结核分枝杆菌Rv2626c基因的表达、纯化和鉴定

第９卷第８期２００９年４月　１６７１—１８１９（２００９）８－２０５１－０５　科学技术与工程　＠Ｖｏ１．９　Ｎｏ．８　Ａｐｒ．２００９　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　２００９　Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．Ｅｎｇｎｇ．　医药卫生　结核分枝杆菌Ｒｖ２６２６ｃ基因的表达、纯化和鉴定　张薇王丽梅　柏银兰康健何俊杰徐志凯　（第四军医大学微生物学教研室，西安７１００３２）　摘要克隆结核分枝杆菌Ｒｖ２６２６ｃ基因，构建其原核表达载体，并进行表达、纯化及鉴定。采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法从　结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ基因组中扩增出Ｒｖ２６２６ｃ基因片段，克隆入ｐＭＤ１８一Ｔ载体，序列测定正确后亚克隆入原核表达载体　ｐＰｒｏ．ＥＸＨＴｂ，转化入Ｅ　Ｃｏｌｉ　ＤＨ５ｏｔ，经ＩＰＴＧ诱导表达，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析后与抗Ｈｉｓ单抗进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ，以Ｎｉ—ＮＴＡ亲和层析　纯化目的蛋白。ＰＣＲ扩增获得的目的基因为４３２ｂｐ，与预期大小一致，测序与Ｇｅｎｅｂａｎｋ公布的基因序列完全一致。成功构建　原核表达载体ｐＰｒｏ．ＥＸＨＴｂ－２６２６ｃ，转化Ｅ　Ｃｏｌｉ　ＤＨ５ｃｔ后能特异性表达目的蛋白，大小约１６ＫＤ，与理论值相一致。蛋白可溶性　分析表明该蛋白主要以可溶性方式存在，纯化蛋白经Ｗｅｓｔｅｒｎ．ｂｌｏｔ鉴定有特异性反应条带。成功构建结核分枝杆菌Ｒｖ２６２６ｃ　原核表达载体ｐＰｒｏ—ＥＸＨＴｂ－２６２６ｃ，并获得纯化的目的蛋白，为研究新型结核疫苗的靶抗原奠定了基础。　关键词结核分枝杆菌　抗原　原核表达　纯化　中图法分类号Ｒ３７８．９１１；　文献标志码Ａ　目前全球约１／３人口持续感染结核分枝杆菌　（ＭＴＢ），我国约有４亿ＭＴＢ持续感染者，其中　５％一１Ｏ％有可能发展为活动性结核病（ＴＢ），是ＴＢ　１材料与方法　１．１材料　的重要来源和传染源　。ＭＴＢ以休眠状态在体　内长期存在是造成ＭＴＢ持续感染的重要原因　。　ＭＴＢ毒株Ｈ３７Ｒｖ基因组ＤＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ｅｔ和　研究发现，ＭＴＢ在休眠状态时，其基因组中由ＭＴＢ　的休眠调节子ＤｏｓＲ（ｄｏｒｍａｎｃｙ　ｒｅｇｕｌｏｎ）调控的４８个　编码基因被特异性的上调转录表达，其特异性表达　的蛋白称为持续感染期抗原（１ａｔｅｎｃｙ　ａｎｔｉｇｅｎｓ）或　ＤｏｓＲ抗原　Ｊ。Ｒｖ２６２６ｅ是上述ＭＴＢ在休眠期特异　表达的蛋白之一，表达纯化该蛋白有助于进一步研　ｐＰｒｏ—ＥＸ　ＨＴｂ质粒均为本室保存；ｒＴａｑ　ＤＮＡ聚合　酶，ｄＮＴＰｓ，Ｔ４　ＤＮＡ连接酶，ＨｉｎｄⅢ，ＢａｍＨＩ，ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＩ２０００，ｐＭＤ１８一Ｔ载体购自Ｔａｋａｒａ公司；　ＤＮＡ片段胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自　Ｏｍｅｇａ公司；Ｎｉ—ＮＴＡ亲和层析柱购自ＱＩＡＧＥＮ公　司。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠ＩｇＧ、６×Ｈｉｓ单　究其生物学特怅免疫学特性及与ＭＴＢ休眠的关　系，并将为ＴＢ的诊断和防治的靶抗原筛选奠定研　究基础。　２００８年１２月３０日收到　国家自然科学基金（３０８０１０５５）、　（３０５００４３２）资助　第一作者简介：张　薇（１９７７～），女，博士，讲师，主治医师。　Ｅ—ｍａｉｌ：ｖｉｖｉａｎ＠ｆｍｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。　克隆抗体购自北京天根公司。　ｌ－２方法　１．２．１　引物设计　根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ公布的ＭＴＢ　Ｒｖ２６２６ｃ全基因序　列如下设计引物，上游：５’一ＣＧ　ＧＧＡＴＣＣ　ＡＴＧ　ＡＣＣ　ＡＣＣ　ＧＣＡ　ＣＧＣ－３’，含ＢａｍＨ　Ｉ酶切位点；下游：５’一　ＡＧＣ　ＡＡＧＣＴＦ　ＣＴＡ　ＧＣＴ　ＧＧＣ　ＧＡＧ　ＧＧＣ－３’，含Ｈｉｎｄ　Ⅲ酶切位点。均由北京鼎国公司合成。　１．２．２　Ｒｖ２６２６ｃ基因的扩增、克隆及测序　通信作者简介：徐志凯，博士生导师，教授。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｉｋａｉｘｕ＠ｆｍ—　ｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；Ｔ丽梅，博士，讲师。Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｍｗａｎｇ＠ｔｏｍ．ｃｏｒｎ。　以ＭＴＢ　Ｈ３７Ｒｖ菌株的基因组ＤＮＡ为模板，进　２０５２　科学技术与工程　９卷　行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应体系为：１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　５　Ｌ，ｄＮＴＰｓ　２　Ｌ（２．５　ｍｍｏＬ／Ｌ　，ＤＮＡ模板１　Ｌ，上　１０　ｍｉｎ，分别收集上清及沉淀制样，进行１２％ＳＤＳ．　ＰＡＧＥ分析目的蛋白的可溶性。根据目的蛋白的可　溶性分析结果，使用ＱＩＡＧＥＮ公司的Ｎｉ—ＮＴＡ纯化　试剂盒纯化目的蛋白。取诱导菌超声裂解的上清，　下游引物各１　Ｌ及ｒＴａｑ酶０．５　Ｌ，加水至５０　Ｌ。　ＰＣＲ条件：９５℃变性５　ｍｉｎ，９４℃１５　Ｓ，５８℃３０　ｓ，７２％　５０　ｓ，共３０个循环，７２℃延伸５　ｍｉｎ。所获得ＰＣＲ扩　增片段经琼脂糖凝胶电泳回收后克隆人ｐＭＤ１８一Ｔ　用Ｎｉ—ＮＴＡ亲和色谱纯化，洗脱液洗脱吸附蛋白。　将收集的洗脱液用ＰＢＳ　４℃透析后，一２０℃保存　载体，ＢａｍＨ　Ｉ和ＨｉｎｄⅢ双酶切鉴定，阳性克隆命名　为ｐＭＤ１８一Ｔ—Ｒｖ２６２６ｅ，序列测定由北京奥科生物技　术有限公司完成。　１．２．３　目的基因的原核表达载体构建　用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄｌＩＩ双酶切ｐＭＤ１８一Ｔ－　Ｒｖ２６２６ｃ，回收的目的片段与同样酶切的ｐＰｒｏ—　ＥＸＨＴｂ载体连接，转化Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ感受态细胞。　随机挑选２个菌落，分别接种于５　ｍＬ含１００￣ｇ／ｍＬ　氨苄青霉素的ＬＢ培养液，３７℃振荡培养过夜。碱　裂解法提取质粒ＤＮＡ，用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄｌＩＩ双酶切，　琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒，阳性克隆命名为　ｐＰｒｏ—ＥＸ　ＨＴｂ—Ｒｖ２６２６ｃ。　１．２．４重组质粒的诱导表达　将含重组质粒ｐＰｒｏ．ＥＸＨＴｂ—Ｒｖ２６２６ｃ的单个菌　落接种于含氨苄青霉素（１００　ｒａｇ／Ｌ）的ＬＢ培养液　中，３７￣Ｃ振荡培养过夜。次日取５０　加到５　ｍＬ含　氨苄青霉素的ＬＢ培养液中，３７℃振摇至Ａ６００ｎｍ＝　１，留下诱导前对照样本后，加入ＩＰＴＧ至终浓度为　１　ｍｍｏＬ／Ｌ，３７￣Ｃ诱导３　ｈ后集菌，以２×凝胶加样缓　冲液５０　Ｌ悬浮，煮沸１０　ｍｉｎ，离心后取１０　Ｌ上清　进行１２％ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析。　１．２．５　目的蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ分析　将上述制备的样品进行１２％ＳＤＳ—ＰＡＧＥ后以　０．１５　ｍＡ恒流电转２　ｈ转至硝酸纤维素膜上。用　５０　ｇ／Ｌ脱脂奶封闭２　ｈ，ＰＢＳ洗涤后加抗Ｈｉｓ的单克　隆抗体（１：５　０００稀释）４￣Ｃ过夜，ＰＢＳ洗涤后加入　ＨＲＰ标记的羊抗鼠ＩｇＧ抗体，３７℃孵育１　ｈ。ＰＢＳ洗　涤后ＤＡＢ显色观察结果。　１．２．６　目的蛋白的可溶性分析及纯化　阳性重组菌的诱导表达方法按上述步骤进行，　体积扩大至１００　ｍＬ。取２　ｍＬ诱导后的菌液集菌，　ＰＢＳ１００　Ｌ重悬，超声裂解后１０　０００　ｒ／ｍｉｎ离心　备用。　２结果　２．１　Ｒｖ２６２６ｃ基因的扩增、克隆及测序　以ＭＴＢ　Ｈ３７Ｒｖ基因组ＤＮＡ为模板，用合成的　Ｒｖ２６２６基因引物进行ＰＣＲ扩增，成功扩增出与预　期一致的目的基因片段，大小为４３２　ｂｐ。将ＰＣＲ扩　增产物与ｐＭＤ１８一Ｔ载体连接并进行测序（图１），测　序结果表明目的基因序列与ＧｅｎＢａｎｋ公布的序列　完全一致。　Ｍ　２　０００　ｌ　０００　７５０　５００　２５０　１００　Ｍ—ＤＮＡ　ｍａｋｅｒ　ＤＬ２０００；１一日。ｍＨ　Ｉ和Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌ双酶切重组质粒　ｐＭＤ１８－Ｔ—Ｒｖ６２６ｅ；２－－Ｒｖ２６２６ｃ基因的ＰＣＲ产物　图１　Ｒｖ２６２６ｃ基因ＰＣＲ产物和重组质粒　ｐＭＤ１８一Ｔ—Ｒｖ２６２６ｃ酶切鉴定　２．２原核表达载体的构建及表达　将测序正确的阳性克隆质粒经酶切后与同样　酶切的原核表达载体ｐＰｒｏ—ＥＸＨＴｂ连接，转化Ｅ．ｃ０一　如ＤＨ５ａ感受态细胞，随机挑选２个阳性克隆进行　酶切鉴定，结果均可切出与预期一致的４３２　ｂｐ基因　片段，阳性重组质粒命名为ｐＰｒｏ—ＥＸＨＴｂ－Ｒｖ２６２６ｅ　（图２）。用ＩＰＴＧ诱导蛋白表达，含ｐＰｒｏ—ＥＸＨＴｂ—　８期　张薇，等：结核分枝杆菌Ｒｖ２６２６ｃ基因的表达、纯化和鉴定　２０５３　Ｒｖ２６２６ｃ质粒的重组菌诱导后在蛋白分子量约　１６ｋＤ处有明显特异性蛋白条带，与预期大小一致，而　空载体菌和未诱导菌均无此特异性表达条带（图３）。　２　Ｏ　Ｏ　０　Ｏ　４　Ｈ　４　２　０００　ｌ　０００　７５０　５００　２５０　１ＯＯ　Ｍ－－ＤＮＡｍａｒｋｅｒ　ＤＩ２０００：１—　ｍＨ　Ｉ和Ｈｉｎｄｍ　双酶切重组质粒ｐＰｒｏ—ＥＸＨＴｂ—Ｒｖ２６２６ｃ　图２重组质粒ｐＰｒｏ－ＥＸＨＴｂ－Ｒｖ２６２６ｅ双酶切鉴定　Ｍ　０　２　Ｏ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　４　４　ＫＤａ　Ｍ　ｌ　２　３　Ｍ一蛋臼分垣“Ｈｄ　；ｌ一诱导　奎｜．戋体匿；２＿未　｝的ｐＰ￣ＥＸｌｆｌｂ－２ｆｉ２６ｃ　质粒重组菌；３诱导的ｐＰｒｏ—ＥＸＨＴｂ－２６２６ｃ质粒重组菌　图３诱导表达产物的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析　２．３　目的蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析　ｐＰｒｏ—ＥＸ　ＨＴｂ是含有６×Ｈｉｓ的原核表达载体，　因此ｐＰｒｏ—ＥＸ　ＨＴｂ—Ｒｖ２６２６ｃ重组载体所表达的目的　蛋白是含有６×Ｈｉｓ的融合蛋白。用鼠源性的６×　Ｈｉｓ单克隆抗体为一抗，羊抗鼠的ＩｇＧ为二抗进行　目的蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ分析，结果在蛋白分子质量　约１６ｋＤ处有特异性印迹条带（图４）。　２．４　目的蛋白的纯化　蛋白可溶性分析表明，目的蛋白主要以可溶性　Ｍ一蛋白分子量ｍａｒｋｅｒ；１－－空载体菌；２一诱导表达产物　图４表达产物的Ｗｅｓｔｅｎｒ—ｂｌｏｔ鉴定　形式存在于菌体上清中（图５）。用Ｎｉ—ＮＴＡ亲和层　柱在非变性条件下纯化目的蛋白，经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分　析和凝胶薄层扫描显示，纯化蛋白纯度达到９０％以　上（图６）。　锄　如如　Ｈ　“　・一１６ＫＤ　Ｍ一蛋白分子量ｍａｒｋｅｒ；１—诱导菌超声裂解后沉淀；　２一诱导菌超声裂解后上清　图５融合蛋白的可溶性分析　Ｍ一蛋白分子量ｍａｒｋｅｒ；１，２－－Ｒｖ２６２６ｃ纯化蛋白　图６纯化蛋白的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析　２　●　Ｏ科学技术与工程　９卷　３讨论　有效控制长期处于持续感染状态的ＭＴＢ是目　前ＴＢ防治的关键，而造成机体长期处于结核持续　将之用于ＴＢ的的新型疫苗研究和诊断试剂等方面　奠定了基础。　参考文献　感染状态是由于ＭＴＢ在体内长期以休眠菌状态存　在　』。ＭＴＢ休眠菌可特异性表达与休眠相关的蛋　白。Ｖｏｓｋｕｉｌ等人　研究发现，ＭＴＢ在休眠状态时即　微氧，厌氧或低浓度的ＮＯ条件下，其基因组中的４８　个编码基因被特异性的上调转录表达，由ＭＴＢ的休　眠调节子ＤｏｓＲ调控，其特异性表达的４８个蛋白称　为持续感染期抗原或ＤｏｓＲ抗原。Ｓｈｉ等人　研究　也发现当ＭＴＢ处于持续感染期或进入非增殖状态　１　Ｆｌｙｎｎ　Ｊ　Ｌ．Ｃｈａｎ　Ｊ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：ｌａｔｅｎｃｙ　ａｎｄ　ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍ—　ｍｕｎ，２００１；６９（７）：４１９５—４２０ｌ　２刘剑君，幺鸿雁．我国结核病的流行现状和防治对策．预防医学　论坛，２００６；１２（５）：６３８—６４Ｏ　３　Ｆｉｎｅ　Ｐ　ＥＭ．Ｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ＢＣＧ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆａｎｄｆｏｒ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｌａｎｃｅｔ，１９９５；３４６（８９８６）：１３３９－－１３４５　４　ＶｏｓｋｕｌｌＭＩ，ＳｃｈｎａｐｐｉｎｇｅｒＤ，ＶｉｓｃｏｎｔｉＫ　Ｃ，ｅｔ　．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆｒｅｓｐｉ—　ｒ￣ｉｏｎ　ｂｙ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ａ　Ｍｙｃｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｄｏｒｍａｎｃｙ　ｐｒｏｇｒａｍ．Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ，２００３；１９８（５）：７０５—７１３　５　Ｓｈｉ　Ｌ，Ｊｕｎｇ　Ｙ　Ｊ，Ｔｙａｇｉ　Ｓ，ｅｔ　ａ／．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆＴｈｌ・ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｍｕｎｉｙ　ｔ时，其在感染早期或增殖期高度表达的一些抗原　（如Ａｇ８５Ｂ）的表达是减少的，而此时则出现一些与　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｌｕｎｇｓ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ａ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｔｒａｎｓｃｆｉｐｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　ｏｆ　ｎｏｎｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ．ＰＮＡＳ，２００３；１００　休眠相关的抗原的大量表达，这些抗原即为前述的　休眠相关抗原或称持续感染期抗原，这些抗原对体　（１）：２４１—＿２４６　６　Ｌｅｙｔｅｎ　ＥＭ，ＬｉｎＭＹ，ＦｒａｎｋｅｎＫＬ，ｅｔ　ａ１．ＨｕｍａｎＴ—ｃｅｌｌｒｃｓｐｏｎｓｅｓｔｏ　内ＭＴＢ休眠菌的存活是必须的。Ｌｅｙｔｅｎ等人【６　以　４８个持续感染期抗原刺激ＭＴＢ持续感染者的Ｔ细　胞，发现包括Ｒｖ２６２６ｃ在内的８个抗原可强烈地刺　２５　ｎｏｖｅｌ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｂｙ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｏｒｍａｎｃｙ　ｒｅｇｕｌｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏ－　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ　Ｉｎｆｅｃｔ，２００６；８（８）：２０５２－－２０６０　７　Ｒｏｕｐｉｅ　Ｖ，Ｒｏｍａｎｏ　Ｍ，Ｚｈａｎｇ　Ｌ，ｅｔ　．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｅｉｔｙ　ｏｆ　ｅｉｇｈｔ　ｄｏｒ－　ｍａｎｃｙ　ｒｅｇｕｌｏｎ—ｅｎｃｏｄｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｍｙｅｏｂａｃｔｅｒｉｍ　ｔｕｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｉｎ　ＤＮＡ—ｖａｃｃｉｎａｔｄ　ａｅｎｄ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ｉｎｆｃｔｅｅｄ　Ｍｉｃｅ．　Ｉｎｆｃｔ／ｅｎｎｎｕｎ，　激ＭＴＢ持续感染者的Ｔ细胞增殖，释放ＩＦＮ．＾ｙ和　ＩＬ－２。小鼠实验表明，ＭＴＢ持续感染的小鼠对　Ｒｖ２６２６ｃ可产生强烈的１１１１型的免疫应答　。因　２００７；７５（２）：９４１—９４９　８　Ｗａｎｇ　Ｌｉｍｅｉ，Ｓｈｉ　Ｃｈａｎｇｈｏｎｇ，Ｆａｎ　Ｘｉｏｎｇｌｉｎ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｅｘ－　此，筛选有效的持续感染期抗原作为ＴＢ新型疫苗　的候选抗原将对控制持续性的ＭＴＢ感染起着重要　作用，而Ｒｖ２６２６ｃ等则是其中的主要免疫优势抗原。　因此，克隆了Ｒｖ２６２６ｃ基因构建了其原核表达　载体，并成功地在Ｅ．ｃｏｌｉ表达，获得了纯度较高的纯　化蛋白。Ｒｖ２６２６ｃ蛋白的成功表达和纯化为下一步　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｙ　ｔｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｍｙｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｅｄｓ　ｂａ—　ｅｉＵｕｓ　ｃａｌｍｅｔｔｅ—ｇｕｅ　ｉｎ　ｓｔｆｒａｉｎｓ　ｓｅｃｒｅｔｉｎｇｔｈｅａｎｔｉｇｅｎ　ＥＳＡＴ￣ｆｒｏｍＭｙ—　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｌｏｓｉｕｓ．Ｃｈｉｎ　Ｍｅｄ　Ｊ（Ｅａｒ１），２００７；１２０（４）：　ｌ２２Ｏ—ｌ２２５　９师长宏，安家泽，王晓武，等．表达Ａｇ８５Ｂ—ＥＳＡＴ６的重组ＢＣＧ在　小鼠体内诱导的免疫应答及保护力．中华结核和呼吸杂志，　２００６；２９（１１）：７８８—＿７８９　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｖ２６２６ｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＺＨＡＮＧ　Ｗｅｉ，ＷＡＮＧ　Ｌｉ—ｍｅｉ　，ＢＡＩ　Ｙｉｎ—ｌａｎ，ＫＡＮＧ　Ｊｉａｎ，ＨＥ　Ｊｕｎ－ｊｉｅ，ＸＵ　Ｚｈｉ—ｋａｉ’　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｍｉｔｙ，Ｘｉ’ａｌｌ　７１００３２，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｔｈｅ　Ｒｖ２６２６ｅ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｈ３７Ｒｖ　ｗａｓ　ｉｆｒｓｔｌｙ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ｆｒｏｍ　ｇｅｎｏｍｅ　０ｆ　Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｈ３７Ｒｖ　ｓｔｒａｉｎ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＭＤ１８一Ｔ　ｖｅｃｔｏｒ．Ａｆｔｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ。ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｄｉｇｅｓ。　ｔｅｄ　ｂｙ　ＢａｍＨＩ　ａｎｄ　Ｈ／ｎｄ　ＩＩ１　ｗａｓ　ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＰｒｏ—ＥＸＨＴｂ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　８期　张薇，等：结核分枝杆菌Ｒｖ２６２６ｃ基因的表达、纯化和鉴定　２０５５　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５　ａ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ　ｕｓｉｎｇ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ—　ｂｏｄｙ　ａｇａｉｎｓｔ　６　ｘ　Ｈｉｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　６　ｘ　Ｈｉｓ　ｆｕｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｐｕｒｉｉｅｄ　ｂｙ　Ｎｉ—ＮＴＡ　ｐｕｒｆｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｈｅ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｔ　ｗａｓ　４３２　ｂｐｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｃａｌ　ｔｏ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｖ２６２６ｃ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅ　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ，ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ．Ｉｎ　Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ．ａ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂａｎｄ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈ　６×Ｈｉｓ　ｍＡｂ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅ　ｗｉｈ　ｒｔｅｌａｔｉｖｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｒ　ｍａｓｓａ　ｏｆ　１６　ｋＤａ．Ｉｔ　ｉｓ　ｅｖｉｄｅｎｔ　ｔｈａｔ　ｈｅ　Ｒｖ２６２６ｃ　ｐｒｔｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓ—　ｆｕｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｏｆ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ．ａｎｄ　ｉｔ　ｍａｙ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｎｏ－　ｖｅｌ　ｖａｃｃｉｎｅ　ａｇａｉｎｓｔ　ＴＢ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＭＴＢ）　ａｎｔｉｇｅｎ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　（上接第２０４６页）　１６Ｓ　ｒＤＮＡ　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ　ｏｆ　Ａｄｈｅｒｅｎｔ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｓｕｒｆａｃｅｓ　ｏｆ　Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａ　ｉｎ　Ｑｉｎｇｄａｏ　Ｓｅａ　ＬＩＵ　Ｊｉｅ，ＷＡＮＧ　Ｘｉａｏ—ｓｈａｎ，ＷＡＮＧ　Ｎｅｎｇ—ｆｅｉ　，ＣＨＥＮ　Ｚｈｕｏ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｃｈｎｏｌｅｏｇｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｑｉｎｇｄａ０　２６６０４２，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ；　Ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ，Ｓｔａｔｅ　Ｏｃｅａｎｉｃ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６０６１，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｅｉｇｈｔｅｅｎ　ａｄｈｅｒｅｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｈｅ　ｓｕｒｔｆａｃｅｓ　ｏｆ　Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａ　ｇｒｏｗｎ　ｉｎ　Ｑｉｎｇ—　Ｄａｏ　ｓｅａ，ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　１６Ｓ　ｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ｓｔａｔｅ　ｏｆ　ａｄｈｅｒｅｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｅｃｌｉｎｅ　ｐｈａｓｅ　ｏｆ　Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ　ｐｒｏｌｉｆｅｒ　ａｒｅ　ｕｎｄｅ￣ｔｏｏｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｓｅｖｅｎ　ｓｔｒａｉｎｓ　ａｒｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｉｎ　ｆｏｕｒ　ｇｅｎｕｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｆａｍｉｌｙｓ　ｉｎ　ｏｔ－ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｓｅｖｅｎ　ｓｔｒａｉｎｓ　ａｒｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｒｅｅ　ｇｅｎｕｓ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｆａｍｉｌｙｓ　ｉｎ　Ｔ－ｐｒｏ—　ｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｆｏｕｒ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｂｅｌｏｎｇ　ｔｏ　ｔｈｒｅｅ　ｇｅｎｕｓ　ｏｆ　Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　ａｎｄ　Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｆｏｒ　ｉｔｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｏｆ　１６Ｓ　ｒＤＮＡ　ｗｅｒｅ　ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　９７％ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｔｏ　ｏｔｈｅｒ　ｓｐｅｃｉｅｓ，　ｓｔｒａｉｎｓ　ＱＤＨＴ一１，ＱＤＨＴ－５，ＱＤＨＴ－７　ａｎｄ　ＱＤＨＴ一１　３　ｗｏｕｌｄ　ｂｅ　ｎｅｗ　ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｔｈｉｓ　ｒｅｓｕｌｓｔ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ　ｔｈａｔ，ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｅｃｌｉｎｅ　ｐｈａｓｅ　ｏｆ　ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａ，ｔｈｅｒｅ　ｈａｖｅ　ｇｒｅａｔ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｉｔｓ　ａｄｈｅｒｅｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ　ｐｒｏｌｆｉｅｒａ　ａｄｈｅｒｅｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　（上接第２０５０页）　ｐｌａｓｍｉｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ａｆｔｅｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｂｙ　Ｇ４１８，ｔｈｅ　Ｐ８１５　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｔｏ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ＭＰＴ６４　ｓｔａｂｌｙ．Ｔｈｅ　ｍｐｔ６４　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭＰＴ６４　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｈｅ　ａｉｔｍ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｂｏｕｔａ　２６　ｋＤａ．Ｉｔ　ｉｓ　Ｃｏｎｃｌｕｓｅｄ　ｔｈａｔ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　ｓｔａｂｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｍｐｔ６４　ｇｅｎｅ　ａｒｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｓｕｅ－　ｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ａｎｄ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｏｒｆ　ｔｈｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｙ　ｏｒ　ｆｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｖａｃｃｉｎｅｓ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ａｒｐｔ６４　ｃｅｌｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ