马铃薯茎尖脱毒效果影响因素的研究

维普资讯 http://www.cqvip.com 马铃薯茎尖脱毒效果影响因素的研究——李风云　中图分类号：￥５３２　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７２—３６３５（２００８）０４—０２０１—０４　马铃薯茎尖脱毒效果影响因素的研究　李凤云　（黑龙江省农业科学研究院马铃薯研究所，黑龙江克山１６１６０６）　摘要：以克新２号、克新ｌ６号和克新１７号等８个马铃薯品种为试验材料，对马铃薯茎尖脱毒效果的影响　因素进行了研究。结果表明：不同种类的植物生长调节剂对茎尖的生长有不同的影响，茎尖在（　号培养基（Ｍｓ＋　１．０　ｍｇ・Ｌ－１　ＫＴ＋Ｏ．５　ｍｇ・Ｌ－１　ＩＡＡ＋０．５　ｍｇ・Ｌ～ＧＡ　）上可不产生愈伤组织，直接成苗，是最适宜的培养基；６￣８℃低温预　处理和３７￣Ｃ热空气处理对茎尖脱毒有利；茎尖取材来源对成苗率没有影响，对脱毒效果影响较大，但脱毒效果依　品种而异；为避免造成损失，需在１５个月内准备出用于更换的基础苗。　关键词：马铃薯；茎尖培养；影响因素　我国马铃薯的栽培面积达４９０多万ｈｍ　，已成　１．２试验方法　为世界上第一大马铃薯生产国，但由于病毒和类病　毒侵染引起的退化，严重影响了马铃薯的品质和　产量。应用茎尖脱毒技术是解决马铃薯退化的主　将马铃薯大田健株的腋芽或块茎芽，用自来水　冲洗干净，约需３０　ｍｉｎ左右，在酒精中蘸一下，　立即取出，用千分之一的升汞消毒３　ｍｉｎ左右，无　菌水冲洗３—４遍，在超净工作台内，在４０ｘ解剖镜　下剥取茎尖，接种在试管内的茎尖培养基上，每管　接１个茎尖，放于人工气候箱中培养，２３℃，光强　２　５００　ｌｘ，每天１６　ｈ，相对湿度６０％，直至成苗。　１．３试验设计　要措施，国内外学者已对其进行了大量的研究和　报道。　我国从２０世纪７０年代初开始研究推广这一技　术，并在生产上取得了巨大的经济效益，但目前马　铃薯茎尖培养仍存在着脱毒效率低的问题，有些好　的育种亲本材料因严重退化而不能利用，且随着国　外材料的引进，可能带人新病毒。连勇［１１报道长期　１．３．１植物生长调节剂对茎尖脱毒效果的影响　继代培养的试管苗有可能再次染上病毒，给种薯生　产带来巨大损失。因此，本试验研究了不同植物生　长调节剂、温度处理、脱毒继代时间及试种等因素　对脱毒效果的影响，目的在于优化这一重要技术。　各处理培养基成分列于表１。剥取带二个叶原　基的茎尖，长度０．３０　ｍｍ，接种在试管内的各处理　的茎尖培养基上，培养基中还需加入３０　ｇ・Ｌ『　蔗糖　和Ｏ．７％琼脂，ｐＨ值５．８。　表ｌ添加不同植物生长调节剂的茎尖培养基　处理　培养基成分　１　材料与方法　１．１供试材料　①　②　③　④　⑤　ＭＳ＋１．０　ｍｇ－　６－ＢＡ＋Ｏ．１　ｍｇ・Ｌ－　ＩＡＡ　ＭＳ＋１．０　ｍｇ・Ｌ『　６－ＢＡ＋Ｏ．１　ｍｇ・Ｌ－’ＮＡＡ　ＭＳ＋０．５　ｍｇ・Ｌ『　６－ＢＡ＋Ｏ．１　ｍｇ・Ｌ－　ＮＡＡ＋０．１　ｍｇ・Ｌ『　ＧＡ３　ＭＳ＋０．５　ｍｇ・　’ＫＴ＋１．０　ｍｇ・　ＩＡＡ　ＭＳ＋１．０　ｍｇ・Ｌ『‘ＫＴ＋０．５　ｍｇ・　ＩＡＡ＋０．５　ｎａｇ・Ｉ『　ＧＡ３　供试马铃薯材料共有８份，有克新２号、克新　１５号、克新１６号、克新１７号、克新ｌ９号、克新　２０号、早大白和扎列娃。　收稿日期：２ｏ０８一Ｏ５一Ｏ５　１．３．２温度处理对茎尖脱毒效果的影响　将马铃薯的块茎在６～８℃低温下预处理５个　月，剥取带一个叶原基，长度０．１５　ｍｍ的茎尖后，　基金项目：黑龙江省农业科学院科研计划项目“多抗高产专用　马铃薯种质资源创新技术研究与应用”（ＨＮＹ２００４１１３）。　作者简介：李风云（１９７２一），女，助理研究员，从事马铃薯试　管苗脱毒快繁、马铃薯品质分析和马铃薯生物技术研究。　接种于⑤号茎尖培养基上，用３７￣Ｃ热空气处理，　维普资讯 http://www.cqvip.com 中国马铃薯，第２２卷，第４期，２００８　直到成苗。　１．３＿３茎尖取材来源对茎尖脱毒效果的影响　分别取马铃薯大田健株的腋芽和块茎芽作为　试验材料，剥取带一个叶原基，长度０．１５　ｍｍ的　最高，但处理①～③均有愈伤组织形成，芽细根　多，需进行壮苗培养，处理④和⑤茎尖成苗率低　些，均无愈伤组织形成，小苗前期无根，待长出几　个叶片后才有根生成，苗壮，可直接切段繁殖，效　率高。处理⑤无愈伤组织形成可能不会产生遗传变　异，且成苗率较高，因此是最适宜的茎尖培养基。　从表中也可以看出，ＧＡ，对茎尖培养有促进作用。　表２不同培养基对茎尖脱毒效果的影响　处理　茎尖生长状态　成苗率　（％）　茎尖后，接种于⑤号茎尖培养基上，直到成苗。　１．３．４脱毒苗培养１８个月对脱毒效果的影响　每３个月对继代的脱毒苗检测１次，病毒检测　采用酶联血清检测，配合指示植物鉴定，检￣ｔＪＰＶＸ、　ＰＶＹ、ＰＶＳ、ＰＶＭ、ＰＶＡ、ＰＬＲＶ，类病毒检测采用　双向往返聚丙烯酰胺凝胶电泳法，共检测６次。　１．３．５脱毒苗试种对脱毒效果的影响　将脱毒苗在网棚和大地试种，调查种植年限对　脱毒率的影响，同时观察是否有变异株系。　１．４数据统计和分析　①形成黄绿色愈伤组织，芽细　②形成绿色愈伤组织，芽细，根多　４５．２　６０．８　③形成大块绿色愈伤组织，丛生芽，芽细，根多‘　⑤同④，效果好些，成苗快些　７８．１　６７．２　④无愈伤组织，成１株壮苗，前期无根，茎叶向上生长４６．５　统计成苗茎尖数，计算茎尖成苗率（成苗茎尖　与接种茎尖之比）。将试管苗切繁，检测病毒和类　病毒，统计脱毒茎尖数，计算脱毒率（脱毒茎尖与　接种茎尖之比）。　２．２温度处理对茎尖脱毒效果的影响　本试验以克新ｌ７号马铃薯品种的块茎芽为试　２结果与分析　２．１植物生长调节剂对茎尖脱毒效果的影响　植物生长调节剂的作用是促进茎尖分生组织　分化成苗。以克新１６号马铃薯品种的块茎芽为试　验材料，结果见表２。处理①成苗率最低，可能是　验材料，尝试温度处理对茎尖脱毒效果的影响，　６～８ｃＩ＝低温处理是为了脱除类病毒，高温３７℃热空　气处理是为了脱除ＰＶＸ、ＰＶＳ等难脱的病毒。结　果见表３：与ＣＫ比较，温度处理不影响成苗率，　提高了脱毒率，对脱除ＰＳＴＶ的效果显著，而对脱　除ＰＶＹ效果不太好，这可能与块茎中所含病毒的　种类有关，尚需研究。　植物生长调节剂的种类搭配不当，处理③成苗率　表３温度处理对茎尖脱毒效果的影响　２．３茎尖取材来源对脱毒效果的影响　以克新２号、克新ｌ６号和克新１９号的块茎芽　１９号则相反，大地健株的腋芽的脱毒效果好于块　茎芽，原因尚待研究。　表４茎尖取材来源对脱毒效果的影响　和大地健株的腋芽为试验材料，结果见表４。同一　品种茎尖成苗率的差异不明显，茎尖脱毒率差异较　大，但不同品种脱毒效果不一样。有人认为田问植　株上的芽污染重，不易消毒，在本试验中无此现　象，用千分之一的升汞消毒效果很好，且不同品种　消毒时间应不同，克新ｌ６号的芽消毒时间稍长，　茎尖即变黑死亡。但经试种观察，克新２号有植株　健壮而薯形不太好的现象，克新１６号从块茎芽成　的苗脱毒效果好于大地健株的腋芽的现象，而克新　２．４脱毒苗培养ｌ８个月对脱毒效果的影响　以克新２号、克新１７号、克新１９号和克新　维普资讯 http://www.cqvip.com 马铃薯茎尖脱毒效果影响因素的研究——李风云　ｌ５号的脱毒苗为研究对象，结果见表５。　表５脱毒苗培养１８个月对脱毒效果的影响　ｌ５个月内的检测工作，保证扩繁基础苗的质量，　否则会造成巨大损失。　２．４脱毒苗试种对脱毒效果的影响　以克新１６号、克新１７号、克新１９号、克新　２０号、早大白、克新１５号和扎列娃的脱毒苗为试　材，研究脱毒苗试种对脱毒效果的影响，结果见表　６。可以看出脱毒苗的退化速度不同，大田种植的　脱毒苗的退化速度快于网棚，但差异不大，对于脱　毒效果好的品种可以晚些更换基础苗。克新１７号　的脱毒效果最好，在网棚和大地都能健壮生长，使　从表中可以看出大约１年后才开始有退化现　用年限最长。而扎列娃则出现在网棚能健壮生长，　象，克新２号可能是由于脱毒不彻底造成的，而克　新１５号似乎是由于类病毒的弱系或其它病毒引起　的退化，．尚待研究。脱毒苗使用年限的长短，与病　毒有一个延迟的复苏期、脱毒不彻底、病毒浓度低　的检测不到、含有检测项目以外的病毒等因素有　关，使脱毒苗随继代时间的延长，病毒再现，苗退　在大地不能正常生长的情况，可能是该品种不抗类　病毒病，或者是病毒的交叉保护现象，脱除原有病　毒后，降低对另一种病毒的抵抗能力，以致于在大　田不能利用扎列娃这份好材料。另外，在试种时发　现克新ｌ５号有一株脱毒苗结红皮块茎，克新１５号　是最初用③号培养基脱毒成苗，是否由于变异引起　尚待研究。　化，脱毒率下降，因此，一定要做好脱毒苗培养　表６脱毒苗继代Ｉ－６年试种对脱毒效果的影响　注：“无”表示无退化，“有”表示有退化。　３讨论　本试验中处理④和⑤均无愈伤组织形成，适宜用于　马铃薯茎尖脱毒效果的影响因素主要有茎尖大　小、培养基、培养条件和病毒种类等。本研究表明　茎尖切取越小，脱毒率越高，成苗率越低，这与王　秀英等【２］和齐恩芳等『３】报道的一致，实际组培扩繁　只要有１株脱毒彻底的试管苗即可大量扩繁，说明　对于提高脱毒率的研究更重要一些。植物生长调节　茎尖分生组织培养。ＧＡ。对茎尖培养有促进作用，　这与仲乃琴问的报道一致。有人认为高浓度ＮＡＡ可　抑制病毒的增殖，但浓度过高或长期使用都有引起　芽变的可能　，本试验中的培养基均采用低浓度的　植物生长调节剂。　由于目前没有脱掉类病毒的有效措施，对于大　量扩繁的品种，只有从未被饱和侵染的群体中鉴定　剂６一ＢＡ和ＮＡＡ可产生愈伤组织，这与刘卫平等　的报道一致，绝大多数学者都反对通过愈伤组织途　径脱除马铃薯病毒，因为此途径会产生遗传变异Ｉ　５Ｉ，　筛选出未被侵染的块茎，再脱掉其它病毒嗍，而对　于只种少量用作亲本的材料来说，有时无法选出未　被侵染的块茎。本试验进行的温度处理，对茎尖脱　维普资讯 http://www.cqvip.com 中国马铃薯，第２２卷，第４期，２００８　毒效果有效，但脱除病毒难易与已报道的顺序不太　一致（按由易到难的排序为ＰＬＲＶ、ＰＶＡ、ＰＶＹ、　【参考文献】　ＰＡＭＶ、ＰＶＭ、ＰＶＸ、ＰＶＳ、ＰＳＴＶＩ９１），这可能与块　茎所含病毒的种类，以及病毒与类病毒的复合侵染　程度有关。据报道，当只有ＰＶＸ存在时，４２株有　３４株可脱去这种病毒，但当有其它病毒复合侵染　时，仅有２株是无ＰＶＸ的［７１。许多研究都表明温度　处理对脱除病毒有效　０１，Ｌｉｚａｒｒａｇｅ等…１认为低温　６～８℃，处理３个月，脱除ＰＳＴＶｄ的百分率为　５３％。本试验也表明低温预处理对脱除ＰＳＴＶｄ有　利，同时也表明切取分生组织越小，脱除ＰＳＴＶｄ的　效率越高，但为避免基因型的改变及易于再生出小　连勇．马铃薯脱毒快繁及工厂化生产技术【Ｍ】．北京：中国科学　技术　版社，２００１，２６４—２６９．　王秀英，郭尚．马铃薯茎尖培养脱毒率的影响因素试验【ＪＪ．山　西农业科学，２００７，３５（１）：３９—４１．　齐恩芳，王一航，张武，等．马铃薯茎尖脱毒培养方法优化研究　【Ｊ１．中国马铃薯，２００７，２ｌ（４）：２００—２０２．　刘卫平，李玉华，孙秀梅，等．马铃薯离体茎尖生长点对几种培　养因子的生长反应［Ｊ］．中国马铃薯，２００１，１５（２）：８１—８２．　林蓉，谢春梅，谢世清．马铃薯茎尖脱毒培养关键因子分析［Ｊ］．　中国农学通报，２００５，２ｌ（７）：３３８—３４０．　植株，以剥取带１个叶原基的茎尖为好，且这样进　行温度处理不伤害芽，可作为茎尖脱毒的辅助手　段。　仲乃琴．植物生长调节剂对不同马铃薯品种茎尖分生组织离　体培养的影响【ＪＪ＿甘肃农业大学学报，１９９９，３４（３）：２９６—２９９．　张辅达，孙宪昀．马铃薯茎尖培养脱毒研究进展【Ｊ】ｌ中国马铃　所谓的脱毒苗仅指脱除能够鉴定出的已知病毒　１　¨　２　３　４　５　６　７　或者不妨碍大田扩繁的主要病毒，或者是病毒浓度　低到现有检测手段和方法无法检测到　１，而目前在　８　薯，２００４，１８（１）：３５—３８．　９　¨　…　崔荣昌，李芝芳，李晓龙，等．马铃薯块茎类病毒的检测和防治　［Ｊ］．植物保护学报，１９９２（３）：２６３—２６９．　王炳君，刘宗樊．马铃薯茎尖脱毒与微型薯生产【Ｍ】．北京：高　马铃薯上已发现了多种病毒、类病毒以及支原体，　已报道的就有２５种之多ｌ　７ｌ，对于新病毒的研究工作　有待加强，尤其是病毒检测技术需要提高，对于亲　本材料的检测项目应增加，使材料能充分利用。　等教育出版社，１９９０：４４—６２．　李云海，何云昆，张仲凯，等．通过茎尖分生组织离体培养获得　马铃薯脱毒试管苗［ＪＪ＿西南农业学报，１９９４，７（２）：２８—３１．　Ｌｉｚａｒｒａｇｅ　Ｒ　Ｅ，Ｓａｌａｚａｒ　Ｌ　Ｆ，Ｒｏｃａ　Ｗ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ　ｓｐｉｎｄｌｅ　ｔｕｂｅｒ　ｖｉｒｏｉｄ　ｂｙ　ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｍｅｒｉｓｔｅｍ　总之，茎尖脱毒是一项长期、艰巨、工作量大　的研究工作，尚有许多方面需要研究，而各项技术　ｃｕｈｕｒｅ［ＪＪ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９８０，７０：７５４—７５５．　的完善及综合推广应用，才能更有利于马铃薯的育　种实践。　黑龙江省农业科学院马铃薯研究所．中国马铃薯栽培学［Ｍ】．　北京：中国农业出版社，１９９４：１３１－２８７．　Ｆａｃｔｏｒｓ　Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｏｔａｔｏ　Ｍｅｒｉｓｔｅｍ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｏｒ　１ｎ’●ｌｉｍｉｎａｔｉＯｎ　ｏｉ　Ｖ　・－－　…ｌｒｕｓｅｓ　●　Ｌｉ　ＦｅｌＺ￣ｌｔｌ２　（Ｐｏｔａｔｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈｅｉｈｍｇｊｉａｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｅｓｈａｎ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　１６１６０６，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｅｉｇｈｔ　ｐｏｔａｔｏ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ，ｓｕｃｈ　ａｓ　Ｋｅｘｉｎ　２，Ｋｅｘｉｎ　１　６，ａｎｄ　Ｋｅｘｉｎ　１　７，ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉ　ｎｇ　ｐｏｔａｔｏ　ｍｅｒｉｓｔｅｍ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ　ｆｏｒ　ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｈａｄ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｔｏ　ｐｌａｙ　ｉｎ　ｓｈｏｏｔ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｍｅｒｉｓｔｅｍ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ＭＳ＋Ｉ．０　ｍｇ’Ｌ～ＫＴ＋Ｏ．５　ｍｇ‘Ｌ～ＩＡＡ＋０．５　ｍｇ。Ｌ一　ＧＡｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｄｉｒｅｃｔｌｙ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｃａｌｌｕｓ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ａｎｄ　ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ　ｉｔ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｓｈｏｏｔ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｐｒｅ—ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｔ　６—８℃ａｎｄ　ｔｈｅｎ　３７ｃＩＣ　ｈｅｌｐｅｄ　ｅｌｉｍｉｎａｔｅ　ｖｉｕｓｅｓ．Ｔｈｅ　ｓｏｕｒｒｃｅ　ｏｆ　ｍｅｒｉｓｔｅｍ　ｈａｄ　ｎｏ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｎ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ．ｂｕｔ　ｉｔ　ｈａｄ　ｓｏｍｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｆｒｅｅ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｔｈｅ　ｅｆｉｃａｃｙ　ｏｆｆ　ｖｉｒｕｓ　ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ　０ｎ　ｔｈｅ　ｖａｒｉｅｔｙ　ｕｓｅｄ．Ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｒｅｅ　ｏｆｆ　ｖｉｒｕｓ　ｈａｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｒｅｐｌａｃｅｄ　ｂｙ　ｎｅｗ　ｏｎｅｓ　ｉｎ　１　５　ｍｏｎｔｈｓ．　Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：ｐｏｔａｔｏ；ｍｅｒｉｓｔｅｍ　ｃｕｌｔｕｒｅ；ｆａｃｔｏｒｓ