细胞电融合的原理和方法

实验目的

动物的游离细胞以及植物成微生物去壁后的原生质体，在电刺激下进行细胞融合，且融合率

高、无毒性，操作简便及融合后的细胞继续培养成活率高等优点，是细胞工程手段的又一进

展。

实验原理

将制备的游离细胞或原生质体，置于电融合室中，在高频交流电场的作用下，细胞被极化，

成为偶极子，造成细胞之间相互连接，如果施加的高频交流电压(即正弦波的p-p值)过高或

作用时间过长，则细胞连接成串珠状，应适当控制以上条件，尽量使两细胞处于点接触状态，

然后施加方波脉冲予以刺激，由于电脉冲的瞬间作用，可击破两细胞接触点部位的质膜，此

时质膜的脂类分子发生重组，同时由于细胞表面的张力作用，使两细胞融合逐步完全。

实验用品

一、仪器

JCF-I型细胞电融合仪、细胞融合池、普通离心机、倒置显微镜(或研究用显微镜)，刻度吸

管、不锈钢网(200目)、镊子、解剖刀、解剖剪、注射器、毛细吸智、刻度吸蕾。小烧杯(10m1)、

滴瓶、培养皿、毛笔等。

二、药品

甘露醇、氧化钠，纤罐索醇(Onozura R-10)、离析酶(Macerozyme R-10)、蜗牛酶(中科院

生物物理所产)、CaCl2、2H2O、MES (2-N-吗啉乙烷磺酸)、葡聚糖硫酸钾等。

实验方法

本实验所有步骤均可在有菌条件下操作。

一、植物原生质体的制备

1、取幼嫩的叶片或充分展开的子叶，先用水洗净并吸去表面的水份，再置入小烧杯中将叶

片剪成碎块。

2、将碎块放入1.5％纤维素酶、0.3％离析酶、0.5％蜗牛酶、0.6mol/L甘露醇、50mmol/L

CaCl2·2H20、MES 3mmol/L、葡聚糖硫酸钾0.3％，pH5.6的酶液中，置于25℃暗处游离5h(或

15℃过液)，游离时间结束时，可镜检原生质体分离情况，如果大多数原生质体还未从组织

中释放出来，需增加在酶液中的游离 时间。新出厂的酵在5h内一般就可将原生质体游离

出来，但因药品质量问题或存放时间过长，致使酶活力下降，要适当延长酶解时间。

3、将醇解出来的原生质体用不锈钥网过滤，以除去未被酶解的组织，过滤后用0.6M的蔗糖

冲洗网上残留的原生质体，然后以200r/min进行离心处理5min。

4、用带长针头的注射器吸去上清液，然后加入1—1.5ml 0.2mol/L的CaCl·2H2O，将原生

质体混匀。

5、用细头滴管或带长针头的注射器向管底慢慢注入20％的蔗糖液，再以300r/min离心

10min，此时可见到在上下两液体间的界面处有一层乳白质的带状物，即为纯净的原生质体，

其破碎的部份及其它杂质都沉降到离心管底部，用长针头注射器或毛细吸臂分别吸去管底的

杂质和蔗蔗糖液以及原生质体上层的 CaCl2液。

6、向离心管加入2ml 0.2mol/L的CaCl·2H2O溶液，混匀后以300r/min离心5min去掉上清

液，量后用0.6mol/L的甘露醇溶液稀释并调整每毫升含5×104个原生质体。

二、动物细胞的制备

用灭菌的注射器先吸入Alsver液(葡萄糖2.05g，枸椽酸钠0.88，NaCl0.42g，加重蒸水至

100ml）lml，再从鸡的翼下静脉取血0.5--1ml，取出后放入刻度离心管中，再加入2--3ml Alsver

液，使总量为4--5ml，混匀并封口，置于4℃冰箱内可供一周内使用，实验时取贮备的鸡血

细胞lml，加入4ml85％生理盐水，混匀后以1200rr/min离心5min，去上清液后，最后用

0.6mol/L的甘露醇液(或0.6mol/L蔗糖溶液)混匀后以上述离心条件洗涤两次，最后用

0.6mol/L的甘露醇液将鸡细胞稀释并调整成每毫升含2×105个。

如采用传代培养的骨髓或腹水瘤细胞，可先用0.9％的生理盐水洗涤两次，离心速度为

800--1000r/min，每次5min，再用0.6mol/L的甘露醇或蔗糖液洗涤两次，每次600--800r/min，

离心5min，最后用甘露醇调整成每毫升含瘤细胞1×105个。

三、细胞电融合方法

1、仪2S结构和使用方法

JCF-型细胞电融事仪的各项技术参数是通过大量的融合实验数据，并参考岛津公司(日)SSH

型电融合装置的参数值而设计的．当打开电源，指示灯亮，并拨通输出开关和正弦输出开关，

选择和按下正弦频率按键(共分为0.6、0.8、1.3、1.5MHz五档)，此时将输出电缆与示波器

相接，在示波器上即出现高频正弦波形，当左右旋转正弦幅度旋钮，则正弦电压的p-p值，

也随之降低和升高，如果将输出电缆与电融合室相接，则细胸相互连接．此时再旋动正弦幅

度(即正弦电压)旋扭，则仪器上电压表指针随之升高和降低．如果正弦电压过高，则细胞连

接速度加快，并呈串珠状，不利于两细胞融合。

将正弦输出开关搬至“复合输出”档，根据所需功率大小选拔复合输出I或、II档、I档为低功

率，II档为高功率；再根据实验要求，选择并按下你所需要的“脉冲宽度”拨键(分1ms，0.2ms、

0.1ms、10ms、1us五档)和“脉冲幅度”按键(50V、100V、150V、200V、250V五档)，还

配有脉冲幅度旋扭(细调)，调整范围0-50V，可使每档增值50V。

施加脉冲刺激可分为“自控”和“手控”两档，当使用“自控”输出脉冲时，先将开关搬向自控档，

然后根据需要选择并按下“脉冲频率按健”(分为2sl次及每秒1次、2次、5次、l0次共五档)，

即可自动发送电脉冲；如果将开关搬至“手控”档，需按动“手控”按扭，每按动一次发送一个

脉冲。无论自控或手控输出，每个脉冲输出都伴有报鸣音响，将输出端与脉冲示波器连接，

则可观察到由脉冲宽度、幅度及脉冲间隔所构成的示波图像，当改变以上有关参数值时，其

图像亦发生变化：把开关搬向反向，则产生负脉冲，当脉宽和幅度等值不变时，其图像与正

脉冲波形相同，但方面相反，上下对称．将电缆输出端与电融合室的两电极相接，并按上述

要求发送一定方波脉冲，细胞受到电刺激后，可产生融合。

2、电融合操作

植物原生质体融合

开启电源，关闭“输出开关”，将开关搬向正弦输出档，此时可根据实验需要，将正弦额度选

择在1—1.3MHz，脉冲宽度为0.1ms或)10μs，脉冲幅度为150V，脉冲频率为1次/s，并依

次按下各标定按键，最后调整正弦电压(即正弦幅度)旋扭，使电压表处于5-10V处。