双缩脲法测定蛋白质含量

学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。

二、实验原理

在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1～10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

三、实验试剂和器材

[试剂]

1．双缩脲试剂： 取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加2.5mol／L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。

2．标准蛋白质溶液： 用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。

[器材]

1．试管：15×150mm 试管7只； 2．1ml，5ml移液管； 3．坐标纸 ； 4．721分光光度计。

四、实验操作

取试管7支，编号，按下表操作： 试剂(ml)\\空白管 1 管号 蛋白标准- 0.1 2 0.2 3 0.3 4 0.4 5 0.5 测定管 – 液（10g/L） 生理盐水 待测样品 双缩脲试剂 相当蛋白质（g/L） 0.5 - 3.0 0 0.4 - 3.0 10 0.3 - 3.0 20 0.2 - 3.0 30 0.1 - 3.0 40 - - 3.0 50 0.4 0.1 3.0 - 混匀，37℃水浴20分钟，冷却至室温，在分光光度计波长540nm处，用空白管调零，读取各管吸光度值。1～5为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。以测定管的吸光度，在标准曲线上求得蛋白质浓度。

[注意事项]

1．双缩脲试剂中，加入酒石酸钾钠，Cu2+

形成稳定的络合铜离子，以防止CuSO4·5H20不稳定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸钾钠与CuSO4·5H20之比不低于3∶1，加入KI作为抗氧化试剂。

2．双缩脲试剂要封闭贮存，防止吸收空气中的二氧化碳。

3．本法各种蛋白质的显色程度基本相同，重复性好，几乎不受温度影响，唯一缺点是灵敏度较低。

4．黄疸血清、严重溶血对本法有明显干扰。 [思考题]

1．双缩脲法测定蛋白质的原理是什么?其它还有什么方法测定蛋白质的含量? 2．请用双缩脲法，设计一个测定蛋白质含量的定量方法(除标准曲线法外)。