生化试剂的基础知识

一、生化试剂的分类1

(一）按照化学性质分类1 (二)按照临床应用分类1 二、反应速度特性2

(一）终点法试剂2 （二)动力学法试剂3 三、显色原理4

(一)NAD-NADH和NADP-NADPH系统4 （二)p—NP和p-NA系统5 (三)H2O2偶联的指示系统5 (四)抗原抗体反应指示系统5 （五)其它显色反应5 四、性能评价方法5

(一）主要性能指标：5 (二）性能评价方法6 一、

生化试剂的分类

(一) 按照化学性质分类

1. 酶类：包括ALT，AST，ALP,ACP，r—GT,α-HBDH，LDH，CK,CK-MB，α—AMY,MSO,ADA,ChE

等。

2. 底物/代谢产物类：包括TG,TC,HDL—C，LDL—C,UA,UREA，Cr，Glu,TP,Alb,T—Bil，TBA，

NH4+，CO2等。

3. 无机离子类:包括Ca，P,Mg，Cl等。

4. 特种蛋白类：包括apoAl，apoB,Lp(a)，C3，C4,PFB（B因子),IgG,IgA,IgM等。 (二) 按照临床应用分类

1. 无机离子：包括Ca,P，Mg，Cl等。

2. 肝功能：包括ALT，AST，r-GT，ALP，MSO,T—Bil，D-Bil，TBA，TP，Alb等。 3. 肾功能:UA,UREA，Cr等。

4. 心肌酶谱：CK，CK-MB,LDH,α-HBDH，AST，MSO。 5. 糖尿病:GLU等.

6. 前列腺疾病：ACP，p-ACP等. 7. 胰腺炎:α—AMY。

8. 血脂：TC，TG，HDL-C，LDL-C，apoA1，apoB，Lp（a)。 9. 痛风:UA。

10. 有机磷中毒：ChE。

11. 免疫性疾病:C3,C4，PFB(B因子)，IgG，IgA，IgM，Kappa链,Lambda链。 二、

反应速度特性

按照反应速度，可以分为终点法试剂和动力学试剂。而动力学试剂又可再分为零级动力学法和一级动力学法。 (一) 终点法试剂

终点法，指经过一段时间（一般为几分钟)的反应，反应进行到完全，使全部底物(被测物)转变成产物，称终点法，更确切地说应称平衡法，这是最理想的分析类型。如图(1）.

整个反应达到平衡，由于正向反应的平衡常数很大，可认为所有的被测定物已转变为产物，反应液的吸光度不再增加（或降低),吸光度的增加（或降低）程度与被测定物的浓度成正比。

终点法对反应条件（如酶量、pH、温度）小的改变不敏感,只要这种改变不影响在一定时间内反应达到平衡即可,是最理想的反应模型。

At1t2图（1）

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属于终点法的试剂主要有:

TG，TC,HDL-C，LDL—C，UA，Glu，TP,Alb,T—Bil,D—Bil，Cr（氧化酶法），NH4+,CO2 ， Ca，P，Mg，Cl ， apoA1，apoB，Lp(a),C3，C4，PFB（B因子)，IgG，IgA，IgM等。 (二) 动力学法试剂 1. 零级动力学法

零级动力学法，指反应过程中反应速度维持不变,达到最大，与底物浓度无关,因此,在整个反应过程中，反应物可以匀速地生成某个产物，导致被测定溶液在某一波长下吸光度均匀地减小或增加，减小或增加的速度（△A/min）与被测物的活性或浓度成正比，主要用于酶活性的测定。如图（2).

实际上，由于底物浓度不可能足够大，随着反应的进行，底物消耗到一定程度后，反应速度不再维持不变，同样从启动反应到达到最大速度需要一定时间.因此，零级动力学法是针对特定时间而言的，各试剂商对这段时间有严格规定。

At1t2t3图（2）

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属于零级动力学法的试剂主要有：

ALT，AST,ALP,ACP，r—GT，α-HBDH,LDH，CK,CK—MB，α—AMY，MSO，ADA，ChE，TBA等。

2. 一级动力学法

在一定的反应时间内，反应速度与底物浓度的一次方成正比,由于底物在不断的消耗，因此整个反应的速度在不断的减少，表现为吸光度的增加(或降低)速度越来越小，这类反应达到平衡的时间很长，理论上可以在任意时间段进行监测,但由于血清成份复杂,反应刚启动

时反应较复杂，杂反应较多，经过一段延迟时间才能进入稳定反应期,必需在特定时间段内进行监测，各试剂商对这段时间有严格规定.如图（3）。

在一固定时间间隔中，底物浓度的变化量正比于底物的初浓度，这是一级反应的同性。该段时间内吸光度的增加或降低与被测物的浓度成正比。

At1t2t3图（3）

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属于一级动力学法的试剂主要有：

Cr(苦味酸法），UREA（紫外监测法) 三、

显色原理

显色系统主要有以下几种：

➢ NAD—NADH和NADP-NADPH系统 ➢ p-NP和p-NA系统 ➢ H2O2偶联的指示系统 ➢ 抗原抗体反应指示系统 ➢ 其它显色反应

(一) NAD-NADH和NADP—NADPH系统

NADH和NADPH在340nm有特征性吸收峰，而NAD和NADP在340nm无特征性吸收峰，利用其偶联的脱氢酶（工具酶)反应，根据340nm吸光度的变化,可以测定物质的浓度或活性.

作为该指示系统常用的工具酶有LDH、MDH、GLDH和G6PDH

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有：ALT、AST、CK、LDH、CK-MB、α—HBDH 、Glu、UREA、NH4+ 、CO2等.

(二) p—NP和p—NA系统

p—NP和p—NA在405nm有特征性吸收峰,根据405nm吸光度的变化,可以测定物质的浓度或活性。

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有ALP、ACP、r—GT、AMY等。

(三) H2O2偶联的指示系统

H2O2在过氧化物酶的作用下，可使单一个或成对的无色的色素原氧化成有色的色素,导致某一波长吸光度的增加,因此可用来测定物质的浓度或活性

用于此指示系统的单一色素原有TMB、ABTS等；成对色素原有酚和4AA、MBTH和DMA等。

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有TC、TG、HDL—C、LDL-C、Glu、Cr、UA等。

(四) 抗原抗体反应指示系统

特异性抗体与抗原(待测物质)在相应的缓冲环境下反应生成抗原抗体复合物，形成一定的浊度，导致特定波长透光率的改变。在抗体过剩的前提下,改变程度与抗原浓度成正比。

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有apoAI、apoB、Lp（a)、IgG、IgA、IgM、C3、C4、CRP等. (五) 其它显色反应

蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子作用产生紫红色络合物,在一定浓度范围内颜色反应强度与蛋白质的浓度成正比。用于TP的测定.

溴甲酚绿（BCG）在非离子去污剂Brij－35的存在下，可与白蛋白形成紧密结合的绿色复合物。用于Alb的测定。

重氮苯磺酸盐与胆红素生成红紫色偶氮胆红素。用于总胆红素和直接胆红素的测定。 甲基麝香草酚兰（MTB)在碱性条件下可与Ca、Mg形成有色络合物。用于Ca、Mg的测定. 四、

性能评价方法

(一) 主要性能指标:

1. 稳定性:指在规定条件下经过一段时间的保存，仍能达到相应的性能指标，如试剂空白

吸光度、线性范围、灵敏度等。

2. 反应灵敏度：指单位浓度（或活性）的测定物反应所产生的反应度,反应度越高,灵敏度

越大。

3. 精密度：结果间相互符合的一致程度 4. 准确度：与参考测定程序结果的一致性

5. 线性范围：在规定的重复性和线性偏差下，测得的浓度或活性值与设定的浓度或活性值

之间的比例关系的范围。

6. 基质效应:基质指的是样品中被分析物以外的组分。基质常常对分析物的分析过程有显

著的干扰，并影响分析结果的准确性。例如,溶液的离子强度会对分析物活度系数有影响，这些影响和干扰被称为基质效应（matrix effect）。 7. 抗干扰性:

8. 其它：试剂/样本比例、反应时间、价格等. (二) 性能评价方法

1. 稳定性：连续观测，每日试验;热加速试验.

2. 反应灵敏度：直接计算单位浓度反应物的吸光度变化或变化率. 3. 精密度：按照NCCLS EP5-A进行。 4. 准确度：按照NCCLS EP9—A2 进行. 5. 线性范围：按照NCCLS EP6-A 进行. 6. 基质效应:通过回收试验确定 7. 抗干扰性:按照NCCLS EP7—A进行。