*CN102641508A*
(10)申请公布号 CN 102641508 A(43)申请公布日 2012.08.22
(12)发明专利申请
(21)申请号 201210130904.7(22)申请日 2012.05.01
(71)申请人浙江大学
地址310027 浙江省杭州市西湖区浙大路
38号(72)发明人谢立平 杨凯 郑祥毅 陈弘
林奕伟 毛祺琦 秦杰 金勇丰(74)专利代理机构杭州求是专利事务所有限公
司 33200
代理人张法高 赵杭丽(51)Int.Cl.
A61K 48/00(2006.01)C12N 15/113(2010.01)A61P 35/00(2006.01)
(54)发明名称
靶向上调PAR-4基因小RNA在制备抗膀胱癌药物中的应用(57)摘要
本发明提供一种靶向上调PAR-4基因的小RNA在制备抗膀胱癌药物中的应用。所述靶向上调PAR-4基因的小RNA的核苷酸序列为6条21个核苷酸的正义链和反义链组成。每条链的3’端均悬挂突出两个核苷酸（通常为dTdT，中间19个核苷酸配对）。本发明包含多种序列的saRNA，这些小RNA能够通过靶向上调膀胱癌细胞中PAR-4基因的表达，抑制肿瘤细胞活力、诱导细胞凋亡，进而可以应用于抗膀胱癌药物的制备。本发明制备saRNA操作简单，成本低，用量少，50nM的转染浓度即可达到良好的激活效果，激活作用确切，靶基因mRNA和蛋白水平均有升高。另外saRNA诱导基因表达不破坏基因组的完整性，应用安全。
权利要求书 1 页 说明书 5 页权利要求书1页 说明书5页
序列表 3 页 附图 3 页序列表3页 附图3页
CN 102641508 ACN 102641508 A
权 利 要 求 书
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1.一种靶向上调PAR-4基因的小RNA在制备抗膀胱癌药物中的应用，所述靶向上调PAR-4基因的小RNA的核苷酸序列为6条21个核苷酸的正义链和反义链组成，其序列分别为：dsPAR-4-433 S：5’-AAU ACG GUC UUG UAC UUA A[dT][dT] -3’，dsPAR-4-433 AS：5’-UUA AGU ACA AGA CCG UAU U[dT][dT] -3’；dsPAR-4-434 S：5’-UAA UAC GGU CUU GUA CUU A[dT][dT] -3’，dsPAR-4-434 AS：5’-UAA GUA CAA GAC CGU AUU A[dT][dT] -3’； dsPAR-4-435 S：5’-AUA AUA CGG UCU UGU ACU U[dT][dT] -3’，dsPAR-4-435 AS：5’-AAG UAC AAG ACC GUA UUA U[dT][dT] -3’。
2.根据权利要求1所述的一种靶向上调PAR-4基因的小RNA在制备抗膀胱癌药物中的应用，其特征在于，每条链的3’端均悬挂突出两个核苷酸dTdT，中间19个核苷酸配对。
3.根据权利要求1所述的一种靶向上调PAR-4基因的小RNA在制备抗膀胱癌药物中的应用，其特征在于，所述药物还有制剂允许的赋形剂。
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说 明 书
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靶向上调PAR-4基因小RNA在制备抗膀胱癌药物中的应用
技术领域
[0001]
本发明属于生物技术领域，涉及靶向上调PAR-4基因的小激活RNA在制备抗膀胱
癌药物中的应用。
背景技术
[0002] 2006 年Li等报道靶向基因启动子区的dsRNA(双链RNA,double-stranded RNA)能引起序列特异性的基因转录激活，并把此现象命名为RNA引起的基因激活(RNA activation,RNAa)，而把这样的dsRNA称为小激活RNAs (small activating RNAS,saRNAs)。RNA激活基因表达是哺乳动物细胞中的普遍现象，其机制可能是短双链RNA与目的基因的反义转录产物结合，对启动子区进行表观遗传学修饰（组蛋白乙酰化、去甲基化等），进一步募集转录因子到基因的启动子区，从而增强目的基因的表达。
[0003] 人PAR-4基因首次被发现于外源性因素诱导的凋亡的前列腺癌细胞中。许多研究证明PAR-4的功能是各种细胞凋亡途径所必需的，过量异位表达的PAR-4足以诱导大多数肿瘤细胞发生凋亡，但不会导致正常或永生化细胞的凋亡。PAR-4能通过激活Fas死亡受体信号转导通路和抑制NF-kB，从而保证肿瘤细胞内caspase级联反应的发生不受干扰。更重要的是，无论是皮下异位还是原位的前列腺癌小鼠模型，瘤内注射能过量表达PAR-4的腺病毒，均能导致肿瘤凋亡和生长抑制。因此，PAR-4蛋白的表达增高具有显著的肿瘤治疗前景，是saRNAs理想的靶基因。[0004] 发明内容
本发明的目的是提供一种靶向上调PAR-4基因的小RNA在制备抗膀胱癌药物中的应用。本发明包含多种序列的saRNA，这些小RNA能够通过靶向上调膀胱癌细胞中PAR-4基因的表达，抑制肿瘤细胞活力、诱导细胞凋亡，进而可以应用于抗膀胱癌药物的制备。[0005] 所述靶向上调PAR-4基因的小RNA的核苷酸序列为3对（6条）21个核苷酸的正义链和反义链组成。其序列分别为：dsPAR-4-433 S（SEQ ID NO:1）：5’-AAU ACG GUC UUG UAC UUA A[dT][dT] -3’， dsPAR-4-433 AS（SEQ ID NO:2）：5’-UUA AGU ACA AGA CCG UAU U[dT][dT] -3’； dsPAR-4-434 S（SEQ ID NO:3）：5’-UAA UAC GGU CUU GUA CUU A[dT][dT] -3’， dsPAR-4-434 AS（SEQ ID NO:4）：5’-UAA GUA CAA GAC CGU AUU A[dT][dT] -3’； dsPAR-4-435 S（SEQ ID NO:5）：5’-AUA AUA CGG UCU UGU ACU U[dT][dT] -3’，dsPAR-4-435 AS（SEQ ID NO:6）：5’-AAG UAC AAG ACC GUA UUA U[dT][dT] -3’。每条链的3’端均悬挂突出两个核苷酸（通常为dTdT，中间19个核苷酸配对）。[0006] 本发明制备saRNA操作简单，成本较低，用量较少，50nM的转染浓度即可达到良好的激活效果；激活作用确切，靶基因mRNA和蛋白水平均有升高。另外saRNA诱导基因表达属于表观遗传学调节，不破坏基因组的完整性，因此应用较为安全。附图说明
[0007]
图1是不同位点dsRNAs对T24细胞内PAR-4 mRNA表达的影响，GAPDH表达量作
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说 明 书
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为内参。
图2是不同位点dsRNAs对T24细胞内PAR-4 mRNA表达的影响程度，数据为PAR-4/
GAPDH比值，来源于3次独立实验的平均值。
[0009] 图3是dsPAR-4-435上调T24细胞内PAR-4蛋白的表达，β-actin表达量作为内参。
[0010] 图4是dsPAR-4-435上调T24细胞内PAR-4蛋白的表达，数据为PAR-4/β-actin比值，来源于3次独立实验的平均值。
[0011] 图5是dsPAR-4-435上调T24细胞内PAR-4蛋白的表达呈浓度依赖性，β-actin表达量作为内参。
[0012] 图6是dsPAR-4-435上调5637细胞内PAR-4蛋白的表达，β-actin表达量作为内参。
[0013] 图7是dsPAR-4-435上调5637细胞内PAR-4蛋白的表达，数据为PAR-4/β-actin比值，来源于3次独立实验的平均值。
[0014] 图8是dsPAR-4-435抑制T24细胞的生长，细胞图像由Olympus倒置相差显微镜在放大100倍情况下拍摄。
[0015] 图9是dsPAR-4-435抑制5637细胞的生长，细胞图像由Olympus倒置相差显微镜在放大100倍情况下拍摄。
[0016] 图10是MTT法提示dsPAR-4-435能明显抑制T24细胞活性，并呈浓度和时间依赖性；数据以平均值±标准差表示。
[0017] 图11是流式细胞仪检测提示dsPAR-4-435能诱导T24细胞发生凋亡。
[0008]
具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说
明，但这些具体实施方案不是要以任何方式限制所要求保护的发明范围。[0019] 实施例1 dsRNAs上调PAR-4的表达
实验方案：1．细胞系：人膀胱癌细胞株T24、5637（上海细胞所）2．dsRNAs合成：dsRNAs均由上海吉凯生物技术有限公司化学合成。[0020] 3．实验分组：50nM的dsPAR-4组、对照组dsRNA（dsCon），与已知人基因组序列非同源。
[0021] dsControl: 正义链, 5’-ACU ACU GAG UGA CAG UAG A[dT][dT]-3’（SEQ ID NO:7）
反义链, 5’-UCU ACU GUC ACU CAG UAG U[dT][dT]- 3’（SEQ ID NO:8）空白对照组（Mock，仅加入脂质体）。[0022] 4．细胞培养及转染：
细胞培养在含10％灭活新生牛血清的RPMI1640培养基中，放置于CO2含量为5％的37oC细胞培养箱内。转染前一天细胞传代后种于培养板中，密度大约30～40％。dsRNAs经过脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染入细胞，以6孔板为例（其余培养器皿根据底面积之间的比例调整试剂量），每孔取7.5µl 20mM dsRNAs储存液和5µl脂质体分别溶于
[0018]
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250µl无血清培养基，5min后混合，室温静置20min后加入培养板中，补充含血清培养基使dsRNA终浓度为50nM，作用持续48或72小时。[0023] 5．逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）：
利用 Trizol Reagent将各实验组的细胞提取总RNA ,紫外分光光度计准确定量。取3μg总RNA进行逆转录。[0024] GAPDH 上游引物：5’-ATGGCACCGTCAAGGCTGAG-3’（SEQ ID NO:9）
下游引物：5’-GCAGTGATGGCATGGACTGT-3’ （SEQ ID NO:10）PAR-4 上游引物：5’-GCCGCAGAGTGCTTAGATGAG-3’（SEQ ID NO:11）下游引物：5’-GCAGATAGGAACTGCCTGGATC-3’（SEQ ID NO:12）。[0025] PCR反应条件为：94 oC 变性4min，按下列参数循环28次：94 oC变性 45s，58 oC退火 45s，72 oC延伸 60s，最后72 oC 10min，4 oC 停止反应，后电泳。[0026] 6.蛋白印迹（Western Blot）
细胞转染72 h后，收集细胞，利用RIPA细胞裂解液提取总蛋白，BCA（二喹啉甲酸）法测定蛋白浓度，并调整待测样本的蛋白质含量。每孔加20ug的蛋白电泳、转膜、封闭，把膜放入稀释的一抗中，温和振荡3h后置4度冰箱中过夜。再温和振荡2 h ,回收一抗后在Tris缓冲液中洗膜30 min，中间更换Tris缓冲液2-3次，分别把膜置于稀释的二抗中温和振荡1h，后在Tris缓冲液中洗膜30 min，中间换液3-4次。曝光、显影及定影，用底片扫描仪扫描X线胶片，通过凝胶成像系统读取目的电泳条带的密度扫描值。[0027] 结果如下：
1.不同位点dsRNAs对T24细胞内PAR-4 mRNA表达的影响
对膀胱癌细胞T24分别转染50nM表3.2中的dsRNAs以及对照dsRNA（dsCon）并设置空白对照组，48小时后利用RT-PCR检测PAR-4的mRNA表达情况，与对照组相比，dsPAR-4-433、-434、-435作用组细胞内的PAR-4 mRNA明显增加，是对照组的3倍以上（参见图1，图2）。
[0028] 2.dsPAR-4-435上调T24细胞内PAR-4蛋白的表达
进一步通过Western Blot检测T24细胞转染72小时后各作用组细胞内PAR-4蛋白表达情况，与对照组相比，dsPAR-4-435作用组细胞内的PAR-4蛋白明显增加，是对照组的4倍以上（参见图3，图4）。
[0029] 3.dsPAR-4-435上调T24细胞内PAR-4蛋白的表达呈浓度依赖性
对T24细胞分别转染5、10、25nM的dsPAR-4-435和25nM对照dsRNA（dsCon）并设置空白对照组，利用Western Blot检测转染72小时后各作用组细胞内PAR-4蛋白表达情况，与对照组相比，10、25nM的dsPAR-4-435均能不同程度上调T24细胞内PAR-4的表达，该作用呈浓度依赖性（参见图5）。
[0030] 4.dsPAR-4-435上调5637细胞内PAR-4蛋白的表达
对膀胱癌细胞5637分别转染50nM的dsPAR-4-435和50nM对照dsRNA（dsCon）并设置空白对照组，利用Western Blot检测转染72小时后各作用组细胞内PAR-4蛋白表达情况，与对照组相比，dsPAR-4-435作用组细胞内的PAR-4蛋白明显增加，是对照组的2倍以上（参见图6，图7）。
[0031] 实施例2 dsPAR-4-435上调PAR-4对膀胱癌细胞的治疗作用
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实验方案：1.细胞系：同实施例1。[0032] 2.dsRNAs合成： 同实施例1。[0033] 3.实验分组：同实施例1。[0034] 4.细胞培养及转染：同实施例1。
5.四唑盐（MTT）比色法
取对数生长期的膀胱癌T24细胞，胰酶消化制成单细胞悬液，以每孔2000～5000个细胞的密度将细胞种于96孔培养板内（为保证结果的准确性，在实验前测定细胞的贴壁率、倍增时间以及不同接种数目细胞的生长曲线，再确定每孔细胞的接种数，以保证培养终止时细胞不至于过满），将培养板置于37oC，5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱内培养过夜后，吸去旧培养液，加入不同浓度（1～50nM）dsP21-306或dsPAR-4-435，并设立阴性对照（dsCon）和空白对照（Mock）。作用24～72小时后，每孔加入20µl MTT溶液（5 mg/ml），37oC孵育4小时后弃培养基，每孔加入DMSO 150µl，室温放置10分钟，待结晶溶解后用酶标仪在490 nm波长处测定其吸光度（OD）值。按下述公式计算细胞存活率：存活率＝治疗组OD值/对照组OD值×100%；
6.流式细胞仪检测细胞凋亡
经胰酶消化后收集50nM dsP21-306或dsPAR-4-435、dsCon以及Mock处理组24、48或72h后的细胞，4oC、2000rpm离心5分钟，弃上清液，用PBS洗涤并细胞计数，取含有1×105个细胞的悬液，4oC、2000rpm离心5分钟，弃上清液，每个样本加入100µl的1×Annexin V结合缓冲液，浓度为每毫升1×106个细胞，各加5µl PI和Annexin V后室温避光保存15分钟，然后再加400µl的1×Annexin V结合缓冲液，用Beckman Coulter FC500流式细胞仪检测，数据直接在软件中读出。结果判断：
正常存活细胞：Annexin V（－），PI（－）；位于左下象限；早期凋亡细胞：Annexin V（＋），PI（－）；位于右下象限（LR）；晚期凋亡细胞：Annexin V（＋），PI（＋）；位于右上象限（UR）；完全死亡细胞：Annexin V（－），PI（＋）；位于左上象限。[0036] 结果如下：
1. dsPAR-4-435抑制T24细胞的生长对膀胱癌细胞T24、5637分别转染50nM的dsPAR-4-435和对照dsRNA（dsCon），并设置空白对照组（Mock，仅加入脂质体），转染48或72小时后，利用Olympus倒置相差显微镜观察细胞并拍照记录。（参见图8，图9）。
[0035]
图8-9显示，在形态学方面，Mock和dsCon组的细胞在转染后保持健康快速地生长，而转染dsPAR-4-435的细胞随着时间的延长，细胞逐渐失去活性，在转染48和72小时后，细胞数量明显少于对照组，贴壁细胞大部分停止生长分裂，并出现皱缩、变形甚至死亡，但培养基中漂浮的死亡细胞没有dsP21-306作用时明显。[0038] 2.dsPAR-4-435能明显抑制T24细胞活性
为了明确dsPAR-4-435对T24细胞的生长和活性的抑制程度，我们进行了MTT试验。在96孔板中，分别对T24细胞转染各种浓度的dsPAR-4-435（5、10、25、50nM），50nM的dsCon以及设置空白对照组Mock，且每个组共设置8个复孔。参见图10，dsPAR-4-435对T24的抑
[0037]
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制作用发生在48小时之内，且低至5nM的dsPAR-4-435也有一定的抑制作用。dsPAR-4-435的抑制作用呈剂量和时间依赖性，与靶基因的调节规律相一致。5～50nM的dsPAR-4-435在转染24h时对T24细胞活性的抑制率为1.0％至10.3％，而在转染48h和72h时，其抑制率分别达到12.1％至32.3％和21.9％至62.3％（图10，表1）。
3.dsPAR-4-435能诱导T24细胞发生凋亡
利用Annexin V和PI染色，通过流式细胞仪检测研究dsPAR-4-435抑制T24细胞活性是否与细胞凋亡有关。对膀胱癌细胞T24分别转染50nM的dsPAR-4-435和对照dsRNA（dsCon），并设置空白对照组（Mock，仅加入脂质体）。如图11所示，dsPAR-4-435能诱导部分T24细胞发生凋亡。在转染72小时后，早期调亡的细胞比例（LR）和晚期凋亡的细胞比例（UR）分别增加到7.1％和20.9％，凋亡细胞比例（LR＋UR）达到28.0％，比对照组明显增多。除此之外，dsP21-306转染T24细胞24小时后坏死细胞比例也达到6.2％，存活细胞仅仅只有65.9％（参见图11）。
[0039]
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序 列 表
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<110> 浙江大学
<120> 靶向上调PAR-4基因小RNA在制备抗膀胱癌药物中的应用<160> 12
<210> 1<211> 21<212> RNA
<213> 人工序列
<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸<400> 1
AAU ACG GUC UUG UAC UUA ATT
<210> 2<211> 21<212> RNA
<213> 人工序列
<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸<400> 2
UUA AGU ACA AGA CCG UAU UTT
<210> 3<211> 21<212> RNA
<213> 人工序列
<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸<400> 3
UAA UAC GGU CUU GUA CUU ATT
<210> 4<211> 21<212> RNA
<213> 人工序列
<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸<400> 4
UAA GUA CAA GAC CGU AUU ATT
<210> 5<211> 21
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序 列 表
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<212> RNA
<213> 人工序列
<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸<400> 5
AUA AUA CGG UCU UGU ACU UTT
<210> 6<211> 21<212> RNA
<213> 人工序列
<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸<400> 6
AAG UAC AAG ACC GUA UUA UTT
<210> 7<211> 21<212> RNA
<213> 人工序列
<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸<400> 7
ACU ACU GAG UGA CAG UAG ATT
<210> 8<211> 21<212> RNA
<213> 人工序列
<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸<400> 8
UCU ACU GUC ACU CAG UAG UTT <210> 9<211> 20<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 作为GAPDH PCR扩增的上游引物<400> 9
ATG GCA CCG TCA AGG CTG AG
<210> 10<211> 20
9
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序 列 表
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<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 作为GAPDH PCR扩增的下游引物<400> 10
GCA GTG ATG GCA TGG ACT GT
<210> 11<211> 21<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 作为PAR-4基因 PCR扩增的下游引物<400> 11
GCC GCA GAG TGC TTA GAT GAG
<210> 12<211> 22<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 作为PAR-4基因 PCR扩增的下游引物<400> 12
GCA GAT AGG AAC TGC CTG GAT C
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说 明 书 附 图
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图1
图3
图2
图4
图5
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图7
图8
图9
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图10
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