免疫磁珠两步法体外分离纯化小鼠脾脏CD4 +CD25 +调节性T细胞的应用研究

第２卷第６期　２０ｌ１年１１月　器官移植　Ｏｒｇａｎ　Ｔｒａｎｓｐｌｎｔａｔａｉｏｎ　Ｖｏ１．２　Ｎｏ．６　Ｎｏｖ．２０ｌ１　免疫磁珠两步法体外分离纯化小鼠脾脏　ＣＤ４＋ＣＤ２５＋调节性Ｔ细胞的应用研究　黄克力　朱平　卢聪　朱小兰　麦明杰　沈二霞　吴若彬　刘怀普黄晶晶　王巍谢波　【摘要】　目的研究免疫磁珠两步法体外分离纯化小鼠脾脏ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞（ｒｅｇｕ．　１ａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ，Ｔｒｅｇ）的效果。方法将Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ－２ｂ）小鼠脾脏剪碎、过滤、去除红细胞后离心洗　涤，获得小鼠脾细胞悬液。用Ｆｉｃｏｌｌ法分离获得单个核细胞后，通过免疫磁珠阴性加阳性选择两步法　分离获得ＣＩＭ　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ和ＣＤ４　ＣＤ２５一Ｔｒｅｇ。用流式细胞仪检测所获得ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的纯度，　并比较纯化分离前后脾脏ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的比例，用台盼蓝染色后计算ＣＩＭ　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的细胞存活　率，并对分离后的细胞表型进行鉴定。结果　免疫磁珠阴性加阳性选择两步法纯化分离后ＣＩＭ　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的纯度为（８８．７±２．９）％，分离前ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的平均比例为１１．６％，纯化分离后　ＣＩＭ　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的平均比例为９３．７％。细胞存活率为（９３．７±４．１）％。与ＣＤ４　ＣＤ２５一Ｔｒｅｇ相比，　ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的ＣＤ４４表达略有增加（Ｐ＞０．０５），ＣＤ４５ＲＢ的表达明显下降（Ｐ＜０．０５），ＣＴＬＡ一４　和Ｆｏｘｐ３的表达明显增加（均为Ｐ＜０．０５）。结论使用免疫磁珠两步法分离纯化，能避免激惹ＣＩＭ　分子，可获得高纯度且具有天然ＣＩＭ　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ表型的细胞。　【关键词】　免疫磁珠两步法；ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞；流式细胞术；小鼠　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　ｔｗｏ—ｓｔｅｐ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ　ｏｎ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ４　ＣＤ２５　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｍｉｃｅ　ｓｐｌｅｅｎ　ＨＵＡＮＧ　Ｋｅ—ｌｉ　，ＺＨＵ　Ｐ　，ＬＵ　ｃｏｎｇ，ＺＨＵ　Ｘｉａｏ—ｌａｎ，　ＭＡＩ　Ｍｉｎｇ－ｊｉｅ，ＳＨＥＮ　Ｅｒ－ｘｉａ，　Ｒｕｏ—ｂｉｎ，ＬＩＵ　Ｈｕａｉ－ｐｕ，ＨＵＡＮＧ　Ｊｉｎｇ－ｊｉｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｗｅｉ，ＸＩＥ　Ｂｏ．　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＭｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１００８０，Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＺＨＵ　ＪＰ　，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｕｐｉｎｇｚｇｇｄ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅｓ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｗｏ—ｓｔｅｐ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ　ｏｎ　ｉｓｏｌａ・　ｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ　ＣＩＭ　ＣＤ２５　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ（Ｔｒｅｇ）ｏｆ　ｍｉｃｅ　ｓｐｌｅｅｎ．Ｍｅｈｏｔｄｓ　Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ一２ｂ）ｍｉｃｅ　ｗａｓ　ｇａｔｈｅｒｅｄ　ｂｙ　ｃｅｎｔｉｒｆｕｇｅ　ｗａｓｈｉｎｇ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｓｐｌｅｅｎ　ｗａｓ　ｃｕｔ　ａｎｄ　ｆｉｌｔｅｒｅｄ，ａｎｄ　ｒｅｄ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ．Ｍｏｎｏｅｙｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｂｙ　Ｆｉｃｏｌｌ　ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｎ　ＣＩＭ　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ　ａｎｄ　ＣＩＭ　ＣＤ２５一Ｔｒｅｇ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｔｗｏ—ｓｔｅｐ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｐｏｓｉ—　ｔｉｖｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ．Ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＩＭ　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ　ｏｆ　ｓｐｌｅｅｎ　ｗａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｂｅｆｏｒｅ　ａｎｄ　ａｆｔｅｒ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．Ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＣＩＭ　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ　ｗａｓ　ｅｓ—　ｔｉｍａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｂｌｕｅ　ｄｙｅｉｎｇ．Ａｎｄ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ　ｗａｓ（８８．７±２．９）％ａｆｔｅｒ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｎｄ　ａｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｗｏ—ｓｔｅｐ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｉｒｎｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｅ　ｂｅａｄｓ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＩＭ　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ　ｗａｓ　１　１．６％ｂｅｆｏｒｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　９３．７％ａｆｔｅｒ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．Ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＣＩＭ　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ　ｗａｓ（９３．７±４．１）％．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ＣＩＭ　ＣＤ２５一Ｔｒｅｇ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ４４　ｓｌｉｇｈｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＞０．０５）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ４４ＲＢ　ｓｉｇｎｉｉｆ—　ｃａｎｔｌｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ＣＩＭ　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＣＴＬＡ一４　ａｎｄ　Ｆｏｘｐ３　ｉｎ　ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ　ａｌｓｏ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（ａｌｌ　ｉｎ　Ｐ＜０．０５）　．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｔｗｏ—ｓｔｅｐ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ　ｃａｎ　ａｖｏｉｄ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｃ１Ｍ　ａｎｄ　ｇｅｔ　ＣＩＭ　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｐｕｒｉｔｙ　ａｎｄ　ｈａ－　ｔｕｒｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎＡ６７４－７４４５　２０１　１．０６．０１５　基金项目：科技部国际合作项目（２０１ＯＤＦＡ３２６６０）；广东省自然科学基金项目（１０２５１００８００２０００００２，１０１５１００８００２０００００３）　作者单位：５１００８０广东省心血管病研究所心外科广东省人民医院广东省医学科学院（黄克力、朱平、卢聪、朱小兰、　麦明杰、吴若彬、刘怀普、黄晶晶、王巍、谢波）；中山大学免疫学教研室（沈二霞）　通讯作者：朱平，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｕｐｉｔｌｇｚｇｇｄ＠ｇｍａｉＬｃｏｒｎ　第６期　黄克力等．免疫磁珠两步法体外分离纯化小鼠脾脏ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞的应用研究　．３５５．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｔｗｏ—ｓｔｅｐ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｅ　ｂｅａｄｓ；ＣＤ４　ＣＤ２５　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ；　Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ；Ｍｏｕｓｅ　调节性Ｔ细胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ，Ｔｒｅｇ）的代　用的ＬＤ分离柱、ＭＳ分离柱、ＭｉｄｉＭＡＣ分选器均　购自ＭＡＣＳ公司。流式细胞仪（购自ＢＤ公司）、　酶标仪。　三、小鼠脾细胞悬液的制备　无菌操作摘取Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ－２ｂ）雄性小鼠的　脾脏。将小鼠脾脏剪碎后经２００目不锈钢网过滤，　表为ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ，约占外周ＣＤ４　Ｔ淋巴细胞　总数的５％～１０％【１－２］。上世纪９Ｏ年代Ｓａｋａｇｕｅｈｉ　等　首次报道了ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ对器官特异性自　身免疫病有防治作用，随后一些基础和临床研究也　证实ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ能维持器官移植特异性免疫　耐受，更为重要的是，在免疫耐受的移植物中可以　找到ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ，且其对供体抗原具有异基　因特异性　４　Ｊ。因此，研究ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ诱导　免疫耐受的形成对防治器官移植排斥反应具有重要　的意义，而要对其进行深入的研究，首先必须采用　一种相对高效、简捷的方法获得足量的高纯度　ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ并对其进行鉴别。现有分离　ＣＩＭ　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的方法主要有免疫磁珠两步法、　流式两步分选法。相对于流式两步分选法，免疫磁　性两步法具有操作方便简单、无需大型仪器设备、　更容易实现无菌分选的优点，因而该法得到越来越　广泛的应用。本实验用免疫磁珠阴性加阳性选择两　步法建立稳定的体外分离纯化ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的　方法，并利用流式细胞法分析其表型等，现将有关　结果报道如下。　材料与方法　一、实验动物　清洁级近交系Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ－２ｂ）雄性小鼠４０　只，８—１０周龄，体重２０～２３　ｇ。由中山大学实验　动物中心提供。　二、主要试剂与仪器　藻红蛋白（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ，ＰＥ）标记的大鼠抗　小鼠ＣＤ２５抗体（ＣＤ２５．ＰＥ）、抗小鼠ＣＤ４抗体　（ＣＤ４－ＰＥ），异硫氰酸荧光素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙ．　ａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）标记的抗小鼠ＣＤ２５抗体（ＣＤ２５．　ＦＩＴＣ）、抗小鼠ＣＤ４抗体（ＣＤ４一ＦＩＴＣ）。荧光标记　的抗细胞毒性Ｔ淋巴细胞相关抗原（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ａｎｔｉｇｅｎ，ＣＴＬＡ）－４抗体、抗　ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ６２Ｌ抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗　ＣＩＭ５ＲＢ抗体和抗Ｆｏｘｐ３抗体。小鼠ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ分离试剂盒，免疫磁珠标记抗ＦＩＴＣ试剂盒　（购自德国Ｍｉｈｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ公司，内含生物素化的　抗小鼠组合表型的单克隆抗体）。免疫磁珠分离所　用Ｔｒｉｓ－ＮＨ　Ｃ１溶液处理去除红细胞，混于Ｈａｎｋｓ液　中，离心洗涤，调整细胞浓度至２×１０　ｍｌ，制成　脾细胞悬液。　四、纯化前ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞比例的　检测　取脾细胞悬液，分别加入ＣＤ２５．ＰＥ和ＣＤ４．　ＦＩＴＣ共染，用流式细胞仪检测ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的　比例，作为纯化分离前结果。　五、ＣＩＭ　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞的分离　用Ｆｉｃｏｌｌ法分离脾细胞悬液获得单个核细胞。　采用免疫磁珠阴性加阳性选择两步法分离ＣＤ４　和　ＣＤ２５　。使用小鼠ＣＤ４　Ｔ淋巴细胞磁珠分离试剂　盒、ＬＤ分离柱、ＭＳ分离柱、ＭｉｄｉＭＡＣ分选器，　全部操作按说明书进行。先阴性选择去除非ＣＩＭ　Ｔ淋巴细胞而获得ＣＩＭ　Ｔ淋巴细胞；加入ＦＩＴＣ－　ＣＤ２５单克隆抗体，再加入磁珠标记抗ＦＩＴＣ后分选　细胞，阳性选择获得ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ，阴性选择　获得ＣＤ４　ＣＤ２５一Ｔｒｅｇ，用流式细胞仪检测ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的比例，并与纯化前数值比较。　六、ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞活性和纯度的　检测　取ｌ０　Ｉｘｌ　ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ悬液，应用台盼蓝　染色，镜下计数２００个细胞，计算活细胞率。将　ＦＩＴＣ—ＣＤ４加人１００　ｌ　ＣＩＭ　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ悬液，混　匀，４　ｏ【＝避光孵育３０　ｍｉｎ，然后用缓冲液冲洗２　次。调整细胞数至１　ｘ　１０。／ｍｌ，用流式细胞仪检测　其纯度。　七、分选细胞表型的鉴定　用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ与ＣＤ４　ＣＤ２５一Ｔｒｅｇ的ＣＴＬＡ一４、ＣＤ６９、　ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４４和ＣＤ４５ＲＢ和Ｆｏｘｐ３表达。　八、统计学方法　采用ＳＰＳＳ　ｌ１．０统计软件。计量数据以均数土　标准差表示。率的比较采用　检验。Ｐ＜０．０５为　・３５６・　器官移植　第２卷　差异有统计学意义。　结　果　一、纯化分离前后脾细胞ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性　Ｔ细胞的纯度及细胞存活率　纯化分离后ＣＩＭ　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的纯度为（８８．７±　２．９）％，细胞存活率为（９３．７±４．１）％。　纯化分离前ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的平均比例为　１１．６％，纯化分离后ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的平均比例　为９３．７％，见图１。　图１小鼠脾细胞纯化分离前后ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的比例　二、ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞和ＣＤ４　ＣＤ２５一　Ｔ淋巴细胞的表型　结果显示，ＣＤ６２Ｌ和ＣＤ６９在ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ和ＣＤ４　ＣＤ２５一Ｔｒｅｇ中的表达差异无统计学意　义，而在ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ中，ＣＤ４４的表达略有　增加（Ｐ＞０．０５），ＣＤ４５ＲＢ的表达明显下降（Ｐ＜　０．０５）。ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔ淋巴细胞中只表达ＣＴＬＡ一４　的占４．７５％、只表达Ｆｏｘｐ３的占２９．６％、ＣＴＬＡ．　４、Ｆｏｘｐ３均表达的占４１．５％；ＣＤ４　ＣＤ２５一Ｔｒｅｇ的　表达情况相应为１．７６％、２．６３％和２．７７％，可　见ＣＴＬＡ一４和Ｆｏｘｐ３在ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的表达率　明显高于ＣＤ４　ＣＤ２５一Ｔｒｅｇ（均为Ｐ＜０．０５）。　讨　论　目前，用于分离ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的方法主要　有免疫磁珠分离法、流式细胞技术等　Ｊ。流式细　胞技术的特点是分离纯度高，但分离速度慢、细胞　获得率低，对于功能性的表面分子（如ＣＤ４分子）　有激惹作用，而免疫磁珠分离法效率较流式细胞技　术分选效率明显增高。　免疫磁珠分离法常分两步进行，其分选策略有　阳性选择和阴性选择两种。所谓双阳性分选是指采　用连接两种不同的免疫磁珠的单克隆抗体，经磁分　离系统进行两次阳性选择。但是，同样存在激惹　ＣＤ４分子的缺点，故不适用于提取ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的研究。阴性加阳性选择ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ，　首先利于生物素化的抗小鼠组合表型的单抗去除　ＣＤ４　Ｔ淋巴细胞以外的单核细胞、巨噬细胞、粒　细胞、自然杀伤细胞、ＣＤ８一Ｔ淋巴细胞，然后在获　得的ＣＤ４　Ｔ淋巴细胞中用抗ＣＤ２５单克隆抗体和　免疫磁珠分离出ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ。与双阳性选择　的方法相比，该法不仅用时较短，而且能够避免激　惹ＣＤ４等功能表面分子　Ｊ。本文结果显示，经免　疫磁珠阴性加阳性选择纯化分离后的ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的纯度为（８８．７±２．９）％，细胞存活率为　（９３．７±４．１）％，与其他文献报道的结果非常接　近。　为进一步了解本研究所分离出来的　ＣＩＭ　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的功能与天然的Ｔｒｅｇ是否一致，　我们对所分离出来的ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ和　ＣＤ４　ＣＤ２５一Ｔｒｅｇ进行表型鉴定，结果显示ＣＤ６２Ｌ　和ＣＤ６９在ＣＤ４　ＣＤ２５　和ＣＤ４　ＣＤ２５一Ｔ淋巴细胞　中的表达差异无统计学意义，而在ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ中，ＣＤ４４的表达略有增加（Ｐ＞０．０５），　ＣＤ４５ＲＢ的表达明显下降（Ｐ＜０．０５）；ＣＴＬＡ一４和　Ｆｏｘｐ３在ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ的表达明显高于ＣＤ４　ＣＤ２５一Ｔｒｅｇ（均为Ｐ＜０．０５）。其表型鉴别结果与　天然的Ｔｒｅｇ一致　。　。　综上所述，我们认为使用免疫磁珠阴性加阳性　选择两步分选法能避免激惹ＣＤ４分子，可获得高　纯度且具有天然ＣＤ４　ＣＤ２５　Ｔｒｅｇ表型的细胞。　参　考　文　献　［１］ｈｏｈ　Ｍ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｔ，Ｓａｋａｇｕｃｈｉ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｙｍｕｓ　ａｎｄ　ａｕ．　ｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ２５　ＣＤ４　ｎａｔｕｒａｌｌｙ　ａｎｅｒｇｉｃ　ａｎｄ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ａｓ　ａ　ｋｅｙ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｙｍｕｓ　ｉｎ　ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　ｓｅｌｆ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，　１９９９，１６２（９）：５３１７－５３２６．　［２］Ｓａｋａｇｕｃｈｉ　Ｓ，Ｓａｋａｇｕｃｈｉ　Ｎ，Ａｓａｎｏ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　ｓｅｌｆ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ＩＬ一２　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｌｐｈａ—ｃｈａｉｎｓ（ＣＤ２５）．ｂｒｅａｋｄｏｗｎ　ｏｆ　ａ　ｓｉｎ—　ｇｌｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｓｅｌｆ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｃａｕｓｅｓ　ｖａｒｉｏｕｓ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９５，１５５（３）：１１５１．１１６４．　［３］Ｊｉａｎｇ　Ｓ，Ｌｅｃｈｌｅｒ　ＲＩ，Ｈｅ　ＸＳ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．Ｈｕｍ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００６，６７　（１０）：７６５・７７６．　［４］Ｋａｎｇ　ＳＭ，ＴａｎｇＱ，Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ　ＪＡ．ＣＤ４　ＣＤ２５　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ，ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｓ—　ｐｅｃｔｓ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００７，７（６）：１４５７—１４６３．　第６期　黄克力等．免疫磁珠两步法体外分离纯化小鼠脾脏ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞的应用研究　・３５７・　［５］Ｄａｉｎｉａｋ　ＭＢ，Ｋｕｍａｒ　Ａ，Ｇａｌａｅｖ　ＩＹ，ｅｔ　ａ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ａｄｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｅｎｇ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００７。　１０６：１—１８．　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｂｌｏｏｄ［Ｊ］．Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ，２００１，１９３（１１）：１３０３－１３１０．　［１１］Ｐａｕｓｔ　Ｓ，Ｌｕ　Ｌ，ＭｃＣａｒｔｙ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂ７　ｏｎ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｉｌｓ　ｐｒｅｖｅｎｔｓ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　［６］Ｄｉ　Ｉａｎｎｉ　Ｍ，Ｄｅｌ　Ｐａｐａ　Ｂ，Ｃｅｃｃｈｉｎｉ　Ｄ，ｅｔ　１．Ｉａｍｍｕｎｏｍａｇ－　ｎｅｔｉｃ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ４　ＣＤ２５　ＦｏｘＰ３　ｎａｔｕｒａｌ　Ｔ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ，２００４。１０１　（２８）：１０３９８・１０４０３．　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｆｏｒ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｉｍｍｕ－　ｎｏｌ，２００９，１５６（２）：２４６—２５３．　［１２］Ｆｏｎｔｅｎｏｔ　ＪＤ，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ　ＪＰ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ＬＭ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｇｕ－　ｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅａｇｅ　ｓｐｅｃｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｆｏｒｋｈｅａｄ　ｔｒａｎｓ・　［７］Ｂｒｅｓａｔｚ　Ｓ，Ｓａｄｌｏｎ　Ｔ，Ｍｉｌｌａｒｄ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐａｇａ・　ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ＣＤ４　ｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｘｐ３［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００５，２２（３）：　ＣＤ２５　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｉｌｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　３２９．３４１．　２００７，３２７（１－２）：５３—６２．　［１３］李永海，张淦，李明，等．ＮＯＤ小鼠未成熟树突状　［８］Ｈｏｆｆｍａｎｎ　Ｐ，Ｂｏｅｌｄ　ＴＪ，Ｅｄｅｒ　Ｒ，ｅｔ　１ａ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ４　细胞体外诱导淋巴细胞生成并扩增调节性Ｔ细胞的　ＣＤ２５　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｔｉｒａｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ　Ｂｌｏｏｄ　研究［Ｊ］．器官移植，２０１１，２（３）：１２９—１３４．　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌｎａｔ，２００６，１２（３）：２６７－２７４．　（收稿日期：２０１１—０９—０１）　［９］Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ　Ｄ，Ｐｌｏｔｔｎｅｒ　Ｈ，Ｂｅｒｃｈｔｏｌｄ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘ　ｖｉｖｏ　ｉｓｏ．　（本文编辑：朱佩玲）　１ａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）Ｔ　（上接第３４１页）　［２］Ｇａｌｌａｇｈｅｒ　Ｍ，Ｊｒａｄｉｎｅ　Ｍ，Ｐｅｒｋｏｖｉｃ　Ｖ，ｅｔ　ａ１．Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ　１８８３．　ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ　ｉｍｐｒｏｖｅｓ　ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ　ｇｒａｆｔ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｉｎ　ｒｅｎａｌ　ｔｒａｎｓ—　［９］　Ｅｋｂｅｒｇ　Ｈ，Ｔｅｄｅｓｃｏ—Ｓｉｌｖａ　Ｈ，Ｄｅｍｉｒｂａｓ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅ－　ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｔｒｎａｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００９，８７（１２）：１８７７－　ｄｕｃｅｄ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｔｏ　ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｉｎ　ｒｅｎａｌ　ｔｒａｎｓ－　１８８３．　ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ，２００７，３５７（２５）：　［３］Ａｂｒａｍｏｗｉｃｚ　Ｄ，Ｄｅｌ　Ｃａｒｍｅｎ　Ｒｉａｌ　Ｍ，Ｖｉｔｋｏ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｃｙ—　２５６２－２５７５．　ｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ　ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ　ｆｒｏｍ　ａ　ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ　ｍｏｆｅｔｉｌ・－ｃｏｎｔａｉ・・　［１Ｏ］　Ｈａｚｚａｎ　Ｍ，Ｌａｂａｌｅｔｔｅ　Ｍ，Ｃｏｐｉｎ　ＭＣ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　ｎｉｎｇ　ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ　ｒｅｇｉｍｅｎ：ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ａ　ｆｉｖｅ—ｙｅａｒ，　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｆ　ａｃｕｔｅ　ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｅａｒｌｙ　ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ　ｗｉｔｈ—　ｐｒｏｓｅｐｃｔｉｖｅ，ｒｎａｄｏｍｉｚｅｄ　ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｊ　Ａｍ　Ｓｏｃ　Ｎｅｐｈｒｏｌ，　ｄｒａｗａｌ　ｉｎ　ｒｅｎａｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ　ｗｈｏ　ｒｅｃｅｉｖｅ　ｍｙｃｏ—　２００５，１６（７）：２２３４—２２４０．　ｐｈｅｎｏｌａｔｅ　ｍｏｆｅｔｉｌ：ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｒｏｍ　ａ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ，ｒａｎｄｏｍ－　［４］Ｄｕｄｌｅｙ　Ｃ，Ｐｏｈａｎｋａ　Ｅ，Ｒｉａｄ　Ｈ，ｅｔ　１ａ．Ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ　ｏｒｏｆ－　ｉｚｅｄ　ｔｒｉｍ［Ｊ］．Ｊ　Ａｍ　Ｓｏｃ　Ｎｅｐｈｒｏｌ，２００５，１６（８）：　ｅｔｉｌ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｏｆｒ　ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ　ａ　ｉｎ　ｒｅｎａｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　ｒｅｃｉｐ—　２５Ｏ９．２５ｌ６．　ｉｅｎｔｓ　ｗｉｈｔ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ　ａｌｌｏｇｒａｆｔ　ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ　Ｈｙｍｅｓ　ＬＣ，Ｗａｒｓｈａｗ　ＢＬ　Ｆｉｖｅ－ｙｅａｒ　ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ　ｕｓｉｎｇ　“ｃｒｅｅｐｉｎｇ　ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ”ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｔｒｎａｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００５，　ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ—ｂａｓｅｄ，ｃａｌｅｉｎｅｕｒｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｆｒｅｅ　ｉｍｍｕｎｏｓｕｐ—　７９（４）：４６６—４７５．　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｐｅｄｉａｔｉｒｃ　ｒｅｎａｌ　ｔｒｎａｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｅｄｉａｔｒ　［５］Ｎａｎｋｉｖｅｌｌ　ＢＪ，Ｂｏｒｒｏｗｓ　ＲＪ，Ｆｕｎｇ　ＣＬ，ｅｔ　ａ１．Ｎａｔｕｒａｌ　ｈｉｓｔｏ—　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２０１１，１５（４）：４３７—４４１．　ｒｙ，ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒｓ，ａｎｄ　ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ　ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｋｉｄ－　［１２］　Ａｌａｒｒａｙｅｄ　ＳＭ，Ｅ１－Ａｇｒｏｕｄｙ　ＡＥ，Ａｌａｒｒａｙｅｄ　ＡＳ，ｅｔ　ａ１．　ｎｅｙ　ｔｒｎａｓｐｌｎａｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００４，７８（２）：　Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ．．ｂａｓｅｄ　ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ　ｉｍｍｕ．．　２４２－２４９．　ｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ　ｒｅｇｉｍｅｎ　ｉｎ　ｋｉｄｎｅｙ　ｔｒｎａｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ａ　ｓｉｎ—　［６］Ｎａｎｋｉｖｅｌｌ　ＢＪ，Ｃｈａｐｍａｎ　ＪＲ．Ｃｈｒｏｎｉｃ　ａｌｌｏｇｒａｆｔ　ｎｅｐｈｒｏｐａ－　ｇｌｅ　ｃｅｎｔｅｒ　ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｎｅｐｈｒｏｌ，２０１０，　ｔｈｙ：ｃｕｒｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｐｔｓ　ａｎｄ　ｆｕｔｕｒｅ　ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓ－　１４（３）：２４８—２５５．　ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００６，８１（５）：６４３—６５４．　［１３］　张彦选，曲青山，于立新，等．。肾移植术后患者应　［７］Ｋｅｅ　ＴＹ，Ｃｈａｐｍａｎ　ＪＲ，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ　ＰＪ，ｅｔ　ａ１．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　用西罗莫司对他克莫司剂量的影响［Ｊ］．器官移植，　ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ　ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ　ｄｉａｇｎｏｓｅｄ　ｂｙ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｂｉｏｐｓｙ　ｏｆ　ｋｉｄｎｅｙ　ｌ（２）：９５－９８．　ｔｒｎａｓｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｔｒｎａｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００６，８２（１）：３６—４２．　（收稿日期：２０１１—０８—１０）　［８］Ｃａｌｌａｇｈｅｒ　Ｍ，Ｊａｒｄｉｎｅ　Ｍ，Ｐｅｒｋｏｖｉｃ　Ｖ，ｅｔ　１ａ．Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ　（本文编辑：邬加佳朱佩玲）　ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ　ｉｍｐｒｏｖｅｓ　ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ　ｇｒａｆｔ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｉｎ　ｒｅｎａｌ　ｔｒａｎｓ－　ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｐｌｎａｔａｔｉｏｎ，２００９，８７（１２）：１８７７・