不同浓度弗氏佐剂对B6AF1小鼠免疫性卵巢早衰模型建立的影响

卵巢早衰模型建立的影响陈阴，王佩娟，陈思，卢燕(南京中医药大学附属中西医结合医院妇产科，南京210028)［摘要］目的 观察不同浓度弗氏佐剂对透明带3多肽(pZP3)诱导的B6AF1小鼠免疫性卵巢早

衰(POF)模型的影响。方法取6~8周龄雌性B6AF1小鼠80只，随机分为空白组、不完全弗

氏佐剂组、完全弗氏佐剂组［含结核分枝杆菌(TB)1 mg/mL)和不完全弗氏佐剂+TB(3.3 mg/mL)

组,应用HE染色法比较不同注射量的弗氏佐剂对POF模型小鼠免疫效果的影响。结果 免疫 后模型组小鼠卵巢体积萎缩，闭锁卵泡增多，卵泡周围见间质淋巴细胞浸润。不完全弗氏佐剂

+ TB(3.3 mg/mL)组免疫效果最好，完全弗氏佐剂组次之。结论 不同浓度弗氏佐剂联合pZP3 均可诱导B6AF1小鼠成功构建POF疾病模型，引起免疫性卵巢炎;含高浓度TB造模效果较好。［关键词］卵巢早衰(POF);弗氏佐剂；结核分枝杆菌(TB);透明带3多肽(pZP3); B6AF1小鼠；

卵巢炎［中图分类号］Q95-33 ［文献标识码］A ［文章编号］1674-5817(2019)04-0294-04卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是指 研究进展十分缓慢，究其原因之一是缺乏用于开

展各项药物实验的标准化动物模型。本研究根据

40岁之前由于卵巢内卵泡耗竭或破坏而发生卵巢 功能衰竭的一种综合征。POF的发病率：20岁以

近几年国内外POF相关动物模梨研究进展，选取

(C57BL/6 X A/J) F1(B6AF1)雌鼠作为研究对象，

前约为0.01%, 30岁前约0.1%, 40岁前约1%［1］,

超过半数的本病患者貝有不良情绪英至抑郁、厌

将透明带3多肽(pZP3)抗原分别与不同佐剂混合

免疫小鼠，观察其免疫效果，以期建立免疫性POF

世［2］,严重影响女性身心健康，造成社会负担。 发病率的逐年升髙及病患年轻化的现状，与生育

动物模型，进一步探究POF的免疫调节机制。年龄的整体延后和社会对精神心理健康关注形成 强烈矛盾。本病的致病因素包括：遗传因素、感 染因素、自身免疫因素、医源性损伤及精神因素

等［3］，约1/3的POF的发病与自身免疫异常密切

1材料与方法1.1动物SPF级雄性A/J小鼠10只，雌性C57BL/6

相关。然而迄今为止，有关POF的免疫学机制［收稿日期］2018-12-10［基金项目］江苏省自然科学基金面上项目小鼠30只，均为7〜9周龄，购自中国人民解放

军军事医学研究院实验动物中心［SCXK-(军)2007-

004］,于江苏省中医药研究院屏障设施饲养并繁

(编号:BK20171511),第六批全国老中更药 专家学术经验继承工作(编号：17QGSC001)［作者简介］陈 坍(1990-)，女,硕上研究生,住院医师。研

殖 B6AF1 小鼠［(C57BL/6 X A/J) F1］。本实验取

6~8周龄B6AF1雌鼠80只分为：空白组、不完

全弗氏佐剂(IFA)组、完全弗氏佐剂(CFA)［含结核

究方向：中医妇科。E-mail: cy94264@126.com

［通信作者］卢燕(1976-),主任医师。分枝杆菌(TB)1 mg/mL］组和 IFA+ TB(3.3 mg/mL) 组，每组20只。体质量21〜23 g,自山摄食饮

E-mail: cnxz2000@163.com

Aug.2019,39(4)实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative Medicine295水，每口保持12 h明暗交替，温度20〜25 °C, 与空白组相比差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

相对湿度 40%〜50%［SYXK(苏)2016-0018］。1.2实验试剂2.3卵巢组织病理学观察空白组卵泡数量较多，发育较好，有成熟

卵泡，各级卵泡均有，卵泡形态规则，颗粒细 胞排列整齐(图1A); IFA组见少量卵泡，卵泡形

透明带3(ZP3)330〜342氨基酸系列的多肽片

断［pZP3, ZP3330-342(NSSSSQFQIHGPR)］,分

析纯度>95%，购自上海吉尔生化有限公司。

态尚规则，颗粒细胞排列较紊乱，有一个次级卵

IFA(#344291)、CFA(#344289)购自美国 Sigma 公

司，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis

泡(图1B); CFA组见大量初级卵泡，卵泡形态尚 规则，颗粒细胞排列紊乱(图1C); IFA+TB组见少 量卵泡，未见次级卵泡及成熟卵泡，卵泡形态不

规则，颗粒细胞排列紊乱，可见淋巴细胞及浆细

H37 Ra, #231141)购自美国 BD Difco 公司。1.3实验处理与分组采用双蒸水将pZP3配制成为1 mmol/mL的溶 胞浸润(图1D)。说明不同浓度佐剂免疫后均导致

小鼠POF模型，高浓度组免疫效果最好。液。与1.1対应的3组分别选取IFA、含1 mg/mL 的TB H37Ra的CFA、经配制含有3.3 mg/mL的

TB H37Ra的CFA与pZP3溶液按等比例混合配成

免疫乳化剂，用0.1 mL乳化剂注射脚寧和尾根

3讨论Rhim等［4］在1992年报道pZP3可诱导小鼠产

皮下免疫小鼠，第14日加强免疫1次。空白组 选择生理盐水。1.4取材与卵巢HE染色生抗ZP3抗体,与卵巢ZP3结合引起免疫反应，从

而引起类似于人类POF的表现如储备卵泡减少、 卵巢体积萎缩等。不同种系小鼠在免疫反应性方

自第1次免疫后28 d处死小鼠，取小鼠卵巢

组织HE染色：将卵巢放入Bouin氏固定液，24 h

后脱水包埋，常规石蜡切片5 y.m,进彳亍HE染

面存在显著差异，相同剂量pZP3可引起B6AF1、

BALB/c小鼠自身免疫性卵巢炎，之后陆续有学 者［5-7］选用BALB/c小鼠造模成功。本研究选用成

色。病理切片在倒置显微镜下进行拍照观察。1.5统计学方法采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，组间

比较采用Z2检验，P<0.05为差异有统计学意义。模率较高的B6AF1雌鼠作为研究对象［8］,用弗氏佐

剂联合pZP3多肽造模，貝有操作简单、成模率 高和死亡率低等优点。结果提示，与空白组比较， 模型组小鼠的动情周期紊乱，卵巢萎缩，卵巢组

2结果2.1 一般情况免疫各组B6AF1小鼠均出现了体质量明显下

织病理表现提示为自身免疫性卵巢炎，且卵巢组织 内淋巴细胞大量浸润，符合免疫性POF的特点［9］。佐剂本身不貝备免疫原性，与抗原物质一起注

射或预先注入机体后，起到免疫增强的作用，使 机体更早、更有效、更持久地产生免疫应答

降，精神萎靡不振、反应迟钝和行动迟缓。

2.2小鼠动情周期的改变免疫后各组小鼠出现不同程度的动情周期紊 乱，表现为动情周期缩短、延长和持续动情周期，

佐剂与抗原合用时能显著增强抗原免疫效应

其可能的作用机制有二：一是与局部淋巴细胞接

触可浓缩抗原，即储存效应(depot effect);二是通表1不同组别小鼠动情周期的改变Table 1 Change of estrous cycle in the four groups动情周期紊乱组别空口n20202020动情周期正常动情周期缩短动情周期延长持续动情周期合计IFACFAIFA+TB186031912214*17*20*3046101232注：与空口组比较,¥<0.05296实验动物与比较更-学 Laboratory Animal and Comparative MedicineAug.2019,39(4)A:空白组;B: IFA 组;C: CFA 组;D: IFA+TB 组1 (HE X 100)过诱导细胞因子的产生，调节淋巴细胞的功能。 小鼠可以成功构建免疫性POF模烈，同时引起卵

巢组织局部淋巴细胞大量浸润导致免疫性卵巢佐剂与抗原混合后形成“油包水”乳胶混, :-抗原被乳剂包裹后可在注射部位缓慢释放，能够 非常有效地诱导产生髙滴度的抗体；另一方面，

TB参考文献：[1]

,

油滴中免疫原的持续释放加强佐剂活性，刺激局 部免疫反应。目前动物实验中常用的有弗氏佐

.

,2015, 3l(8):703-706.[J].中国剂、卡介苗、脂质体和类病毒颗粒等。弗氏佐 剂分为CFA和IFA两种，区别是前者含有TB成[2] Benetti-Pinto CL, de Almeida DM, Makuch MY. Quality

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CFA TB[1玛局部皮肤溃疡等反应。且有致敏以及潜在的致癌 作用等毒副作用，但其高度佐剂活性是其它物质

logistic 冋[J].现代妇产科进展,2015, 24(2):109-111.[4] Rhim SH, Millar SE, Robey F, et al. Autoimmune disease

of the ovary induced by a ZP3 peptide from the mouse zona pellucida[J]. J Clin Invest, 1992, 89(1):28-35.[5]

难以媲美的。pZP3 诱导 B6AF1

, , ,等.EAug.2019，39(4)实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative Medicine297TH1/TH2型细胞因了表达关系的研究[J].中国免疫学 杂志,2001, 17(2):96-98.[9] Li J, Jin H, Zhang F, et al. Treatment of autoimmune ovarian

disease by co-administration with mouse zona pellucida

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recombinant murine cytomegalovirus expressing murine zona pellucida 3 causes permanent infertility in BALB/c mice due to follicle depletion and ovulation failure[J]. Biol Reprod, 2008, 79(5)：849-860.[7] Mande PV, Thomas S, Khan S, et al. Immunization with

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regional lymph node enrichment of antigen-specific regula­tory T cells with autoimmune disease-suppressive capacity

[J]. J Immunol, 2009, 183(12):7635-7638.[12] Taneichi M, Ishida H, Kajino K, et al. Antigen chemically

coupled to the surface of liposomes are cross-presented to CD8+ T cells and induce potent antitumor immunity[J]. J

Immunol, 2006, 177(4):2324-2330.Effect of Different Freund's Adjuvant Dose on Establishment of Immune Premature Ovarian Failure Model in B6AF1 MiceCHEN Yue, WANG Pei-juan, CHEN Si, LU Yan(Department of Obstetrics and Gynecology, Afftliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and

Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine; Nanjing 21002& China)[Abstract] Objective To observe the effect on different doses of Fletcher's adjuvant to B6AF1

mice with autoimmune premature ovarian failure (POF) induced by zona pellucida 3 peptide (pZP3). Methods Autoimmune POF models were established in 60 female B6AF1 mice (6-8 weeks old) by

immunization with pZP3 and another 20 mice served as control group. The POF models were randomly

divided into incomplete Freund's adjuvant group, complete Freund's adjuvant group (1 mg/mL) and

incomplete Freund's adjuvant + tuberculosis (TB) group (3.3 mg/mL). The HE staining ovary histomorphology results were observed by the microscope. Results Compared with those in

control group, the mice in the model group showed a smaller volume of the ovary, and larger amount

of atretic follicle of ovary. Immunohistochemical studies showed that the model mice had redundant lymphocytes infiltrating around follicle compared with control mice. The immunological effect of

incomplete Freund's adjuvant +TB (3.3 mg/mL) group was the best, followed by complete Freund's

adjuvant group. Conclusion Different concentrations of Freund's adjuvant combined with zona pellucida 3 polypeptide (pZP3) can induce autoimmune premature ovarian failure (POF) in B6AF1 mice. High concentration of Mycobacterium tuberculosis has the best effect.[Key words] Premature ovarian failure (POF); Freund's adjuvant; Mycobacterium tuberculosis (TB);Zona pellucida 3 polypeptide (pZP3); B6AF1 mice; Ovariitis