藜蒿三萜分离纯化及其体外抗氧化_抗菌活性研究

2022-06-06 来源：步旅网

天然产物研究与开发NatProdResDev2009,21:3122318

文章编号:100126880(2009)0220312207

藜蒿三萜分离纯化及其体外抗氧化、抗菌活性研究

辛　欣,余　宙,范青生,魏　强

南昌大学食品科学教育部重点实验室,中德联合研究院,南昌330047

摘　要:本试验优化了藜蒿三萜的提取工艺,确定了紫外分光光度法测定藜蒿总三萜的最佳实验条件,采用小鼠肝匀浆脂质过氧化和自由基体系法对藜蒿三萜抗氧化活性进行了评价,并通过抑菌圈实验分析了其抑菌效果。结果表明:90%乙醇为溶剂,料液比为1∶10,提取温度70℃,提取时间45min,重复提取两次,得到藜蒿总三萜含量的占茎干重的0.192%。通过功能验证藜蒿三萜提取物有明显的抗氧化和抑菌效果。关键词:藜蒿;三萜类化合物;紫外分光光度法;抗氧化;抗菌中图分类号:R282.2;Q949.9

文献标识码:A

SeparationandPurificationofTriterpenoidinArtemisiaselengensisTurcz.andItsAnti2oxidationandBacteriostaticEffectinvitroXINXin,YUZhou,FANQing2sheng,WEIQiangKeyLaboratoryofFoodScienceofMinistryofEducation,Sino2GermanJointResearchInstitute,NanchangUniversity,Nanchang330047,China3

Abstract:ThistestoptimizedtheextractionparametersofthetriterpenoidinArtemisiaselengensisTurcz.andtheultravi2oletspectrophotometrymethod.Lipidperoxidationofmouseliversuspensionandhydroxylradicalsystemverifidethee2valuationoftheactivityofanti2oxidationofthetriterpenoidinArtemisiaselengensisTurcz.Then,thebacteriostaticeffectofthetriterpenoidwasanalyzedbythemethodofbacteriostaticcircle.Sotheoptimizedparameterswereasfollow:50%(V/V)ethanolassolvent,materialtoliquid1∶10,extractingat70℃for45mintwice.Theyieldofthetriterpenoidindriedstemswas0.192%.FunctionalverificationshowedthatthetriterpenoidinArtemisiaselengensisTurcz.hadconspic2uousactivityofanti2oxidationandbacteriostaticeffect.

Keywords:ArtemisiaselengensisTurcz.;triterpenoid;ultravioletspectrophotometrymethod;anti2oxidation;bacteriostasis

　　藜蒿(ArtemisiaselengensisTurcz.),正名萎

[1]

蒿。我国东北、华北、华中低洼潮湿的圩堤荒滩、水甸边湿地、沼泽、水边、林灌丛下、湿草甸、淡水湖

[2]

草滩地均有野生种分布。

藜蒿具有保护肝脏、抗肿瘤、抗菌等作用,是一种开发前景较好的野生植物资源,但目前的研究较

[1]

多的集中于蔬菜保鲜方面,其各种保健功效的作用机理还有待进一步研究。藜蒿不同于普通蔬菜之处在于它具有很好的保健和药理价值。本试验首次对藜蒿里的有效成分三萜类化合物进行了分离纯化,通过采用小鼠肝匀浆脂质过氧化试验,测定藜蒿三萜的体外抗氧化活性,首次验证了藜蒿的护肝作用,并通过抑菌圈试验验证了三萜化合物的抑菌作用。

1　仪器与材料

1.1　仪器

Agillent100型组合式全自动高效液相色谱仪;UV22000紫外分光光度计(上海尤尼柯公司);FA1104电子天平(上海精天电子仪器厂);旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器有限公司);ZK282A型真

空干燥箱(上海实验仪器总厂)。1.2　材料

藜蒿(ArtemisiaselengensisTurcz.)野生藜蒿采自江西省鄱阳湖地区。

SD大鼠,体重432～445g,由江西省动物实验中心提供。供试菌种大肠杆菌(Excherichiacoli)ATCC25922;金黄色葡萄球菌(Staphylococcusau2reas)ATCC29213;枯草芽抱杆菌(Bcillussubtilis)ATCC6633均系我校环境科学与工程学院微生物实验室提供。齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检

　收稿日期:2007208201　　　接受日期:2008211226　基金项目:2007年度江西省科技支撑计划项目3通讯作者Tel:862013970908096;E2mail:cnfoods@163.com

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313

定所,批号:1107092200304,供含量测定用)。培养

[3]

基牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏5g,蛋白陈10g,NaCl15g,琼脂15g,水1000mL,pH7.0～7.2。

1,12二苯基222苦味肼基自由基(DPPH,购于Sigma),邻苯三酚,三羟(羟甲基)氨基甲烷(Tris),H2O2,FeSO4,三氯乙酸(TCA)等均为国产分析纯。乙醇为95%工业乙醇,水为超纯水。其余试剂均为分析纯。

液,浓缩至干,乙醇溶解,定容至10mL。对香草醛反应呈阳性的洗脱成份用HPLC检测。2.2.3　齐墩果酸对照样品的制备

精密称取齐墩果酸对照品0.0082g,至100mL量瓶中,加无水乙醇至刻度,摇匀,作为对照品溶液(浓度0.082mg/mL),即得。

2.3　紫外分光光度法对藜蒿总三萜的测定2.3.1　标准曲线的绘制

2　实验方法

2.1　藜蒿三萜类化合物的定性反应

2.1.1　柴可夫斯基反应(Salkowki)

精密吸取齐墩果酸对照品液(浓度0.082mg/

mL)0.7、1.0、1.3、1.6、1.9mL置试管中,水浴挥干溶剂,加入新配制的5%香草醛2冰醋酸溶液0.4mL、高氯酸1mL,60℃水浴中加热15min,立即以冰水冷却,加入冰醋酸5mL,摇匀,静置10min,在548nm处测定吸收值,以齐墩果酸的质量为横坐标,吸光定值为纵坐标,建立标准曲线。

[9,10]

2.3.2　藜蒿总三萜含量的测定按上述试验方法,藜蒿醇提物经硅胶柱分离纯化及薄层色谱鉴定,取对香草醛反应呈阳性的洗脱组份测定吸光值。2.4　体外抗氧化试验2.4.1　大鼠肝匀浆的制备

大鼠禁食12h后,脱椎致死,迅速取出大鼠肝脏,,4℃生理盐水中反复漂洗,用pH7.4的9倍量的冷生理盐水制成10%匀浆,4000r/min离心15min,取上层清液放于4℃冰箱保存待用。2.4.2　待测样品的制备

按文献方法得到的藜蒿醇提物,干燥后用氯仿

溶解,加入一滴浓硫酸,充分振荡,若氯仿层呈深红色或棕红色,说明有三萜类化合物存在。将硫酸层点样在滤纸上,在254nm的紫外分析仪下可以观察到绿色荧光现象。2.1.2　里伯曼反应(Lieberman)

取少量提取物于试管中,70℃下于烘箱中加热后,滴入1mL醋酐和一滴浓硫酸,若两液交界处呈红色并逐渐变成深绿色,说明有三萜类化合物存在。2.1.3　薄层鉴别三萜类化合物常用的显色剂有10%硫酸乙醇溶液、1%香草醛2硫酸溶液等。取经活化荧光硅胶薄板,用微量取样器吸取藜蒿醇提溶液和齐墩果酸对照品溶液,分别交叉点于同一硅胶薄层板上,展开,晾干,显色,测定其Rf值。2.2　液相色谱鉴别2.2.1　色谱条件

色谱柱:PhenomenexLunaC18柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相:甲醇:水(60∶40),检测波长为210nm,柱温:25℃。2.2.2　供试品溶液的制备

藜蒿乙醇提取物经初步的分离纯化,得到三萜

化合物粗品,经紫外分光光度法测得藜蒿总三萜含量,经换算,配置三萜的浓度为0.5、1、1.5、2、215、3mg/mL的溶液。

2.4.3　抗大鼠肝匀浆脂质过氧化试验

2.4.3.1　三萜化合物抑制大鼠肝匀浆自发性脂质

由于藜蒿的醇提物中存在有黄酮、生物碱、酚类

等其他成分,对藜蒿三萜的测定造成干扰,所以要对提取物先进行分离纯化。按文献方法得到的藜蒿乙醇提取物经氯仿萃取,减压浓缩,经硅胶柱层析分[4]

离。硅胶柱规格为2.0cm×40.0cm,环己烷2乙酸乙酯(5∶1)装柱,上柱。以环己烷2乙酸乙酯(5∶1、4∶1、3∶1)进行梯度洗脱,洗脱速度控制在1.0mL/

[527]

min,30mL为一洗脱组分。薄层色谱跟踪检[8]

测,以环己烷2乙酸乙酯(4.5∶1)为展开剂,1%香草醛2硫酸显色,收集红色或红紫色部分,合并洗脱

过氧化的实验

取10%肝匀浆各加入不同浓度藜蒿总三萜溶液(浓度分别为:0、0.5、1、1.5、2、2.5、3mg/mL,下同),零管为对照;在37℃水浴恒温振荡1.5h,取出后加入10%TCA2.0mL,反应5min后,加入0167%TBA1.0mL,振荡混匀,沸水浴反应15min,流水冷却,于3500r/min离心5min除去沉淀,取上清液在532nm处测定吸光值,计算MDA生成量和抑制率,计算IC50(IC50表示清除率为50%时三萜化合物的浓度)。

MDA生成抑制率(%)=(A对照-A样品)/A对照×100%

[11]

314天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol121

式中,A对照为1mL10%肝匀浆+1mL超纯水+2mLTCA+1mLTBA;A样品为1mL10%肝匀浆+1mL三萜样品溶液+2mLTCA+1mLTBA。

2.4.3.2　三萜化合物抑制Vitc2Fe诱导的大鼠肝匀浆脂质过氧化反应试验

[12]式中,A1为5mL三萜溶液+5mLDPPH;A2

为5mL三萜溶液+5mL95%的乙醇;A3为5mL蒸馏水+5mLDPPH。2.4.7　抗坏血酸抗(Vc)氧化能力的比较

Vc以水为溶剂,依次配成0.5、1、5、10mg/mL的溶液,按照2.4.6项与2.4.5项方法测定其抗氧化能力,实验条件与样品相同,将藜蒿三萜提取物抗氧化试验结果与相应浓度的抗坏血酸对照。2.5　体外抑菌试验2.5.1　菌悬液及抑菌滤纸片的制备

将各种供试菌种用适量的斜面培养基进行活化

两次后,用无菌生理盐水制成含菌量约为10～10CFU/mL的菌悬液。将定量滤纸片用打孔器打成直径为6mm圆片。将滤纸片,镊子,培养皿、试管等120℃灭菌15min。

[3]2.5.2　抑菌试验2抑菌圈法取滤纸片放入提取物中浸泡12h,取含提取物滤纸片贴在含菌平板上。每皿贴3片作为平行试验,中间贴以蒸馏水为溶液的滤纸片为空白对照。置37℃培养24h后观察结果,然后用游标卡尺测量滤纸片的抑菌圈直径大小(十字交叉两次结果的平均值),比较抑菌效果。

方法同上,但反应体系中加Vitc(1mmol/L)0105mL,FeS04・7H2O(1mmol/L)0.05mL,混匀,在37℃水浴恒温振荡1.5h,计算抑制率,抑制率计算公式同上,以三萜化合物浓度为横坐标,抑制率为纵坐标绘制曲线,根据回归曲线方程,计算IC50。2.4.4　对・OH自由基清除作用试验参考Fenton反应体系模型,在相同体积的反应

体系(番红溶液520μg/mL,EDTA2Na22Fe1mmol/L,H2O28.8mmol/L,磷酸缓冲溶液pH=714)中加入不同浓度的藜蒿三萜溶液,并以蒸馏水为参比,与试剂空白液比较,在510nm处测吸光度值。

清除率(%)=1-A1-A2

×100%

式中,A1为1.0mL磷酸盐缓冲溶液󰁺0.2mL番红溶液+1.0mLEDTA2Na22Fe+7.0mL三萜󰁺0.8mLH2O2;A2为1.0mL磷酸盐缓冲溶液󰁺

2+012mL番红溶液+1.0mLEDTA2Na22Fe

+7.0mL

H2O󰁺0.8mLH2O2;A3为1.0mL磷酸盐缓冲溶液󰁺0.2mL番红溶液+8.0mLH2O󰁺0.8mLH2O2。2.4.5　对・O22自由基的清除作用试验

3　结果与分析

3.1　藜蒿三萜类化合物的定性反应试验结果3.1.1　柴可夫斯基反应试验结果

取0.05mol/LTris2HCl缓冲液(pH=8.2)4.0mL,置于25℃水浴中预热20min,分别加入待测液

和50mmol/L邻苯三酚溶液,混匀后于25℃水浴中反应5min,加入8%的HCl100μL终止反应,320nm处测定吸光值。以蒸馏水代替待测液作空白实验。

A1-A2

清除率(%)=1-×100%

式中,A1为4mLTris2HCl+1mL三萜溶液+

1mL邻苯三酚;A2为4mLTris2HCl+1mL三萜溶液+1mL蒸馏水;A3为4mLTris2HCl+1mL蒸馏水+1mL邻苯三酚。2.4.6　对DPPH的清除作用

将5mL待测液加入5mL0.2mmol/LDPPH溶液,于25℃水浴中反应20min后于517nm处测定吸光值。以蒸馏水代替待测液作空白实验。

A1-A2

清除率(%)=1-×100%

按2.1.1项试验方法将样品溶于适量的氯仿

中,取上清液2mL沿管壁加入浓硫酸,两液交界面处变为红棕色,最后呈暗棕色,说明有三萜类化合物的存在。3.1.2　里伯曼反应试验结果

按照2.1.2项方法将得到的样品溶于适量的醋酐,取上清液2mL沿试管壁加入浓硫酸,两液交界面处呈红色,并逐渐成深绿色,说明藜蒿中有三萜类化合物存在。3.1.3　薄层鉴别试验结果

由试验结果可看到当选用1%香草醛2硫酸溶液为显色剂,硅胶板不变色,仅三萜类化合物显色红色或紫红色斑点。当选用10%硫酸乙醇溶液为显色剂,以喷雾方式均匀喷洒在薄层上120℃烘干后,硅胶板不变色,三萜类化合物的斑点呈红色,其它组分显色结果不明显。经筛选,用石油醚2乙酸乙酯(4.5∶1)为展开剂展开效果较好。Rf值0～0.6的

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部分为三萜类化合物,其中藜蒿提取物经展开后,有

一点与齐墩果酸标准品有相同的Rf值,其Rf值为0.4,说明有三萜类化合物的存在,并且有齐墩果酸的存在。3.2　液相色谱按上述色谱条件下藜蒿提取溶液、齐墩果酸对照品的色谱分离如图1、2。

　　由图可见,图1、2中含有相同出峰时间的物质,

即藜蒿醇提物中含有齐墩果酸的存在。3.3　正交实验结果与分析

采用L9(3)正交实验法提取藜蒿三萜。野生藜蒿茎经清洗、干燥、粉碎、预处理后得到干粉。称取藜蒿5g,采用乙醇水浴加热回流提取法,回流一定时间后,减压抽滤,氯仿萃取,最后定容至10mL,紫外分光光度法测定总三萜含量。结合预实验及生产实际,选择乙醇的体积、固液比、提取时间、提取温度作为考察因素,如表1所示。

表1　藜蒿三萜提取正交实验表L9(34)

Table1　ExtractionorthogonaltestofthetriterpeneinArtemisia

4selengensisTurcz.L9(3)

因素

水平

Level

A乙醇的体

积分数

Volume

fraction(%)

607590

B固液比Solid2liquidratio1∶101∶121∶14

C提取时间

Extractiontime(min)

456075

D提取温度Extractiontemperature(℃)

708090

123　　根据分光光度法测定总三萜含量,统计分析,确定最佳回流提取工艺,如表2、3所示。

表2　正交实验结果

Table2　ResultofL9(3)orthogonaltest

因素

Factor123456789K1K2K3R

A乙醇的体积分数Volumefraction(%)

1112223334538.0005692.9678564.2334026.233

B固液比Solid2liquidratio

1231231236961.8674909.4336926.9002055.434

C提取时间Extractiontime

(min)

1232313126652.0005827.4336315.767824.567

D提取温度Extractiontemperature(℃)

1233122317099.3336593.6335102.2331997.100

结果

Result(μg)64563070.34087.74789.35219.37070.39640.36429.79622.7

316天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol121

表3　方差分析

Table3　Analysisofvarianceofextractionorthogonaltestresult

因素

FactorA乙醇的体积B固液比C提取时间D提取温度

偏差平方和

Deviation

sumofsquares25788675.128308314.4071031432.4786468414.8601031432.49

自由度

F比FRatioF临界值

显著性

Significance

22222

25.0038.0551.0006.271

19.00019.00019.00019.000

P<0.05

误差Error

　　表2,表3表明各因素对提取效果的影响程度依次为A>B>D>C。A因素有显著性差异,是提取条件中影响最大的因素,而C在所考察范围内则影响最小。由正交试验直观分析得到各因素的最佳组合为A3B1C1D1,而在9个实验当中试验7的结果最优。组合A3B1C1D1实验与试验7结合A3B1C3D2实验结果相比较发现A3B1C1D1结果优于试验7结果,因此最佳的试验条件为A3B1C1D1。3.4　紫外分光光度法对藜蒿总三萜含量的测定结果

3.4.1　标准曲线的绘制

精密吸取齐墩果酸对照品液(浓度0.082mg/mL)0.7、1.0、1.3、1.6、1.9mL置试管中,水浴挥干溶剂,加入新配制的5%香草醛2冰醋酸溶液0.4mL、高氯酸1mL,于60℃水浴中加热15min,立即以冰水冷却,加入冰醋酸5mL,摇匀,静置10min,在548nm处测定吸收值,以齐墩果酸的质量为横坐标,吸光定值为纵坐标,建立标准曲线。如图3所示。

与葡萄,山楂中三萜化合物含量相似,比灵芝中含量略低。3.5　体外抗氧化试验结果3.5.1　抗大鼠肝匀浆脂质过氧化试验结果由抑制效应曲线(图4)可知:三萜化合物对自2+

发脂质过氧化和Vitc2Fe诱导脂质过氧化均有良好的抑制,反应体系中随着三萜化合物浓度的增加自发氧化和诱导氧化的抑制率也相应的增加,IC50分别约为1.3和1.2mg/mL。由此可反映出藜蒿具有很好的抗氧化作用。

图4　藜蒿三萜化合物抑制脂质过氧化效果

Fig14　Effectoftriterpeneonlipidauto2oxidationreaction

andinduced2oxidation

3.5.2　对・OH自由基清除作用试验结果

由图5可知,当藜蒿三萜化合物浓度在3mg/mL时,对・OH自由基的清除效果可达到70%以上,IC50分别约为2.3mg/mL。说明了三萜化合物对

图3　齐敦果酸标准曲线

Fig13　StandardcurveforOleanolic

・OH自由基有明显清除作用,呈剂量关系,随着三

萜化合物浓度增加,抑制率逐渐增高。

　　标准曲线,其回归方程为y=0.0038x+0.004,2

r=0.9995。表明齐墩果酸在51.58～209.47μg与吸光值有较好的线性关系。3.4.2　藜蒿总三萜含量测定

精密吸取供试样品0.3mL,按标准曲线制作项显色测吸光值,最后所得值代入标准曲线线性方程,经计算藜蒿茎中总三萜含量占其干重的01192%,

图5　藜蒿三萜化合物对・OH自由基清除效果

Fig15　Scavengingcapacityoftriterpeneon・OHelimina2

tion

Vol121　　　　　　辛　欣等:藜蒿三萜分离纯化及其体外抗氧化、抗菌活性研究　

317

3.5.3　对・O自由基的清除作用试验结果

由图6可知,当藜蒿三萜化合物浓度在3mg/

∃

mL时,对・O2自由基的清除效果可达到70%,IC50约为2.5mg/mL。说明提三萜化合物能明显降低邻苯三酚自氧化的速率,呈剂量关系,随着三萜化合物浓度增加,抑制率逐渐增高。

　　从表4中可见,对DPPH自由基清除率来看,藜蒿三萜提取物浓度达到2.5时与5mg/mL的抗坏血酸的抗氧化效果相当。对・O2自由基抑制率来看,藜蒿三萜提取物在低浓度时抗氧化效果优于抗坏血酸的抗氧化效果。

需要说明的是,本实验中所用抗坏血酸为纯品,而藜蒿三萜仅为总三萜混合物,若将提取物中的抗氧化物质提纯,则添加量会进一步降低。3.6　体外抑菌试验结果

抑菌圈大小显示抗菌效果的好坏,抑菌圈直径越大,说明浸提液对此种供试菌的抑制效果越好。按方法2.5项对三萜化合物进行了抑菌测定,由表5可知随着浓度的增加三萜化合物对大肠杆菌、金

图6　藜蒿三萜化合物对・O2自由基清除效果

Fig16　Scavengingcapacityoftriterpeneon・O2elimination

黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有很好的抑制效果,

对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果要优于对枯草芽孢杆菌的抑制效果。与具有很好抑菌功效的熊果酸比较,藜蒿三萜提取物的浓度达到3mg/mL时与3mg/mL的熊果酸的对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果相当。

表5　藜蒿三萜化合物抑菌圈大小的测定结果

Table5　Resultofthesizeofrestrainfungusringofthetriter2

pene样品浓度

Sampleconcentration(mg/mL)

0.51

3.5.4对DPPH的清除作用试验结果

由图7可知,当藜蒿三萜化合物浓度在3mg/mL时,对DPPH自由基的清除效果仅达到50%以上,IC50约为3mg/mL,且浓度再增加对自由基的清除效果不明显。

被试菌种

大肠杆菌E2coli

±±

++++++-++

金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌

Staphylococcusaureas

Subtilis

±±

+++++++-++

±±

++++-++

图7　藜蒿三萜化合物对DPPH自由基清除效果

Fig17　ScavengingcapacityoftriterpeneonDPPHelimi2

nation

234

不含样品

3.5.5　与抗坏血酸的抗氧化能力的比较结果

Nosample

将藜蒿三萜化合物按不同的浓度实验,以相应浓度抗坏血酸为对照,结果见表4。

表4　藜蒿三萜化合物与Vc对自由基清除率的比较

Table4　ComparisonoftriterpeneandVctoscavengingcapacity

effect

清除率(%)

ClearancerateDPPH

119.84.3118.74.31

熊果酸Ursolic

acid(3mg/mL)

　　注:-无抑菌圈;±抑菌圈不明显;+直径7～9mm:++直径10～12mm;+++直径13mm。

Note:-Withoutbacteriostaticring;±Unconspicuousbacteriostaticring;+Diameteris729mm;++Diameteris10212mm;+++Diam2

eteris13mm

质量浓度Massconcentration(mg/mL)

1.534.15.7734.15.77

242.3-45.4-2.549.7-51.9-351.4-67.3-5-10-

4　结论

4.1　通过各种显色方法验证了藜蒿中有三萜化合

藜蒿

48.350.9--

物的存在,且通过薄层色谱和液相色谱验证了三萜化合物中有齐墩果酸的存在。

4.2　藜蒿三萜在浓度为90%的乙醇,固液比=1∶10,

・O2

藜蒿

82.185.3

温度为70℃回流提取45min的条件下提取效果最

318天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol121

佳,且乙醇的浓度为提取主要影响因素。4.3　紫外分光光度法测定藜蒿总三萜的最佳条件已通过验证,且此方法有较好稳定性和重复性。标

准曲线r=0.9995,齐墩果酸在51.58～209.47μg与吸光值有较好线性关系。用紫外分光光度法测得藜蒿茎中总三萜含量占其干重的0.192%。4.4　抗氧化试验结果表明藜蒿三萜化合物对肝匀浆脂质过氧化有良好的抑制,且效果比自由基体系明显,说明藜蒿三萜化合物可有较好的护肝作用。在抗氧化试验和抗菌试验中,通过藜蒿三萜化合物与阳性对照物的比较,开发藜蒿提取物作为天然抗氧化剂和抑菌剂具有广阔的应用前景。

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