维生素E琥珀酸酯对人肝癌细胞凋亡和侵袭性

维普资讯 http://www.cqvip.com 岭南现代临床外科２００７年８月第７卷第４期Ｌｉｎｇｎａｎ　Ｍｏｄｅｍ　Ｃｌｉｎｉｃｓ　ｉｎ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ａｕｇ．２００７，Ｖｏ１．７　Ｎｏ．４　・实验研究・　维生素Ｅ琥珀酸酯对人肝癌细胞凋亡和侵袭性　的影响研究　彭　林王志度吴泽宇　广东省人民医院普外三科（广州　５１００８０）　【摘要】　目的研究维生素Ｅ琥珀酸酯（ＶＥＳ）诱导体外培养人肝癌细胞凋亡以及对肝癌细胞侵袭性的抑　制作用。方法　自２００４年至２００５年７月，体外培养ＳＭＭＣ７７２１人肝癌细胞系，在培养液中加入ＶＥＳ共育，用等　量的生理盐水作为对照组。培养６、２４、４８　ｈ后采用流式细胞仪检测肝癌细胞的凋亡，小孔趋化试验检测肝癌细　胞的体外侵袭性变化。结果在加入ＶＥＳ后肝癌细胞的凋亡率与对照组相比明显增加。在４８　ｈ加入ＶＥＳ的实　验组与对照组相比，肝癌细胞的小孔趋化试验明显受到抑制。结论ＶＥＳ具有体外诱导人肝癌细胞系凋亡以及　抑制肝癌细胞体外侵袭性的作用，是潜在的抗肿瘤因子。　【关键词】肝癌；维生素Ｅ；凋亡；侵袭　中图分类号：Ｒ７３５．７　文献标识码：Ａ　文章编号：１００９—９７６Ｘ（２００７）０４—０２５５—０２　Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｅ　ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（ＶＥＳ）ｏｎ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔＯｃｅＵｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ＰＥＮＧ　Ｌｉｎ．ＷＡＮＧ　Ｚｈｉｄｕ．　Ｚｅｙｕ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｐｅｏｐｌｅ＇ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１００８０　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｅ　ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（ＶＥＳ）ｏｎ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｉｎｖａｓｉｖｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｅ　ｓｕｃｃｉｎａｔｅ　（ＶＥＳ）ｗａｓ　ｍｉｘｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＳＭＭＣ７７２１　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｕｉｃｅ，ｔｈｅ　ｓａｆｆｌｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　０．９％Ｎａｃｌ　ＳＯｌ　ｗａｓ　ａｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ａｆｔｅｒ　６，２４，ａｎｄ　４８　ｈｏｕｒｓ，ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ　ｔｅｓｔ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｆｔｅｒ　ＶＥＳ　ｗａｓ　ａｄｄｅｄ，ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｍｎｃｈ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｏｔｓａｉｓ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ．ｔｈｅ　ｆｏｒｍｅｒ　ｗａｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ａｂｖｉｏｕｓｌｙ　ａｆｔｅｒ　４８　ｈｏｕｒｓ　ａｄｄｅｄ　ＶＥＳ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｅ　ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（ＶＥＳ）　ｍａｙ　ｉｎｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｉｎｂｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｉｎｖａｓｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｆｏｒ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ；Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｅ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｉｎｖａｓｉｏｎ　维生素Ｅ琥珀酸酯（ＶＥＳ）是一种维生素Ｅ的衍生物，　ＳＭＭＣ７７２１肝癌细胞系购于武汉大学中国典型培养　因其易溶解可被添加到细胞培养液中。在实验室条件下维　物保藏中心并经自行传代，培养于含２０％胎牛血清的　生素Ｅ可诱导来源于乳腺、皮肤和前列腺等不同组织的癌　ＤＭＥＭ培养基中，置于９５％０：，５％Ｃ０２，３７￣Ｃ培养箱中培　细胞系发生凋亡，但其触发凋亡的确切机制尚未阐明。现　养，待细胞长成单层后，用０．２５％胰蛋白酶消化分离，置离　有的研究发现维生素Ｅ同系化合物可以诱导肝癌细胞系　心机中以１０００　ｒ／ｒａｉｎ，４￣Ｃ离心５　ｍｉｎ，弃上清液，重新加入　ＨｅｐＧ２凋亡的作用［　，同时作者以前的研究也证实ＶＥＳ在　新鲜培养液并置于９６孔板中，每孔２００　，约１００１３０个　体外具有抑制ＳＭＭＣ７７２１人肝癌细胞系增殖的作用［　。本　细胞。继续置于培养箱中培养待用。　实验对维生素Ｅ琥珀酸酯（ＶＥＳ）诱导体外培养人肝癌细　１．２　加入维生素Ｅ琥珀酸酯（ｖＥＳ）　胞凋亡的作用以及其对肝癌细胞侵袭性的抑制作用作了　以上细胞过夜贴壁后，随机将细胞分为２组，每组１６　进一步研究。　孔，在实验组细胞中加４０　ＶＥＳ（用０．１％ＥＤＴＡ（乙二胺　１材料与方法　四乙酸）和０．９％的生理盐水溶解ＹＥＳ），使孔中的总浓度　为１００　ｍｇ／Ｌ。对照组孔中加入８０　０．１％ＥＤＴＡ和０．９％　１．１体外培养人肝癌细胞　生理盐水。维生素Ｅ的每组孔中加入４０　的对照溶液以　基金项目：广东省医学研究基金（３．２００６０１９）　使各组之间的总量和条件基本相同。　收稿日期：２００７－０５－３０　１．３流式细胞仪检测凋亡细胞数　维普资讯 http://www.cqvip.com 岭南现代临床外科２００７年８月第７卷第４期Ｌｉｎｌ￣ａｎ　Ｍｏｄｅｍ　Ｃｌｉｎｉｃｓ　ｉｎ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ａｕｇ．２００７，Ｖｏ１．７　Ｎｏ．４　消化收集１０６个细胞，用ＰＢＳ洗涤两次，１０００　ｒｐｍ离　心５　ｍｉｎ。沉淀细胞用８０％乙醇固定，一２Ｏ℃保存备用。采用　碘化丙锭（Ｐｉ）染色法染色．再用ＢＤ　ＦＡＣＳｏｒｔ流式细胞仪　测定细胞凋亡数，计算凋亡细胞比率。　１．４小孔趋化实验　采用４８孔ＭｉｃｒｏＢｏｙｄｅｎ微孔膜小室趋化板（美国　Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ公司产品）进行。消化收集细胞调节至１０５—　１０６／ｍｌ，向趋化板底板各孔加入２５０　ｌ条件培养液作为　趋化因子。将无ＤＶＰ的聚碳酸膜（８　ｍ，Ｗｈａｔｍａｎ，　Ｇｅｒｍａｎ）覆盖在培养液上。依次盖上硅胶板和顶板并固定　好。在顶板各孔中加人２５０　Ｌ肝癌细胞悬液，在３７℃，５％　ＣＯ：的培养箱中培养２　ｈ。取下滤膜，用ＰＢＳ冲洗无细胞　的一面．用橡皮檫去没有迁移的细胞。７０％甲醇固定膜上　细胞４５　ｍｉｎ．取出滤膜晾干，苏木素染色８～１０　ｈ。取出漂　洗、晾干，高倍镜下记数细胞。一般记数３个高倍视野下全　部细胞取其平均值。　１．５统计学处理　实验数据以　±ｓ表示，采用ＳＰＳＳ统计分析软件行ｔ检　验和方差分析．检验水准ａ＝０．０５。　２结果　２．１　ＶＥＳ作用后６　ｈ即可检测到明显的Ｇ０／Ｇ，期峰前的　亚二倍体峰．即凋亡峰。随时间延长２４　ｈ达到高峰．４８　ｈ　已经有所下降。与对照组相比，肝癌细胞的凋亡比率明显　增加（Ｐ＜Ｏ．０５）。　２．２经ＶＥＳ处理的肝癌细胞在小孔趋化试验中迁移率与　对照组相比明显降低，但在各时相没有明显区别（表２）。　表１　ＶＩＥＳ处理后肝癌细胞凋亡比率的变化　表２　ｖＥＳ处理后肝癌细胞迁移率的变化　３讨论　维生素Ｅ是一种脂溶性维生素，包括多种同系化合物　表现出不同的生物学活性。可对抗自由基的破坏作用，降　低多不饱和脂肪酸的过氧化，防止脂质过氧化物的形成，　保护细胞膜不受氧化破坏及维持组织正常的新陈代谢等　多种重要作用。维生素Ｅ潜在的肿瘤防治作用受到许多学　者关注。研究发现【ｓ］：维生素Ｅ对多种肿瘤具有抑制肿瘤　细胞生长、降低或延缓体内肿瘤发生的作用。在维生素Ｅ　与肝癌关系方面．一些研究证实维生素Ｅ对肝癌有一定的　防治作用．但研究结论尚存在争议。作者以往的研究发现　维生素Ｅ琥珀酸酯（ＶＥＳ）作为强抗氧化剂．体外可以明显　抑制肝癌细胞的增殖。体外实验还发现维生素Ｅ可诱导　来源于乳腺、皮肤和前列腺等不同组织的癌细胞系发生　凋亡［３］，但其触发凋亡的确切机制尚未阐明。　本实验结果显示：经维生素Ｅ琥珀酸酯（ＶＥＳ）共育培　养的肝癌细胞系．其细胞凋亡的比例明显增加．而且肝癌　细胞的细胞迁移率（反应肿瘤细胞侵袭能力指标）也明显　降低。结合以往的研究以及其他学者的结论．作者认为维　生素Ｅ及其化合物具有体外抑制肝癌增殖、促进肝癌细胞　凋亡以及降低肝癌细胞侵袭能力的作用。Ｒｏｃｃｈｉ等学者的　研究也发现原发性肝癌患者血标本及肝组织标本中生育　酚浓度比其他肝病患者以及健康人群明显降低［４］。因此进　一步研究维生素Ｅ在对肝癌的作用对于发挥其简单易行　的抗肿瘤作用将具有一定的前景。关于维生素Ｅ抑制肿瘤　的作用可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡的途径来实现已经　得到众多学者的共识，但其诱导肿瘤细胞凋亡的确切机制　目前尚未明了。有研究资料显示ＶＥＳ诱导肿瘤细胞凋亡　涉及ＴＧＦ２和ＦａｓＰＦａｓ配体信号传导通路，Ｎｅｕｚｉｌ等研究发　现ＶＥＳ诱导肿瘤细胞凋亡与ＰＫＣ信号传导通路有关［５＇引。　这些推论尚有待进一步研究证实。　维生素Ｅ是常用的抗氧化营养素．在由于其只作用于　肿瘤细胞而不影响正常细胞的生长规律．因此ＶＥＳ有望　成为高效低毒防治肝癌的新型药物。今后的研究将从细胞　水平进行进一步探索以及探讨如何将体外研究和体内实　验相结合。在肝癌动物模型中研究维生素Ｅ的体内作用．　而且不同的给药途径对肿瘤实体的作用效果如何也是进　一步探讨的问题。　参考文献　［１］闵军霞，郭俊生，赵法及，等．维生素Ｅ同系化合物　诱导人肝癌细胞凋亡的作用［Ｊ］．卫生研究，２００３，３２　（２）：１３１－１３３．　［２］陈洁生．彭林．ＹＹ多肽和维生素Ｅ对人肝癌细胞增　殖的抑制作用［Ｊ］．实用医学杂志，２００３，１９（１）：１２—　１３．　［３］ＳＴＥＩＮＭＥＴＺ　Ｋ，ｐｏｒＩＴＥＲ　Ｄ，ＡＬＤＡＺ　Ｃ．Ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ，　ｆｒｕｉｔ，ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ：ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｊ　Ａｍ　Ｄｉｅｔ　Ａｓｓｏｃ，１９９６，９６（１ｏ）：１０２７－１０２９．　【４］　ＲＯＣＣＨＩ　Ｅ，ＳＥ１ＵＭ　Ｙ，ＧＡＭＥＬＵＮ１　Ｌ，ｅｔ　１ａ．Ｈｅｐａｔｉｃ　ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ　ｃｏｎｔｅｎｔｉｎ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｎｄ　ｈｖｅｒｍｅｔａｓｔａｓｅｓ［Ｊ］．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９７，２６（１）：６７－７１．　［５］ＮＥＵＺＩＬ　Ｊ，ＷＥＢＥＲ　Ｔ，ＴＥＲＭＡＮ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｖｉａｔｍｉｎ　Ｅ　ａｎａｌｏｇｕｅｓ　ａｓ　ｉｎｄｕｃｅｒｓ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：　ｉｍｐｈｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅｉｒ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｒｏｌｅ［Ｊ］．Ｒｅｄｏｘ　Ｒｅｐ，２００１，　６（３）：１４３—１５１．　［６］ＮＥＵＺＩＬ　Ｊ，ＷＥＢＥＲ　Ｔ，ＳＣＨＲＯＤＥＲ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｆｏ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ａｌｐｈａｔｏｃｏｐｈｅｒｙｌ　ｓｕｃｃｉｎａｔｅ：　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ａｎｄ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ［Ｊ］．　ＦＡＳＥＢＪ，２００１，１５（２）：４０３—４１５．