松茸0288的人工培养及鉴定

Ｉ　２１０　ｉ　江苏农业科学２０１２年第４０卷第１期　郑尚永，蒋中海．松茸０２８８的人工培养及鉴定［Ｊ］．江苏农业科学，２０１２，４Ｏ（１）：２１０－２１３　松茸０２８８的人工培养及鉴定　郑尚永，蒋中海　（淮阴工学院生化学院，江苏淮安２２３００３）　摘要：以菌丝的生长速度为指标，筛选松茸０２８８的人工培养最佳培养基，采用食用菌的ＣＴＡＢ法提取出松茸的　ＤＮＡ，分析其核糖体ＩＴＳ序列，对人工培养获得的松茸子实体与天然松茸子实体进行同源性鉴定。结果表明：松茸　０２８８菌丝体在培养基Ａ［葡萄糖１０　ｇ、琼脂ｌ０　ｇ、马铃薯（去皮）１００　ｇ－，酒石酸铵０．７５　ｇ、磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ　）０．５　ｇ、硫　酸镁（ＭｇＳＯ　）０．２５　ｇ、蛋白胨１．５　ｇ］中生长速度最快，平均菌丝生长量可达０．５７５　ｍｍ／ｄ，菌丝经人ＩＳ１１化获得子实体；　经核糖体ＩＴＳ序列分析，人工培养获得的子实体与天然松茸子实体的ＩＴＳ序列具有高度同源性，其同源性达９９％。　关键词：松茸０２８８；培养基；驯化；同源性鉴定　中图分类号：￥６４６．１　５　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２—１３０２（２０１２）Ｏ１—０２１０一ｏ４　松茸（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ　ｍａｔｓｕｔａｋｅ）是一种经济价值极高的典型　培范畴，就其栽培场所而言，还不能认为是纯粹的人工栽培。　的共生型菌根菌，素有“菇中之王”的美誉。但是，作为典型　对松茸菌丝体培养的研究，不仅是了解松茸生物学及生理学　的营养共生型外生菌根菌，由于难以合成代替活树根系的营　特性的需要，也是菌种分离及人工培养的需要，更是开展各项　养和生境，所以其菌种的分离和扩繁一直是困扰食用菌工作　松茸研究的基础性工作的根本保障。　者的一个难题　－２］。目前，松茸的生态资源破坏严重，生态环　目前，国内外关于松茸营养特性，尤其是母种培养基方面　境的恶化，加之松茸共生的松树林老化等因素，各国松茸产区　的研究鲜见报道。我们将一株采自黑龙江凤凰山国家级松茸　的产量均下降明显　。要彻底解决这一状况，除了要加强松　自然保护区的松茸子实体进行菌丝体的分离培养，就不同培　茸资源的保护之外，最重要的还要依靠人工栽培方法来挽救　养基对松茸菌丝生长速度和菌落形态的影响进行研究，并利　其濒临灭绝的危险境地。为此，国内外的科学家们对松茸的　用ＩＴＳ技术　对人工培养的松茸进行ＤＮＡ分子鉴定。　人工栽培都进行了广泛而深入的研究，在野生栽培的基础上　提出半人工栽培和人工栽培两种方法，将人工培养的松茸菌　１材料与方法　种接种到松茸生长的林地　。　，就接种材料而言，属于人工栽　１．１茵种来源　供试松茸０２８８（保存在中国微生物菌种保藏中心）子实　收稿１３期：２０１１—０４—２７　体于２００２年８月８日采自黑龙江凤凰山国家级松茸自然保　基金项目：江苏省农业科技支撑计划（编号：ＢＥ２００９３０８—４）；江苏省　自然科学基金（编号：ＢＫ２００９６６０）。　护区（东经１３１。４　～１３１。１５　、北纬４４。４５　￣４５。３　）。　作者简介：郑尚永（１９７Ｏ一），男，四川仪陇人，博士，副教授，主要从事　１．２茵株分离　农业生物分子生物学研究工作。Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｈａｎｇｙｏｎｇｚｈｅｎｇ＠ｙａｈｏｏ．　选用组织分离法：取菌幕未破的松茸子实体，用无菌医用　棉签蘸无菌蒸馏水清洗子实体表面、７５％的乙醇表面消毒后，　（上接第２０９页）　［５］单人骅，佘孟兰，王铁生．中国植物志［Ｍ］．北京：科学出版社，　质是影响药材产量和品质的主要因子之一　，不同产地药材　１９９２．　质量的差异充分体现了环境对药材质量的影响　。不同地　［６］曾育麟．云南当归［Ｊ］．中国中药杂志，１９５９，５（２）：６６—６７．　点栽培云当归土壤因子变化较大，从而影响了云当归的产量　［７］张金渝，王元忠，赵振玲，等．不同产地云当归中阿魏酸的含量比　与品质。说明在进行云当归规范化种植时，应考虑选择适宜　较［Ｊ］．安徽农业科学，２００９，３７（１８）：８５６２，８５８６．　的栽培土壤以利于云当归药材质量的控制。　［８］中华人民共和国药典委员会．中华人民共和国药典：一部［Ｍ］．　北京：中国医药科技出版社，２０１０：８９．　参考文献：　［９］陈兴荣，杨永寿，陈玲．ＨＰＬＣ法测定大理马厂当归中阿魏酸的　含量［Ｊ］．云南中医中药杂志，２０１０，３１（２）：５０—５１．　［１］郭兰萍，黄璐琦．中药资源生态学［Ｍ］．上海：上海科学技术出　［１０］武延安，蔺海明，曹占凤，等．腐殖酸类有机肥对当归物质生产　版社，２００９．　及品质的影响［Ｊ］．中国中药杂志，２００８，３３（３）：２５１—２５５．　［２］闫文蓉，牛世杰，刘燕，等．丹参有效成分含量与土壤因子的关　［１１］赵杨景，陈四保，高光耀，等．道地与非道地当归栽培土壤的理　系研究［Ｊ］．中国农学通报，２００９，２５（８）：２４６—２４９．　化性质［Ｊ］．中国中药杂志，２００２，２７（１）：１９—２２．　［３］李卫建，李先恩．连翘有效成分含量与土壤养分的量化关系研究　［１２］葛月兰．当归资源化学评价与质量比较研究［Ｄ］．南京：南京中　［Ｊ］．中国中药杂志，２００５，３０（２Ｏ）：１５７７—１５８０．　医药大学，２００９．　［４］崔盛．川产乌头属植物有效成分检测及与生态因子相关性研　［１３］郭兰萍，黄璐琦．中药资源的生态研究［Ｊ］．中国中药杂志，　究［Ｄ］．成都：四川师范大学，２００６．　２００４，２９（７）：６１５—６１８．　郑尚永等：松茸０２８８的人工培养及鉴定　一２ｌｌ一　用无菌镊子撕开，用无菌解剖刀切取菌褶、菌柄黄豆粒大小的　１．７　ｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列分析　组织，放置于三角瓶内的培养基上，２Ｏ℃培养。　经测序获得的ＤＮＡ序列用ＮＣＢＩ的ＢＬＡＳＴ进行序列分　１．３菌种诱变　析，再采用ＤＮＡＳｔａｒ软件进行序列对比和鉴定。　供试松茸菌丝体在距１５　ｗ紫外灯下３０　ｃｍ处进行照射。　１．８松茸的人工驯化　期望通过紫外线照射改变松茸菌丝的生长特性以及诱导松茸　将液体培养基Ｇ与松树木屑混合，木屑的水分含量为　子实体的形成。　６０％～７０％，木屑的ｐＨ值５．５。将木屑装入组培瓶中，压实，　１．４茵种筛选培养基　用１５　ｍｍ×１５　ｍｉｌｌ的试管在木屑中间压一个洞留着接种，盖　母种培养基Ａ：葡萄糖１０　ｇ、琼脂１０　ｇ、马铃薯（去皮）　紧后在高温下灭菌１００　ｍｉｎ，菌种采用母种培养基Ａ培养的　１００　ｇ、酒石酸铵０．７５　ｇ、磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ　）０．５　ｇ、硫酸镁　松茸菌丝体，接种后在２５℃下培养４５—６０　ｄ。待松茸菌丝长　（ＭｇＳＯ　）０．２５　ｇ、蛋白胨１．５　ｇ；母种培养基Ｂ：葡萄糖１Ｏ　ｇ、琼　满木屑并且出现很多白色的松茸菌丝点，然后须用竹板拍打　脂１Ｏ　ｇ、马铃薯（去皮）１００　ｇ、硫酸镁（ＭｇＳＯ　）０．２５　ｇ、磷酸二　地面造成声响进行惊菌，搬动松茸菌袋移入到栽培室。早、晚　氢钾（ＫＨ：ＰＯ　）０．５　ｇ，母种培养基ｃ：葡萄糖１０　ｇ、琼脂１０　ｇ、　温度在１８—１０℃变化，相对湿度８５％～９０％，光照三分阴、　磷酸二氢钠（ＮａＨ　ＰＯ　）０．５　ｇ、酒石酸钾钠０．７５　ｇ、蛋白胨　七分阳，通风保证氧气供给。诱导菌株产生松茸菌蕾，并小心　１．５　ｇ；母种培养基Ｄ：葡萄糖１０　ｇ、琼脂１０　ｇ、磷酸二氢钾　把小的菌蕾用镊子去掉一些，保证营养集中。　（ＫＨ２ＰＯ４）０．５　ｇ、ＨＣ１　０．５　ｍｏｌ／Ｌ、酵母片１．２５　ｇ；母种培养基　Ｅ：葡萄糖１Ｏ　ｇ、琼脂ｌ０　ｇ、酵母片２．５　ｇ、酒石酸铵０．７５　ｇ。其　２结果　中去皮马铃薯是将其切成小片，在沸水中煮３０　ｍｉｎ，取其　２．１　松茸０２８８茵丝的萌发时间和萌发率　汁液。　从表１可以看出，培养基Ａ中松茸菌丝的萌发时间最　液体培养基Ｆ：葡萄糖３Ｏ　ｇ、酒石酸１．５　ｇ、磷酸二氢钾　早，第１０　ｄ开始萌动生长。其次是培养基Ｂ和Ｃ中松茸菌丝　（ＫＨ：ＰＯ　）１．０　ｇ、硫酸镁（ＭｇＳＯ　）０．５　ｇ、蛋白胨２．５　ｇ；液体培　体，均为１２　ｄ，培养基Ｅ中松茸菌丝的萌发最晚。另外，培养　养基Ｇ：葡萄糖３０　ｇ、酒石酸１．５　ｇ、磷酸二氢钾（ＫＨ：ＰＯ　）　基Ａ和Ｂ中松茸菌丝的萌发率最高（９０％），其次为培养基Ｄ　１　ｇ、硫酸镁（ＭｓＳＯ４）０．５　ｇ、大豆２０　ｇ、玉米ｌ０　Ｂ、小麦５　ｇ。其　中松茸菌丝（８０％），培养基　ｃ和Ｅ中松茸菌丝萌发率最低　中大豆、玉米、小麦是将其泡涨绞汁稀释加入。　（７Ｏ％）。培养基Ａ中松茸菌丝的萌发率最高，萌发时间最　１．５松茸茵株的ＤＮＡ提取　早，说明培养基Ａ在一定程度上适应松茸的生长。　采用ＣＴＡＢ法提取，并稍加改良，ＤＮＡ用１００　ｖｂＬ　ＴＥ（ｐＨ　表１　不同培养基中松茸菌丝的萌发时间和萌发率　值８．Ｏ）溶解，一２０℃保存备用。　１．６　ｒＤＮＡ　ＩｒＩ＇ｓ序列的ＰＣＲ扩增　应用通用引物和自主设计的引物进行ｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列扩　增，通用引物（ＩＴＳ１，ＩＴＳ２）序列分别为：ＩＴＳ１：５　一ＣＡＴＦＡＴＦ－　ＧＡＡ　ｒＡＡＡＧＣＴＴＧＧｒｒＡＧ一３　：ＩＴＳ２：５　一ＴＡＣＣＴｃＡＴＩＴｒＧＧｅＴ．　ＣＡＡＡＡＴＧ一３　，自主设计引物序列分别为：Ｐｔｍｌ：５，＿　ｒｒｒｃ．　ＣＧＴＡＧＡＡＣＣＴＧＣＧ一３　；Ｐｔｍ２：５　一ＴＣＡＧＣＧＧＧＴＡＧＴＣＣＴＡＣ—　ＣＴＧ一３　，引物由上海生工生物技术有限公司合成。ＰＣＲ反　２．２松茸ｏ２８８茵丝的生长　应体系为：１０×Ｂｕｆｆｅｒ　５　，ｄＮＴＰ　２　Ｌ（２５　ｍｍｏｌ／Ｌ），引物　从不同配方的松茸培养基中菌丝日生长量（表２）可以看　２　ｗＬ，Ｔａｑ酶０．２　（大连宝生物工程有限公司），ＤＮＡ模板　出，在培养基Ａ中松茸菌丝生长速度最快，与其他培养基中　１　ｐ．Ｌ，无菌去离子水补足５Ｏ　。扩增程序：９４　ｏＣ　２　ｒａｉｎ；　菌丝生长速度相比，差异都达到了极显著水平。其后依次为　９４℃１　ｒａｉｎ，５２　ｏＣ　１　ｍｉｎ，７２℃２　ｍｉｎ，４０个循环；７２℃５　ｗｉｎ。　培养基Ｂ、培养基Ｃ、培养基Ｄ、培养基Ｅ中菌丝。培养基Ｅ　ＰＣＲ扩增产物用ｌ％琼脂糖凝胶电泳检测，回收扩增ＤＮＡ片　中松茸菌丝生长速度最慢，与培养基Ａ、培养基Ｂ、培养基ｃ、　段，送上海生工生物工程有限公司测序。　培养基Ｄ中菌丝相比，差异都达到了极显著水平。　表２不同培养基中松茸菌丝生长速度的比较　２．３松茸０２８８茵丝的人工驯化　并且出现很多白色的松茸菌丝点后，进行惊菌与促蕾管理。　将液体培养基Ｇ与含水量６ｏ％～７０％的松树木屑混匀，　松茸０２８８菌丝长满袋后呈丛状黄色（图１一Ａ），基生，有时有　ｐＨ值５．５。装入组培瓶中，灭菌、接种，待松茸菌丝长满木屑　二叉如鹿角状（图１一Ｂ），这是产生松茸子实体的前兆，继续　一２１２一　江苏农业科学２０１２年第４Ｏ卷第１期　Ｍ　１　２　３　４　５　２　０００ｂｐ　５００ｂｐ　Ａ—丛状小菌蕾；Ｂ～鹿角状菌蕾；ｃ、Ｄ—松茸人工驯化子实体　图ｌ　０２８８松茸菌丝的人工驯化　２５０ｂｐ　１００ｂｐ　培养１５—２５　ｄ，即可看到菌蕾逐渐长大成子实体（图１一Ｃ、　Ｍ—Ｄ　增；　图１一Ｄ）。　３、４一引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ２扩增　。‘　２．４核糖体ＩＴＳ序列的ＰＣＲ扩增及序列分析　图２　松茸子实体ｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列ＰＣＲ扩增　采用松茸核糖体ＩＴＳ序列的通用引物（ＩＴＳ１，ＩＴＳ２）和自　６２３　ｂｐ片段。经ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ和ＤＮＡｓｔａｒ软件进行序列分　主设计的引物（Ｐｔｍｌ，Ｐｔｍ２），以０２８８松茸子实体和天然松茸　析，其中Ｐｔｍｌ和Ｐｔｍ２引物片段中，１８Ｓ　ｒＤＮＡ　３２　ｂｐ，ＩＳＴ１　子实体ＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增。结果如图２所示，经　ｓｐａｃｅｒ　２４０　ｂｐ，５．８Ｓ　ｒＤＮＡ　１５２　ｂｐ，ＩＴＳ２　ｓｐａｃｅｒ　２０８　ｂｐ，２８Ｓ　ｒＤ—　ＰＣＲ扩增后，从人工培养的松茸菌株和自然条件下生长的松　ＮＡ　３４　ｂｐ；引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ２扩增片段中，除１８Ｓ和２８Ｓ　ｒＤＮＡ　茸菌株中都得到了一条清晰明亮的６００　ｂｐ左右的条带。　分别只扩增了５　ｂｐ和２０　ｂｐ外，其他序列与Ｐｔｍｌ和Ｐｔｍ２引　扩增产物用胶回收试剂盒回收纯化ＤＮＡ，经测序，自主　物扩增序列完全一致。　设计引物扩增出６６６　ｂｐ片段，通用引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ２扩增出　从图３中可见，人工培养的松茸子实体和天然松茸子实　ＴＴＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＡＧＧＡＴＣＡＴＴＡＴＴＧＡＡＴＡＡ０２８８　ＣＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＴＴＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＣＡＣＡＴＴＴＴＧＴ　０２８８　ＣＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＴＴＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＣＡＣＡＴＴＴＴＧＴ　Ｎｔｍ　ＡＧＧＣＴＴＧＧＡＴＡＡＡＴＡＴＧＴＣＴＣＧＡＧＧＡＡＧＣＴＣＧＧＴＴＴＧＡＧＧ　０２８８　ＡＧＧＣＴＴＧＧＡＴＡＡＡＴＡＴＧＴＣＴＣＧＡＧＧＡＡＧＣＴＣＧＧＴＴＴＧＡＧＧ　ＮＵｎ　ＡＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＧＧＣＴＴＴＣＣＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＣ０２８８　ＡＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＧＧＣＴＴＴＣＣＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＣＮｔｍ　ＣＡＧＣＣＴＡＴＧＣＡＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＣＡＣＴＣＧＧＴＡＴＧＴＣＡＴＧＧＡＡ　０２８８　ＣＡＧＣＣＴＡＴＧＣＡＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＣＡＣＴＣＧＧＴＡＴＧＴＣＡＴＧＧＡＡ　Ｎｔｍ　ＴＧＴＴＡＴＴＴＧＧＴＴＧＧＣＴＴＡＡＴＴＧＣＣＡＧＴＡＡＡＣＣＴＴＡＴＡＣＡＡ　０２８８　ＴＧＴＴＡＴＴＴＧＧＴＴＧＱＣＴＴＡＡＴＴＧＣＣＡＧＴＡＡＡＣＣＴＴＡＴＡＣＡＡ　Ｎｔｍ　—ｒｒＳ１　ＣＴＴＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＣＧＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡ　０２８８　ＣＴＴＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＣＧＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡ　Ｎｕｎ　ＡＣＧＣＡＧＣＧＡＡＡＴＧＣＧＡＴＡＡＧＴＡＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣ　０２８８　ＡＣＧＣＡＧＣＧＡＡＡＴＧＣＧＡＴＡＡＧＴＡＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣ　ＮＵｎ　ＡＧＴＧＡＡＴＣＡＴ　ＡＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＧＣＡＣＣＴＴＧＣＧＣＴＣＣＴＴＧ　０２８８　ＡＧＴＧＡＡＴＣＡＴ　ＡＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＧＣＡＣＣＴＴＧＣＧＣＴＣＣＴＴＧ　Ｎｔｍ　ＧＴＡＴＴＣＣＧＡＧＧＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＴＴＴＧＡＧＴＧＴＣＡＴＧＡＡＡＴＴＣ　０２８８　ＧＴＡＴＴｃｃＧＡＧＧＡＧｃＡＴＧｃｃＴＧＴＴＴＧＡＧ　鱼　尘　差　ＴＣＡＡＣＣＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＴＡＧＧＣＴＴＧＧＡＴＴＴＴＧ　０２８８　ＴＣＡＡＣＣＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＴＡＧＧＣＴＴＧＧＡＴＴＴＴＧ　Ｎｔｍ　ＧＧＡＧＴＴＧＴＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡ　０２８８　ＧＧＡＧＴＴＧＴＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡ　Ｎｔｍ　ＴＧＴＡＴＴＡＧＣＧＧＧＧＣＣＣＴＴＧＴＴＧＴＣＴＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＧＴＧＡＴ　０２８８　ＴＧＴＡＴＴＡＧＣＧＧＧＧＣＣＣＴＴＧＴＴＧＴＣＴＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＧＴＧＡＴ　Ｎｔｍ　ＡＡＴＴＡＴＣＴＡＣＧＣＣＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＡＴＧＴＡＡＴＡＧＧＴＣＧＧＣＴＴ　０２８８　ＡＡＴＴＡＴＣＴＡＣＧＣＣＡＴＴＧＴＯＡＡＣＡＡＴＧＴＡＡＴＡＧＧＴＣＧＧＣＴＴ　Ｎｔｍ　ＣＴＡＡＴＣＧＴＣＴＣＧＴＡＡＡＧＡＧＡＣＡＡＴＣＴＣＴＧＡＣＡＴＴ’ｒ’ｒＧＡＣＣ　０２８８　ｃＴＡＡＴｃＧＴｃＴｃＧＴＡＡＡＧＡＧＡ　△△！　！　△　王至ＩＩ　Ａｃｃ　Ｎｔｍ　ｌｌＳ２　Ｗ－同ＣＡＡＡＴＣＡＧＧＴＡＧＧＡＣＴＡＣＣＣＧｃＴＧＡ　０２８８　ｑＣＡＡＡＴＣＡＧＧＴＡ　Ｎｍａ　０２８８：人工培养的松茸子实体；Ｎｔｍ：天然松茸子实体　图３　人工培养的松茸子实体和天然松茸子实体核／ｉｌｌＳ：ＩＴＳ序列分析　郑尚永等：松茸０２８８的人工培养及鉴定　一２１３一　体的５．８Ｓ　ｒＤＮＡ、ＩＴＳ１和ＩＴＳ２及部分１８Ｓ和２８Ｓ　ｒＤＮＡ序列　Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００４，６８（１１）：２４０５—２４０７．　同源性达９９％，除ＩＴＳ１区４４位点有一个Ｇ突变成Ｃ，０２８８　［６］曾东方，罗信昌，傅伟杰．松口蘑菌丝体的分离和ＲＡＰＤ—ＰＣＲ　松茸５．８Ｓ区１００位点多一个Ｇ和２８Ｓ区多出一个Ｔ的点突　分析［Ｊ］．微生物学报，２００１，４１（３）：２７８—２８６．　变外，其余序列完全一致，说明它们的亲缘关系非常接近。　［７］Ｃｈｅｎ　Ｑ，Ｌｉａｏ　Ｄ　Ｃ，Ｚｈａｎｇ　Ｘ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｅｄｉｂｌｅ　ｆｕｎｇｕｓ　Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ　ｍａｔｓｕｔａｋｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒ０ⅡＩ　３讨论　Ｙａｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ，ｂｙＡＦＬＰｔｅｃｈｎｉｑｕｅ［Ｊ］．Ａ　ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓｉｎ　Ｃｈｉ—　松茸属于寄主专一性很强的外生菌根真菌，在自然环境　ｎａ，２００３，２（２）：２２９—２３６．　下并不局限于某一点生长，而是环绕在宿主植物根系周围较　［８］Ｓｈａ　Ｔ，Ｚｈａｎｇ　Ｈ　Ｂ，Ｄｉｎｇ　Ｈ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ　ｍａｔｓｕｔａｋｅ　ｉｎ　Ｙｕｎｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２００７，　大面积的范围内形成大量乳白色的菌丝，形成“菌塘（Ｓｈｉ－　５２（９）：１２１２—１２１６．　ｒｏ）”　。本研究通过对松茸菌丝生长培养基配方进行优化，　［９］Ｋｉｋｕｃｈｉ　Ｋ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ　Ｎ，Ｇｕｅｆｉｎ—Ｌａｇｕｅｔｔｅ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒ／一　以寻找出菌丝生长的最佳培养基配方，结果表明，松茸菌丝体　ｃｈｏｌｏｍａ　ｍａｔｓｕｔａｋｅ　ｂｙ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ＩＴＳ　ｐｒｉｍｅｒｓ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｌ　Ｒｅｓ，２０００，１０４　在培养基Ａ中生长速度快，菌丝萌发时间早，萌发率达到　（１２）：１４２７—１４３０．　９０％。说明该培养基配方为松茸提供了良好的生长环境，促　［１０］Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ　Ｎ，Ｋｉｋｕｃｈｉ　Ｋ，Ｓａｓａｋｉ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　进松茸的生长。在试验中我们还发现，培养温度从２５℃持续　Ｔｒｉｃｈｏｌｏｒｆｇａ　ｍａｔｓｕｔａｋｅ　ａｎｄ　ｎａｕｓｅｏｓｕｍ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｎｏ．ｈｅｍ　ｈｅｍｉ—　升高到４Ｏ℃后迅速降温，松茸仍能正常生长，这与前人研究　ｓｐｈｅｒｅ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａｎａｌｙｓｅｓ　ｏｆ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＤＮＡ　ｓｐａｃｅｒ　ｒｅ￣ｏｎｓ［Ｊ］．Ｍｙ—　的２８～３２℃是松茸菌丝的致死温度　不一致。　ｃｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００５（４６）：９Ｏ一９６．　ＩＴＳ序列变异较快，能够提供丰富的变异位点和信息，是　［１１］Ｍｕｒａｔａ　Ｈ，Ｂａｂａｓａｋｉ　Ｋ，Ｙａｍａｄａ　Ａ．Ｈｉｇｈｌｙ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ　ｍａｒｋ—　真菌菌种和分离物鉴定的可靠依据　。由于１８Ｓ、５．８Ｓ、２５～　ｅｒ８　ｔｏ　ｓｐｅｃｉｆｙ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｃｔｏｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ　ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ　Ｔｒｉｃｈｏｌｏ—　２８Ｓ　ｒＤＮＡ的序列非常保守　，有利于扩增引物的设计，其　ｍａ　ｍａｔｓｕｔａｋｅ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｃｒｍａｒＹ１，ｔｈｅ　ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ　ｏｆ　ｇｙｐｓｙ—　ｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列一般片断也较小（５００～７００　ｂｐ）　。因此，　ｔｙｐｅ　ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔ　ｍａｒＹ１［Ｊ］．Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ，２００５（１５）：１７９—１８６．　ＩＳＴ序列是该类群核酸分子中的良好标记，在不同种属的真　［１２］Ｙａｍａｄａ　Ａ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｈ，Ｍｕｒａｔａ　Ｈ．Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ　ｍａｔｓｕｔａｋｅ　ＩＦ０６９３３　ａｎｄ　ＩＦ０３０６０４，‘ｍａｔｓｕｔａｋｅ’ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｔｈａｔ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ　ｏｎ　菌之间ＩＳＴ１区域的多态性程度变化较大，而在同一种属之间　ｓｌｎａｔｓ　ａｎｄ　ｗｉｄｅｌｙ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｆｏｒ　ａ　ｑｕａｒｔｅｒ　ｔｏ　ｈａｌｆ　ａ　ｃｅｎｔｕｒｙ，ｃａｌｌ　差异很小　。本研究结果表明，在人工培养的松茸子实体　ｆｏｒｍ　ｅｅｔｏｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ　ｉｎ　Ｐｉｎｕｓ　ｄｅｎｓｉｉｆｏｒａ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００３　和自然条件下生长的松茸子实体的扩增片段中，包含了松茸　（４４）：２４９—２５１．　部分１８Ｓ　ｒＤＮＡ、全部ＩＴＳ１、５．８Ｓ　ｒＤＮＡ、ＩＳＴ２序列和部分２８Ｓ　［１３］杨民和，刘咏梅，杨新美，等．松茸的菌丝分离及纯培养研究　ｒＤＮＡ序列，且两个序列具有高度的同源性，证实了人工培养　［Ｊ］．华中农业大学学报，１９９７，１６（３）：２７２—２７６．　的松茸菌株与自然条件下生长的松茸菌株属于同一种属。　［１４］Ｓｃｈｍｉｄｔ　Ｏ，Ｍｏｒｅｔｈ　Ｕ．Ｄａｔａ　ｂａｎｋ　ｏｆ　ｒＤＮＡ—ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｆｒｏｍ　本研究供试松茸０２８８菌株，是将天然松茸菌株通过紫外　ｂｕｉｌｄｉｎｇ—ｒｏｔ　ｆｕｎｇｉ　ｆｏｒ　ｔｈｅｉｒ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｗｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　照射分离培养得到的，因此菌丝体很可能在培养过程中发生　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２（３６）：４２９－４３３．　了个别的碱基突变，这已在核糖体ＤＮＡ序列分析中得到证　［１５］Ｃｈａｐｅｌａ　Ｉ　Ｈ，Ｇａｒｂｅｌｏｔｔｏ　Ｍ．Ｐｈｙｌｏｇｅｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍａｔ—　实。这说明，通过紫外照射方式可引起松茸菌株部分碱基突　ｓｕｔａｋｅ　ａｎｄ　ｃｌｏｓｅ　ａｌｌｉｅｓ　ｉｎｆｅｒｒｅｄ　ｂｙ　ａｎａｌｙｓｅｓ　ｏｆ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　变，有利于松茸菌株的筛选培养，从而实现松茸的人工栽培。　ＡＦＬＰｓ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ，２００４（９６）：７３０－７４１．　［１６］Ｔｈｏｑｕｅｔ　Ｐ，Ｇｈｅｒａｒｄｉ　Ｍ，Ｊｏｕｍｅｔ　Ｅ　Ｐ，ｅｔ　８．１．Ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　参考文献：　ｌｉｎｋａｇｅ　ｍａｐ　ｏｆ　ｈｔｅ　ｍｏｄｅｌ　ｌｅｇｕｍｅ　Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ：ａｎ　ｅｓｓｅｎｔｉｌａ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｌｅｇｕｍｅ　ｇｅｎｏｍｉｃｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｇｒｏｎｏｍｉ—　［１］陈羽，王凤珍，陈应龙，等．两个松茸菌株培养条件的研究［Ｊ］．　林业科学研究，２００３，１３（４）：４１０—４１５．　ｅｌａｌｙ　ｉｍｐｏ￣ａｎｔ　ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＢＭＣ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｙｇ，２００２，２（１）：１—１３．　［１７］Ｖｏｓ　Ｐ　Ｒ，Ｈｏｇｅｒｓ　Ｒ，Ｒｅｉｊａｎｓ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．ＡＦＬＰ：ａ　ｎｅｗ　ｔｅｃｈｎｉｕｑｅ　ｆｏｒ　［２］Ａｋｉｙｏｓｈｉ　Ｙ，Ｋｅｎ　Ｍ，Ｍａｓａｔａｋｅ　Ｏ．Ｅｃｔｏｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒ／－　ＤＮＡ　ｉｆｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｒａ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２３：４４０７—　ｃｈｏｌｏｍａ　ｍａｔｓｕｔａｋｅ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｏｎ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｐｉｎｕｓ　ｄｅｎｓ　Ｄｍ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　４４ｌ４．　［Ｊ］．Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，４０（６）：４５５—４６３．　［１８］Ｗｉｐｅ　Ｄ，Ｍｕｎｃｈ　Ｊ，Ｂｏｔｔｏｎ　Ｂ，ｅｔ　８１．ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｎ　ｍｏｒｅｌｓ：　［３］魏铁铮，许广波，傅伟杰，等．不同培养基对松口蘑菌丝生长的影　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｓｐａｃｅｒ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｃｏｄ—　响［Ｊ］．食用菌学报，２０００，７（３）：４８—５２．　ｉｎｇ　ｆｏｒ　ｒＲＮＡ　ｉｎ　ＭｏｒｃｈｅＵａ　ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（Ｙｅｌｌｏｗ　Ｍｏｒｅ１）ａｎｄ　Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ　［４］许广波，傅伟杰，张明杰．长白山区松口蘑的生态习性及驯化栽　ＣＯ？］，ｉｃａ（Ｂｌａｃｋ　Ｍｏｒｅ１）［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ｎａｄ　Ｅｎｖｉｏｒｎｍｅｎｔｌａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ・　培［Ｊ］．延边大学农学学报，１９９９，２１（２）：１３０—１３４．　ｙｇ，１９９６，６２（９）：３５４１—３５４３．　［５］Ｈｉｒｏｋａｚｕ　Ｋ，Ｋｅｉｋｏ　Ｈ，Ｒｙｏ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｇｒｏｗｔｈ　ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｙｃｅｌｉａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｔｓｕｔａｋｅ　ｍｕｓｈｒｏｏｍ　Ｔｒ／ｃｈｏ／ｏｍａ　ｍａｔｓｕｔａｋｅ　ｂｙ　Ｄ—Ｉｏｓｌｅｕｃｉｎｅ［Ｊ］．