操作要点：
1．搅打：从新鲜鸡蛋中分离出蛋清,用10000r/min高剪切10min.
12 – –
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2． 调配：吸取25ml蛋清液，加入50ml蒸馏水，配制成4％的蛋清液。 3． 热处理：用2mol/lNaOH溶液调pH=10。00，85℃水浴静置30min.
4． 灭酶：测蛋白质含量时，沸水浴灭酶后加入三氯乙酸沉淀30min；测水解度和抗氧化性用2 mol/L HCl调pH=2。0灭酶，不需加三氯乙酸沉淀.
2.3。2蛋清蛋白水解酶的筛选
1. 以原蛋清液为原料的蛋白水解酶的筛选
从新鲜鸡蛋中分离出蛋清,以100000r/min高剪切10min，量取搅拌均匀的蛋清液25ml，加入50ml蒸馏水，配制成4％的蛋清水解溶液.分别加入风味蛋白酶（novozymes)、碱性蛋白酶（novozymes）、复合蛋白酶（novozymes)、复合蛋白酶(动物酶南宁庞博公司）、复合蛋白酶（南宁庞博公司)、碱性蛋白酶（南宁庞博公司）各0。03g，适宜条件下（见表2—4）恒温磁力搅拌2h，在水解过程中连续滴加2 mol/L的NaOH维持pH恒定，记录耗碱量,再分别在水解10min,20min，40min，60min，120min时取水解液6ml灭酶。（1)测蛋白质含量时沸水浴灭酶后加入三氯乙酸沉淀30min(2)测水解度和抗氧化性用2 mol/L Hcl调pH=2.0灭酶,不需加三氯乙酸沉淀。然后4000r/min离心10min。取上清液1ml稀释50倍检测。
2。 以碱处理蛋清液为原料的蛋白水解酶的筛选
1）从新鲜鸡蛋中分离出蛋清，以100000r/min高剪切10min，吸取蛋清配制成4％的蛋清液，用2mol/lNaOH溶液调pH=10.00，85℃水浴静置30min，分别加入风味蛋白酶（novozymes）、碱性蛋白酶（novozymes)、复合蛋白酶（novozymes）、复合蛋白酶（动物酶南宁庞博公司)、复合蛋白酶(南宁庞博公司)、碱性蛋白酶(南宁庞博公司）各0。03g,适宜条件下恒温磁力搅拌2h，在水解过程中连续滴加2 mol/L的NaOH维持pH恒定，记录耗碱量，在水解60min时取水解液6ml灭酶。（1）测蛋白质含量时沸水浴灭酶后加入三氯乙酸沉淀30min(2）测水解度和抗氧化性用2 mol/L Hcl调pH=2。0灭酶，不需加三氯乙酸沉淀。然后4000r/min离心10min.取上清液1ml稀释50倍检测。 2）从新鲜鸡蛋中分离出蛋清,以100000r/min高剪切10min,吸取蛋清配制成4%的蛋清液,用2mol/lNaOH溶液调pH=10。00,85℃水浴静置30min，分别加入碱性蛋白酶（novozymes）复合蛋白酶（动物酶南宁庞博公司）各0。03g,适宜条件下恒温磁力搅拌2h，在水解过程中连续滴加2 mol/L的NaOH维持pH恒定，记录耗碱量，再分别在水解10min，20min，40min，60min，120min时取水解液6ml灭酶.（1)测蛋白质含量时沸水浴灭酶后加入三氯乙酸沉淀30min(2）测水解度和抗氧化性用2 mol/L Hcl调pH=2。0灭酶，不需加三氯乙酸沉淀.然后4000r/min离心10min。取上清液1ml稀释50倍检测。 3.酶解物的测定方法
13 – –
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蛋白质含量测定法同2。2.1，水解度测定法同2。2。2,抗氧化性的测定方法同2。2.3.
表2—4 各种蛋白酶的性质、水解条件
商品酶名称 酶性质 最适条件 风味蛋白酶（novozymes) 外切酶 PH=6。0 T=45℃ 碱性蛋白酶（novozymes) 内切酶 PH=8。5 T=55℃ 中性蛋白酶（novozymes) 内切酶 PH=7.0 T=50℃ 复合蛋白酶(novozymes) 内切酶 PH=7。0 T=50℃ 复合蛋白酶（动物酶) PH=7。0 T=50℃ 复合蛋白酶（FH-N-GA) PH=7。0 T=50℃ 碱性蛋白酶（十万单位） 内切酶 PH=8.5 T=55℃
2.3.3 单因素实验
1。单因素实验设计如下： (1）pH值
准确称取25。0000g天然蛋清,加入50ml蒸馏水，用2mol/lNaOH溶液调pH=10。00后85℃水浴加热30min 。冷却至室温,调pH分别为6.0、7.0、8。0、8。5,加入0.03g酶，50℃水浴恒温磁力搅拌酶解5h(酶解条件T=50℃、［S]= 4%、[E］/[S］= 1/100、t=2h不变，pH值分别为6。0、7。0、8。0、8。5)。在水解过程中连续滴加2 mol/L的NaOH维持pH恒定，记录耗碱量，水解5h时取水解液6ml灭酶.其后操作同2。3.3操作步骤。 （2)温度 T
准确称取25.0000g天然蛋清，加入50ml蒸馏水，用2mol/lNaOH溶液调pH=10。00后85℃水浴加热30min .冷却至室温，调pH分别为7.0，加入0.03g酶，分别置于40℃50℃、55℃、60℃、65℃水浴恒温磁力搅拌酶解5h(酶解条件T=50℃、［S］= 4%、[E]/［S]= 1/100、t=2h不变，温度T分别为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）。在水解过程中连续滴加2 mol/L的NaOH维持pH恒定，记录耗碱量，水解5h时取水解液6ml灭酶。其后操作同2.3.3操作步骤. (3)底物浓度[S］
准确称取25。0000g天然蛋清，分别加入50ml、35ml蒸馏水,用2mol/lNaOH溶液调pH=10。00后85℃水浴加热30min 。冷却至室温，调pH 7.0，加入0。03g酶，50℃水浴恒温磁力搅拌酶解5h（酶解条件PH=7.0、T= 50℃、［E］/[S]= 1/100、t=2h
14 – –
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不变，底物浓度[S］分别为4％、6％），在水解过程中连续滴加2 mol/L的NaOH维持pH恒定,记录耗碱量，水解5h时取水解液6ml灭酶。其后操作同2。3。3操作步骤.
（4）［E］/[S］
准确称取25.0000g天然蛋清,加入50ml蒸馏水,用2mol/lNaOH溶液调pH=10.00后85℃水浴加热30min 。冷却至室温,调pH为7。0，分别加入0.09g、0.06g、0。03g、0.02g、0。01g酶，50℃水浴恒温磁力搅拌酶解5h（酶解条件pH=7.0、T= 50℃、 ［S］= 4%、t=2h不变,[E］/［S]分别为1/25、1/50、1/100、1/150、1/200）
在水解过程中连续滴加2 mol/L的NaOH维持pH恒定,记录耗碱量，水解5h时取水解液6ml灭酶。其后操作同2。3.3操作步骤。
（5）酶解时间
准确称取25.0000g天然蛋清,加入50ml蒸馏水，用2mol/lNaOH溶液调pH=10。00后85℃水浴加热30min 。冷却至室温，调pH为7。0，加入0。03g酶，50℃水浴分别恒温磁力搅拌酶解20min、40min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h（酶解条件PH=7。0、T= 50℃、 [S］= 4％、t=2h不变，时间t分别为20min、40min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h)。在水解过程中连续滴加2 mol/L的NaOH维持pH恒定，记录耗碱量，水解5h时取水解液6ml灭酶。其后操作同2。3。3操作步骤.
2.3.4 确定蛋清蛋白酶解的最佳工艺条件
在蛋清蛋白水解初步研究的基础上,采用正交实验确定最佳蛋清蛋白酶解工艺条件.
15 – –
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16 – –
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第三章 实验结果与讨论
3。1 七种酶活力测定实验
3。1.1 标准曲线的绘制
1。 福林法标测酶活力标准曲线见图3-1
1 0.8 y = 0.0091x + 0.0074 R 2= 0.9979 OD值 0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 60 80 100 120 酪氨酸浓度(ug/ml)
图3-1 福林法标测酶活力标准曲线
3.1.2 酶活力测定结果
酶活力测定结果表3—1:
表3-1 七种酶活力
商品酶名称
风味蛋白酶(novozymes） 碱性蛋白酶（novozymes) 中性蛋白酶(novozymes) 复合蛋白酶（novozymes) 复合蛋白酶（动物酶） 复合蛋白酶（FH—N—GA） 碱性蛋白酶（十万单位）
酶活 7178IU/g 102511IU/g 4511IU/g 79511IU/g 146511IU/g 19289IU/g 51289IU/g
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3.2 蛋清蛋白水解酶的筛选
参考有关文献［3］，在各种酶的适宜条件下，以多肽得率、水解度、抗氧化性为指标进行筛酶.
3。2。1 标准曲线的绘制 1. 福林-酚法标准曲线见图3-2
10.8y = 0.0036x + 0.1025R2 = 0.9949OD值0.60.40.20050100150200250酪蛋白浓度(ug/ml)
图3—2福林—酚法标测多肽标准曲线
2。 茚三酮比色法标准曲线见图3-3
0.50.4OD值y = 0.0113x + 0.0028R2 = 0.99920.30.20.1001020304050甘氨酸浓度(ug/ml)
图3—3 茚三酮比色法标准曲线
3.2.2 以原蛋清液为原料的蛋白水解酶的筛选
不同蛋白酶在其适宜条件下，对蛋清蛋白多肽得率、水解度、抗氧化性的影响,如图3—4、3—5、3-6所示.
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2520151050050100时间/min150碱性蛋白酶（novozymes)复合蛋白酶（novozymes)风味蛋白酶（novozymes)复合蛋白酶（FH-N-GA，庞博公司)碱性蛋白酶（十万单位，庞博公司)多肽得率/%
由图3—4可以看出,蛋清蛋白多肽得率随着酶解时间的增加而增大，其中碱性蛋白酶（十万单位）和复合蛋白酶（novozymes）的多肽得率最大。
碱性蛋白酶（novozymes)复合蛋白酶（novozymes)风味蛋白酶（novozymes)复合蛋白酶（FH-N-GA，庞博公司)碱性蛋白酶（十万单位，庞博公司)050100时间/min图3-5 不同蛋白酶对蛋清水解度的影响150图3-4 不同蛋白酶对蛋清多肽得率的影响4.543.532.521.510.50
由图3-5可以看出，蛋清蛋白水解度随着酶解时间的增加而逐渐增大，最后趋于平衡，其中碱性蛋白酶（十万单位)和复合蛋白酶(novozymes）的水解度最大。
水解度/%19 – –
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1.61.41.2相对抗氧化值10.80.60.40.20050时间/min100150碱性蛋白酶（novozymes)复合蛋白酶（novozymes)风味蛋白酶（novozymes)复合蛋白酶（FH-N-GA，庞博公司)碱性蛋白酶（十万单位，庞博公司)
由图3—6可以看出,蛋清蛋白抗氧化性随着酶解时间的增加而趋于平衡，其中复合蛋白酶（novozymes)的抗氧化性最大。
3.2.3 以碱处理蛋清液为原料的蛋白水解酶的筛选
酶解时间为1h时， 不同蛋白酶在其适宜条件下对蛋清蛋白多肽得率、水解度、抗氧化性的影响,如下图3—7、3—8、3-9、3—10所示。
复合蛋白酶（novozymes)复合蛋白酶（FH-N-GA，庞博公司)复合蛋白酶（FH-N-GA，庞博公司)风味蛋白酶（novozymes)碱性蛋白酶（novozymes)碱性蛋白酶（十万单位，庞博公司)1h时间图3-7 不同蛋白酶对蛋清蛋白多肽得率的影响图3-6 不同蛋白酶对蛋清蛋白抗氧化性的影响2520多肽得率/%151050
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由图3-7可以看出,不同蛋白酶在其适宜条件下酶解蛋清1h,其中碱性蛋白酶（十万单位）的多肽得率最大。
12 10 8 复合蛋白酶 （novozymes ) 复合蛋白酶 （庞博公司） 复合蛋白酶 （动物酶庞博公司） 风味蛋白酶 （novozymes ) 碱性蛋白酶 （novozymes ) 碱性蛋白酶 （庞博公司） 1h 时间 不同蛋白酶对蛋清蛋白水解度的影响 图 3 -8 DH% 6 4 2 0 由图3—8可以看出，不同蛋白酶在其适宜条件下酶解蛋清1h，其中碱性蛋白酶(novozymes）与复合蛋白酶(动物酶）的水解度最大。
复合蛋白酶（novozymes)1210864201h时间复合蛋白酶（FH-N-GA，庞博公司)复合蛋白酶（动物酶，庞博公司)风味蛋白酶（novozymes)碱性蛋白酶（novozymes)碱性蛋白酶（十万单位，庞博公司)水解度/%
由图3—9可以看出，不同蛋白酶在其适宜条件下酶解蛋清1h,其中碱性蛋白酶(novozymes）与复合蛋白酶（动物酶)的抗氧化性最大。
图3-9 不同蛋白酶对蛋清蛋白水解度的影响21 – –
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0.90.80.70.60.50.40.30.20.101h时间复合蛋白酶（novozymes)复合蛋白酶（FH-N-GA，庞博公司)复合蛋白酶（动物酶，庞博公司)风味蛋白酶（novozymes)碱性蛋白酶（novozymes)碱性蛋白酶（十万单位，庞博公司)相对抗氧化值
图3-10 不同蛋白酶对蛋清蛋白抗氧化性的影响
由图3—10可以看出，不同蛋白酶在其适宜条件下酶解蛋清1h,其中碱性蛋白酶（novozymes)与复合蛋白酶（动物酶）的抗氧化性最大。
3. 碱性蛋白酶（novozymes)与复合蛋白酶（动物酶)在其适宜条件下,不同时间下，对蛋清蛋白多肽得率、水解度、抗氧化性的影响，如下图3—11、3—12、3—13所示。
35 30 25 20 15 10 5 0 0 50 多肽得率 /% 复合蛋白酶 )（动 物酶庞博公司碱性蛋白酶 （novozymes ) 150 时间 / min 100 200 图 3 - 11 不同蛋白酶对蛋清蛋白多肽的率的影响
由图3—11可以看出，不同蛋白酶在其适宜条件下酶解蛋清,蛋清蛋白多肽得率随着酶解时间的增加而逐渐增大，复合蛋白酶(novozymes)作用后蛋清蛋白的多肽得率更大。
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876复合蛋白酶（动物酶，庞博公司)碱性蛋白酶（novozymes)水解度/%543210050100时间/min图3-12 不同蛋白酶对蛋清蛋白水解度的影响150200
由图3—12可以看出，不同蛋白酶在其适宜条件下酶解蛋清蛋白,复合蛋白酶(novozymes）作用后蛋清蛋白的水解度更大。
复合蛋白酶（动物酶，庞博公司)碱性蛋白酶（novozymes)0.40.350.3相对抗氧化值0.250.20.150.10.050050100时间/min图3-13 不同蛋白酶对蛋清蛋白抗氧化性的影响150200
由图3-13可以看出,不同蛋白酶在其适宜条件下酶解蛋清蛋白，复合蛋白酶(动物酶）作用后蛋清蛋白的抗氧化性更大.
故选择国产复合蛋白酶(庞博公司）作为蛋清蛋白酶解的酶制剂.由于卵抑制物和类卵粘蛋白的抑制作用，蛋白酶直接作用于蛋清蛋白，酶解效果降低等。用pH=10，85℃处理30min后,蛋清蛋白抑制物失活变性，蛋白酶酶解效果大大提高。
23 – –
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3。3 复合蛋白酶(庞博公司）水解蛋清蛋白工艺条件的研究
3。3。1 pH值对蛋清蛋白水解效果的影响.
pH值对蛋清蛋白多肽得率的影响,如下图3-14所示
0.450.40.350.30.250.20.150.10.0500246810多肽得率/%pH值图3-14 不同pH对蛋清蛋白多肽得率的影响
由图3-14可以看出，随着pH值的增大，蛋清蛋白的多肽得率增大,当pH=8。5时,多肽得率最大。
pH值对蛋清蛋白水解度的影响，如下图3—13所示
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876多肽得率/%543210024pH值6810图3-15 不同pH值对蛋清蛋白水解度的影响
由图3—15可以看出,随着pH值的增大,蛋清蛋白的水解度增大，当pH=8.5时，水解度最大。
pH值对蛋清蛋白抗氧化性的影响，如下图3—16所示
393837抑制率/%363534333201234pH值56789图3-16 不同pH值对蛋清蛋白抗氧化性的影响
由图3—16可以看出，当pH=7。0时，蛋清蛋白的抗氧化性最大，当pH值继续增大时，抗氧化性明显下降。
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3。3。2 温度(℃)对蛋清蛋白水解效果的影响。
温度（℃)对蛋清蛋白多肽得率的影响，如下图3—17所示.
3530多肽得率/%2520151050010203040506070温度（℃）
由图3-17可以看出,温度对蛋清蛋白多肽得率的影响很明显,当温度为60℃时，多肽得率最大。
温度(℃)对蛋清蛋白水解度的影响，如下图3-18所示。
图3-17 不同温度对蛋清蛋白多肽得率的影响9876543210010203040506070温度（℃）图3-18 不同温度对蛋清水解度的影响 由图3-18可以看出，温度对蛋清蛋白水解度的影响很大,当温度为50℃时，蛋清蛋白的水解度最大.
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水解度/%齐齐哈尔大学毕业设计(论文)
温度(℃)对蛋清蛋白抗氧化性的影响，如下图3-19所示。
454035302520151050010203040506070温度（℃）抑制率/%图3-19 不同温度对蛋清蛋白抗氧化性的影响 由图
3—19可以看出,温度对蛋清蛋白抗氧化性的影响很大，当温度为50℃时,蛋清蛋白的抗
氧化性最大。
3。3.3 底物浓度［s］%对蛋清蛋白水解效果的影响。
底物浓度［s］％对蛋清蛋白多肽得率的影响,如下图3—20所示.
3530多肽得率/%25201510500%1%2%3%[S]%图3-20 不同底物浓度对蛋清蛋白多肽得率的影响4%5%6%7%
由图3—20可以看出，底物浓度对蛋清蛋白多肽得率的影响很大,底物浓度从4%增大到6％时，多肽得率显著降低，当[s］=4%时，蛋清蛋白的多肽得率大。 底物浓度[s］％对蛋清蛋白水解度的影响,如下图3—21所示
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141210水解度/%864200%1%2%3%[S]%图3-21 不同底物浓度对蛋清蛋白水解度的影响4%5%6%7%
由图3—21可以看出,底物浓度对蛋清蛋白水解度的影响很大，底物浓度从4％增大到6％时，水解度显著降低,当[s]=4％时,蛋清蛋白的水解度大.
底物浓度［s］％对蛋清蛋白抗氧化性的影响,如下图3-22所示
353025抑制率/%201510500%1%2%3%[S]%图3-22不同底物浓度对蛋清蛋白抗氧化性的影响4%5%6%7% 由图3-22可以看出，底物浓度对蛋清蛋白抗氧化性的影响很大，底物浓度从4％增大到6％时，抑制率显著降低，当［s］=4%时，蛋清蛋白的抑制率大. 3。3.4 不同［E］/［S］对蛋清蛋白水解效果的影响。
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不同[E]/[S]对蛋清蛋白多肽得率的影响,如下图3—23所示
0.250.2多肽得率/%0.150.10.0500%1%2%[E]/[S]图3-23不同加酶量对蛋清蛋白多肽得率的影响3%4%5%
图3—23表明,加酶量对蛋清蛋白多肽得率的有影响。由图3-22发现加酶量大多肽得率不一定大，当[E]/［S]=1/100时，蛋清蛋白的多肽得率最大。 不同[E］/［S］对蛋清蛋白的水解度的影响，如下图3-24所示
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302520水解度/%1510500%1%2%[E]/[S]图3-24 不同加酶量对蛋清蛋白水解度的影响3%4%5%
图3—24表明，加酶量对蛋清蛋白水解度的有很大影响。水解度随加酶量的增大而增大，当[E]/［S］=4/100时，蛋清蛋白的水解度最大.
不同[E］/[S］对蛋清蛋白抗氧化性的影响，如下图3—25所示
5040抑制率/%30201000%1%2%[E]/[S]3%4%5%
图3—25表明，加酶量对蛋清蛋白抗氧化性的有很大影响.抑制率也随加酶量的增大而增大,当［E］/［S]=4/100时，蛋清蛋白的抑制率最大。 3.3。5 不同酶解时间对蛋清蛋白水解效果的影响。
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图3-25 不同加酶量对蛋清蛋白抗氧化性的影响齐齐哈尔大学毕业设计(论文)
不同酶解时间对蛋清蛋白多肽得率的影响,如下图3-26所示
50多肽得率/%4030201000100200300时间/min400500600
图3-26表明，酶解时间在1h内，多肽得率随时间明显增大,随着时间的增加，多肽得率的变化缓慢逐渐趋于平衡，兼顾生产成本，酶解时间不宜过长，本实验选择适宜酶解时间为5h。
不同酶解时间对蛋清蛋白的水解度的影响，如下图3-27所示。
图3-26 不同时间对蛋清蛋白多肽得率的影响141210864200100200300时间/min图3-27 不同时间对蛋清蛋白的水解度的影响400500600
图3-27表明，酶解时间在3h内，水解度随酶解时间明显增大，3h后随着时间的增加，水解度的变化缓慢,兼顾生产成本，酶解时间不宜过长，本实验选择适宜酶解时间为5h。
不同酶解时间对蛋清蛋白的抗氧化性的影响，如下图3-28所示
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水解度/%齐齐哈尔大学毕业设计(论文)
50454035抑制率/%3025201510500100200300时间/min图3-28 不同时间对蛋清蛋白抗氧化性的影响400500600
图3—28表明，抑制率随时间的变化不大，考虑到经济效益,酶解时间不宜过长,本实验选择适宜酶解时间为5h。
由上得知，综合考虑，初步选择较适宜的蛋清蛋白酶解条件为:pH为7.5～8.5,［s］为3％～5%，［E］/［s］为2％~4％，酶解时间为5h。
3.4 正交实验确定复合蛋白酶(庞博公司）水解蛋清蛋白的最佳工艺条件
在上述单因素实验的基础上，选择pH值、温度T、底物浓度[s］、［E］/[s］和酶解时间影响因素，选择L9(43）正交表进行实验验确定蛋清蛋白酶解的最佳工艺条件.水平因素表和实验结果如表3—2、3—3。
表3—2 蛋清酶解的正交因素水平表
因素 pH T(℃) ［S] ［E]/［S］ 1 7。5 50 3% 2/100 2 8.0 55 4％ 3/100
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3 8。5 60 5％ 4/100
表3—3 复合蛋白酶（动物酶)水解蛋清蛋白影响因素正交实验结果
A B C D
实验号 PH值 温度（℃） ［s］％ ［E］/［S］ 水解度/％ 抑制率/％
1 7。5 50 3 2/100 0。219146613 0.4312 2 7。5 55 4 3/100 0.103836259 0。4521 3 7。5 60 5 4/100 0。159163313 0。4541 4 8.0 50 4 4/100 0。145811248 0.4375 5 8.0 55 5 2/100 0。073488353 0.4458 6 8。0 60 3 3/100 0。13178449 0。4313 7 8。5 50 5 5/100 0。21860471 0。3552 8 8。5 55 4 4/100 0。204596645 0。4373 9 8.5 60 4 3/100 0.166112231 0.3958 水K1 0.380 0。399 0.406 0。348 解K2 0。3075 0。2999 0.332 0。362 度K3 0。347 0。335 0.296 0.324 R 0。072 0。099 0。075 0。037
实验的极差分析见图3—29、3—30所示.
0.25 0.2 K值 0.15 0.1 0.05 0 A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3 影响因素 图3-29 复合蛋白酶(动物酶庞博公司)酶解蛋清蛋白影响水解度因素正交试验结果
由上表及图的结果分析表明，复合蛋白酶(动物酶)酶解蛋清蛋白水解度的主要影响因素的大小依次为A＞B＞C＞D，即PH值＞温度＞底物浓度＞加酶量。
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以水解度为指标的最佳工艺条件为：PH=8。5、温度为50℃、［s]%=3％、[E］/
［s］=4/100
说明，以水解度在10％-15％之间,抑制率最高。
0.45 0.44 0.43 0.42 K值 0.41 0.4 0.39 0.38 0.37 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3 影响因素 酶解蛋清蛋白影响抑制率因素正交试验结果 图 3-30 复合蛋白酶（ 动物酶庞博公司） A1 A2 A3
由上表及图的结果分析表明，复合蛋白酶（动物酶）酶解蛋清蛋白抑制率的主要影响因素的大小依次为A＞B＞D＞C，即PH值＞温度＞加酶量＞底物浓度。
以抗氧化性为指标的最佳工艺条件为：pH=8.5、温度=50℃、［s]%=4％、[E］/［s］=4/100
综合分析单因素与正交实验结果，以水解度为指标的最佳工艺条件为：pH=8。5、
温度为50℃、[s］％=3％、[E］/[s]=4/100.在此条件下。
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第四章 结 论
1. 酶法水解蛋清蛋白质制备活性肽是可行的.
2。实验确定了以多肽得率、水解度、抗氧化性为指标酶法水解鸡蛋白蛋白的最佳蛋白酶为复合蛋白酶(动物酶）。
3。实验以水解度为指标通过单因素和正交实验确定了鸡蛋白蛋白酶法水解的最佳工艺条件为：PH=8。5、温度为50℃、［s］％=3％、[E］/［s］=4/100、t=5h，抑制率达45％以上。
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致 谢
本论文是在王伟和王文侠老师的悉心指导和亲切关怀下完成的。王老师严谨求实的科学态度、平易近人的作风和对学术的卓越见解使本人受益匪浅.在论文完成之际,谨向王老师表示衷心的感谢!
在整个论文的实验过程中,得到了郑喜群教授，蒋继丰副教授，张慧君副教授，翟丽萍老师，杨庆余老师的大力帮助和支持，在此我深表感谢。
同时，感谢我周围的同学,朋友,他们也给了我莫大的鼓励和提供了诸多方便，使我使我的实验能够顺利的完成。最后,再次向所有老师和同学致以最衷心的感谢。
感谢母校的培养,怀念在齐齐哈尔大学读书和生活的日子！
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