第２期 倪启亮等： 木质素降解酶的酶活测定方法探讨 ５５ ２木质素降解酶的酶活测定方法 ２．１木素过氧化物酶的测定 ２．１．１ 以藜芦醇为底物测ＬｉＰ活力的方法［ ］多种含苯丙烷的化合物和含苯甘油一８一苯醚键的木素模 型化合物都曾用作测试ＬｉＰ活力的底物，其中应用最广的是藜芦醇（Ｖｅｒａｔｒｙ｜ａｌｃｏｈｏｌ，ＶＡ），它是白腐菌的 一种次生代谢产物，被认为可诱导ＬｉＰ的合成，在３１０ｎｍ处无光吸收，而当Ｈ２Ｏ２存在时，ＶＡ可被ＬｉＰ氧 化为藜芦醛（Ｖｅｒａｔｒａｌｄｅｈｙｄｅ），此时在３１０ｎｍ处则有强烈光吸收（Ｅ＝９．３×１０ ｍｏ１．ｃｍ ），因此一般用其 光密度增加速率：ＡＯＤ／ｍｉｎ来表示ＬｉＰ活力。在同类化合物中ＬｉＰ对ＶＡ有较小的Ｋ 和较高的Ｖｎ ， 反应条件通常为２ｍｍｏｌＶＡ（Ｋ ＝６０￣ｍｏ１），０．４ｍｍｏｌ Ｉ－Ｉ２Ｏ２（Ｋ＝８０，ｕｍｏ１）和５０ｒｅｔｏｏｌ ｐＨ２．５的酒石酸钠缓冲 溶液，３０℃，以每分钟形成１／￣ｍｏｌ藜芦醛为１个酶活力单位 ７ｌ。 应当注意的是ＬｉＰ的最适ｐＨｉ２，但ｐＨ＜２．５时酶容易失活，所以采用ｐＨ ２．５的缓冲液，此时反应速 率的线性区约在２分钟内。酶的加入量应足够使ＯＤ值每分钟增加０．２左右，反应温度亦应稳定。为确 保反应正常进行，ＶＡ还应经真空蒸馏以除去可使反应发生延迟的还原性杂质。 这个测试方法作为ＬｉＰ活力测定的标准方法被广泛应用，但也有如下缺点 ．８］：（１）ＶＡ在氧化过程 中，含二甲氧苯基的中间产物和终产物藜芦醛会被很多真菌和基质成分所还原；（２）真菌代谢中形成的很 多酚类、芳香类化合物在３１０ｎｍ也有光吸收，完全排除此项干扰比较难；（３）３１０ｎｍ时光散射作用很强，因 此，反应液的浊度对结果影响较大，在可见光区域测试则可减少此干扰；（４）某些白腐菌可产生不属于过氧 化物酶的ＶＡ氧化酶（ｆｌａｖｉｎ．ｃｏｆａｃｔｏｒｅｄ ＶＡ ｏｘｉｄａｓｅｓ，ＶＡＯ），ＶＡＯ也可氧化ＶＡ为藜芦醛。 ２．１．２以天青（Ａｚｕｒｅ）染料为底物测ＬｉＰ活力的方法 Ｊ １９９２年Ａｒｃｈｉｂａｌｄ提出以ＬｉＰ在Ｈ２Ｏ２存在下氧 化Ａｚｕｒｅ类染料来表示ＬｉＰ活力的方法 。。。Ａｚｕｒｅ是纺织工业中常用染料，有Ａ、Ｂ、Ｃ等不同型号，其 入一略有差别。ＬｉＰ活力测定中选用的是Ａｚｕｒｅ Ｂ，反应条件为３２￣ｍｏｌ／Ｌ Ａｚｕｒｅ Ｂ，１００￣ｍｏｌ／Ｌ １４２０２， ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ４．５的酒石酸钠缓冲液，在６５１ｎｍ处测ＯＤ值减小速率。１个酶活力单位用每分钟每毫升培 养基滤液降低０．１个ＯＤ值来表示。其线性反应时间可延长至２０ｍｉｎ。 此法较ＶＡ氧化法有下述优点：（１）由于不是在紫外区测试，可避开芳香化合物的干扰，灵敏度提高。 可以测出更低量的ＬｉＰ；（２）Ａｚｕｒｅ Ｂ性质稳定，在生物反应条件下不易被脱色；（３）Ａｚｕｒｅ Ｂ不容易被ＶＡ氧 化反应的干扰酶类如ＶＡＯ所氧化，与漆酶（Ｌａｃｃａｓｅ）和锰过氧化物酶（ＭｎＰ）也不发生反应，选择性强。 ２．２锰过氧化物酶活力的测定 ２．２．１ 以酚红染料为底物测ＭｎＰ活力的方法【¨ｊ １９８４年桑原等发现锰过氧化物酶后，大量的研究结果 表明，该酶能氧化木质素模型物、木质素和一系列染料。目前，测定该酶活力主要用酚红法：反应混合液含 ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｎ￣）４，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＨｚＯ２，０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ酚红和２０ｍｍｏｌ／Ｌ乳酸缓冲液，ｐＨ４．５。在３０℃下反 应一定时间，立即用碱终止反应，测定６２４ｎｍ处的吸光度。 这个方法也有如下缺点：（１）酚红是一种染料，与木质素的关联性较小；（２）酚红法测定定酶活力时，底 物的反应程度需加碱中止反应后才能进行测定，不能连续观察反应过程，因此得到的酶活力数据就不够精 确。 ２．２．２二价锰氧化的分光光度法ｕ Ｊ 很多有机化合物特别是氧化还原型染料常被用作测定ＭｎＰ活力 的底物，但这些方法比较间接，产生误差的因素较多，而Ｍｎ 是ＭｎＰ作用的直接产物，在２３８ｎｍ处测 Ｍｎ＂的光吸收值是测定ＭｎＰ活力的一个较为灵敏简便的方法，此法还可用于连续测定。反应条件为 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ的乳酸钠缓冲液（ｐＨ４．５）３．４ｍｌ，１．６ｍｍｏｌ／Ｌ的ＭｎＳＯ４溶液０．１ｍｌ，培养基滤出液０．４ｍｌ，预热 至３ ７Ｃ后，加入１．６ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｈ２Ｏ２溶液０．１ｍｌ启动反应，测反应最初３分钟内入＝２４０ｎｍ处吸光度的变 化，１个酶活力单位用每分钟每毫升培养基滤液增加０．１个ＯＤ值来表示。 此外，二价锰氧化的分光光度法，虽然也是连续记录氧化Ｍｎ １１成Ｍｎ １１１的吸收光谱变化，从而得到酶 维普资讯 http://www.cqvip.com ５６ 广西农学报 ２００８矩 的活力，但一些研究者报导ＭｎｌｌＩ的稳定性不好［１２，１３］，通过测定ＭｎｌｌＩ的吸光度变化，来确定酶活力，精确 性不好。 ２．２。３以愈创木酚为底物测ＭｎＰ活力的方法【¨Ｊ 以愈创木酚为底物，在锰过氧化物酶和Ｍｎ２ 作用下， 愈创木酚被氧化成四邻甲氧基连酚，在４６５ｎｍ处可以测定有色产物四邻甲氧基连酚的形成。反应条件 为：琥珀酸钠缓冲液或乳酸钠缓冲液，ｐＨ４．０－－４。５，０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＳＯ４，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈ２０２，０．４ｍｍｏｌ／Ｌ 愈创木酚，测定波长为４６５ｎｍ。 愈创木酚是一种木质素模型化合物，因此，在研究木质素生物降解中，本方法比酚红法更具实用性。 ２．３漆酶活力的测定 Ｌａｃ的催化作用与ＬｉＰ和ＭｎＰ不同，它不需要Ｈ２ｏ２因此活力测定比较容易，对苯二胺（Ｘ，￣，４９５）、愈 创木酚（ｋｍ．ｘ４８５）、邻苯二酚（￣ｘ４００）和漆酚（￣ｘ４２０）都曾用作漆酶活力测定的底物。一些底物由于自 身的原因限制了与之相关检测方法的广泛使用。如，愈创木酚反应对木质氧化酶专一性不强：联苯胺有一 定的致癌作用；ａ一蔡酚对皮肤有刺激作用并对环境不友好。 用分光光度计测定漆酶活性：由于不同来源（植物、细菌、昆虫、真菌）的漆酶与底物反应的亲和力是不 一样的，即使是同一来源的漆酶，反应的底物不同，反应的亲和力也不同；酶活测定方法中所用的反应底 物、反应条件以及酶活单位的定义对漆酶酶活的测定结果也有很大的影响。 以ＡＢＴＳ为底物测定漆酶酶活是目前国外最为常见的方法之一。反应条件为：０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＢＴＳ的 ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸钠缓冲液（ｐＨ５．０）２ｍｌ，加入ｌｍｌ酶液后启动反应，测 ＝４２０ｎｍ处吸光度变化，ＡＢＴＳ氧 化产物在４２０ｎｍ处的￡＝３６０００ｄｍ３Ｍ＿。／ｃｍ，１个酶活力单位用每分钟ｌｐｍｏｌ的ＡＢＴＳ被转化所需的酶 量。它有如下优点：（１）ＡＢＴＳ易溶于水，在室温下放置６个月仍较稳定；（２）其反应只有一步，即从ＡＢＴＳ 到它的阳离子自由基。ＡＢＴＳ的阳离子自由基在水溶液中呈浅蓝绿色，且比较稳定，通常在几个小时或几 天之内是稳定的；（３）在漆酶的作用下，ＡＢＴＳ有色溶液的摩尔吸光系数较高，说明以其为底物测定的灵敏 度较高。（４）到目前为止，还未有报道称ＡＢＴＳ有致癌作用、诱变作用或是强烈的毒性［１５，１６Ｊ。 以ＡＢＴＳ为底物进行漆酶的定量分析，通常在４２０ｎｍ下测定３ｍｉｎ内吸光度的变化。用这种底物进 行定量分析有一个缺点，即ＡＢＴＳ阳离子自由基溶液的吸光度受溶液中未反应的ＡＢＴＳ浓度的影响。这 就产生了一个问题：４２０ｎｍ下的摩尔吸光系数３６０００ｄｍ３ＭＩ１／ｃｍ是在纯ＡＢＴＳ阳离子自由基的条件下求 得的，而在实际测定反应中，ＡＴＢＳ是过量的，这就导致人们低估了酶活。这种影响不能忽视，因为反应终 止时，溶液中至少还要有ｌｍｍｏｌ／Ｌ的ＡＢＴＳ。尽管用ＡＢＴＳ为底物存在上述问题，但是它仍是漆酶酶活测 定的最佳底物之一Ｌ１ 。 ３结束语 木质素的生物降解在许多应用领域有着广阔的前景，但由于一些基础研究如木质素的空间结构、每种 木质素酶的作用机理以及木质素酶基因结构及其表达调控等尚未完全研究清楚，所以，离实际应用还有一 段距离。正因如此，木质素的生物降解也一直是世界性研究热点和难题。相信在不久的将来，随着蛋白质 分离、纯化、空间构象测定技术的发展，随着对木质素酶催化机理认识的加深，以及应用分子生物学技术对 木质素降解酶相关基因结构、表达调控机理等深入研究，这些问题将会逐一解决。 参考文献： ［１］ 冀珍芳，石淑兰．木质素的微生物降解［Ｊ］．广西轻工业，２００２，１５（１）：４～５ ［２］邬义明．植物纤维化学（第二版）［Ｍ］．中国轻工业出版社，１９９５：６－－１０ ［３］ 陶用珍，管映亭．木质素的化学结构及其应用［Ｊ］．纤维素科学与技术，２００３，１１（１）：４２－－５５ ［４］ 陈立祥，章怀云．木质素生物降解及其应用研究进展［Ｊ］．中南林学院学报，２００３，２３（１）：７９－－８５ ［５］李慧蓉．白腐真菌在碳素循环中的地位和作用［Ｊ］．微生物学通报，１９９６，２３（２）：ｌ０５～１０９ 维普资讯 http://www.cqvip.com 第２期 倪启亮等： 木质素降解酶的酶活测定方法探讨 ５７ ［６］ Ｋｉｒｋ，Ｔ．Ｋ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅ．，Ｃｏｎｍｎｏｒｓ，Ｗ．Ｊ．，Ｌｏｒｅｎｚ，Ｌ．Ｆ．，Ｚｅｉｋｕｓ，Ｊ．Ｇ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｕｌｕｔｒｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｎ ｌｉｇｎｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｂｙ Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ［Ｊ］．Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９７８，１１７：２７７～２８５ ［７］ Ｔｉｅｎ Ｍ，Ｋｉｒｋ Ｔ Ｋ．Ｌｉｇｎｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ Ｐ．ｃｈｒｙｓｓｏｐｏｒｉｕｒｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ｓｃｉ，１９８４，８１：２２８０￣２２８４ ［８］ Ｓｈｉｍａｄａ Ｍ，Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｔ．Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇｎｉｎ［Ｊ］．Ｗｏｏｄ ｎａｄ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，１９９０：５５７－－６１９ ［９］ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｓ．Ａｒｃｈｉｂａｌｄ．Ａ Ｎｅｗ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｌｉｇｎｉｎ—ｔｙｐｅ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｄｙｅ Ａｚｕｒｅ Ｂ［Ｊ］．Ａｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９２，５８（９）：３１１０－－３１１６ ［１０］ Ｍｉｎｇ Ｔｉｅｎ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｌｉｇｎｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｈａｎｅｔｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｓｏｐｏｒｉｕｍ ｎａｄ ｔｈｅｉｒ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＣＲＣ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅ— ｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７，１５（２）：１４１～１６８ ［儿］ Ｋｕｗａｈａｒａ，Ｍ．，Ｇｌｅｎｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｍ．Ａ．，Ｇｏｌｄ，Ｍ．Ｈ．．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｈ２０２一 ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｅｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ［Ｍ］．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９８４：１６９，２４７－－２５０ ［１２］ Ｇｌｎｅｎ．Ｊ．Ｋ．，Ａｋｉｌｅｓｗａｒａｎ，Ｌ．，Ｇｏｌｄ，Ｍ．Ｈ．．ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｓ ｔｈｅｐｆｉｎｃｉｐａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｌｕａｒ Ｍｎ—ｐｅｍｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｓｏｐｏｒｉｕｒｎ［Ｊ］．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｉｏｐｈｙｓ．．１９８６，２５１：６８８－－６９６ ［１３］ Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ，Ｉ．Ｔ．，Ｇ ｒａｂｓｋｉ，Ａ．Ｃ．，Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｒ．Ｒ．，Ｌｅａｔｈａｍ，Ｇ．Ｆ．．Ｐｕｒｉｆｉａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｘｔｒａ－ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｎ （ＩＩ）一ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅｌｉｇｎｉｎ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ［ｘ￣ｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ，Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ［Ｊ］．Ｂｉｏｅｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ．，１９８８，１５７：９９２～９９９ ［１４］ 周金燕，张发群．愈创木酚法测定锰过氧化物酶活力［Ｊ］．纤维素科学与技术，１９９３，１（１）：３４－－３７ ［１５］ ＣＨＩＬＤＳ Ｒ Ｅ，ＢＡＲＩ￣ＬＥＹ Ｗ Ｇ．Ｔｈｅ ｓｔｅａｄｙ－ｓｔａｔｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｐｅｍｘｉｄａｓｅ ｗｉｔｈ ２，２’ａｚｉｎｏｄｉ一（３－ｅｔｈｙｌ—ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６一ｓｕｌ— ｐｂｏｎｉａｃｄｄ）ａｓｃｈｒｏｍｏｇｅｎ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＪ，１９７５，１４５：９３～１０３ ［１６］ 丁少军，宋美静．云芝漆酶的培养和分离纯化的研究［Ｊ］．纤维素科学与技术，１９９８，（３）：１６－－２０ ［１７］ 吴坤等．杂色云芝漆酶的分离、纯化和酶学特性研究［Ｊ］．高校化学工程学报，２００３，２（１７）：１７３－－１７９ （上接第５３页） ２．４化学防治 目前温室白粉虱的防治还是以化学防治为主，但要注意早期防治，以成虫防治为主，将其消灭于产卵 初期。当植株上明显见到成虫时开始用药，７～１０ｄ喷一次，连续２～３次，即可得到控制。防治效果较好 的药剂有：１．８％阿维菌素１５００￣２０００倍、５％锐劲特１０００～１５００倍液、２５％噻嗪酮（扑虱灵）可湿性粉剂 １０００ １５００倍、１０％大功臣可湿性粉剂１５００倍、灭扫乳油１５００－－２０００倍喷雾等。上述农药实行轮换交替 使用，既可提高防治效果，又可以避免温室白粉虱的抗药性。 ３小结 由于温室白粉虱世代重叠，在同一作物上存在着各种虫态，加上温室白粉虱繁殖迅速和传播快，在南 宁市为害不仅局限在农膜温室大棚，在露地为害也逐年加重，为了提高总体防治效果，最好的方法是在同 一个范围内，所有地块不管什么作物，都统一采用综合农业、物理、生物、化学 防治技术联防联治，确保 各种叶菜瓜果能正常生长，达到高产优质。 文献： 石勇强，等．国内温室白粉虱的生活习性与防治研究综述［Ｊ］．陕西农业科学，２００２，９：１９ 权桂芝．白粉虱的发生规律及综合防治［Ｊ］．天津农业科学，２０００，６（１２）：１５－－１６ 朱国仁．主要病虫害防治技术与研究进展［Ｍ］．北京：中国农业科技出版社，１９９２：４３－－４５ 车华．几种杀虫剂防治白粉虱的药剂试验［Ｊ］．农药，１９９８，３７（１１）：３０－－３１
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