HPLC.ELSD法测定注射用1,4.丁二磺酸腺苷蛋氨酸注射用溶剂中三.赖氨酸的含量

９２８　中国抗生素杂志２０１３年１２月第３８卷第１２期　文章编号：１００１—８６８９（２０１３）１２—０９２８—０３　ＨＰＬＣ．ＥＬＳＤ法测定注射用１，４．丁二磺酸腺苷蛋氨酸　注射用溶剂中　．赖氨酸的含量　李蔷薇　李直王欣荣’何正有姚洁李强李维　（四川抗菌素工业研究所，成都６１　００５２）　摘要：目的建立注射用１，４一丁二磺酸腺苷蛋氨酸注射用溶剂中三．赖氨酸的含量测定方法。方法采用Ｃ．　（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，　５ｕｍ）色谱柱，以乙腈．甲醇．０．１％三氟醋酸溶液（２：１：９７）为流动相，柱温为室温，流速为１．０ｍＬ／ｍｉｎ，以蒸发光散射检测器检　测，漂移管温度：１０５￣Ｃ，空气做为载气，流速为３．０Ｌ／ｍｉｎ。结果在０．２０６６－２．０６６０￣ｇ范围内，色谱峰面积对数与对照品浓度的　该法简便、可靠、专属性强、重现性　对数呈良好的线性关系（　０．９９９７，，ｚ＝５１；平均回收率为９９．７８％（ＲＳＤ＝０．７１％，　＝９）。结论好，可做为注射用ｌ，４．丁二磺酸腺苷蛋氨酸注射用溶剂中三．赖氨酸含量测定的有效方法。　关键词：注射用１，４．丁二磺酸腺苷蛋氨酸；　．赖氨酸；高效液相；色谱法；蒸发光散射检测器　中图分类号：Ｒ９　文献标志码：Ａ　ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｄｅｍｅｔｉｏｎｉｎｅ　１，４－ｂｕｔａｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ　ｏｒ　ｆｉｎｊ　ｅｃｔｉｏｎ　Ｌｉ　Ｑｉａｎｇ－ｗｅｉ，Ｌｉ　Ｚｈｉ，Ｗａｎｇ　Ｘｉｎ－ｒｏｎｇ，Ｈｅ　Ｚｈｅｎｇ—ｙｏｕ，Ｙａｏ　Ｊｉｅ，Ｌｉ　Ｑｉａｎｇ　ａｎｄ　Ｌｉ　Ｗｅｉ　（Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｉｎｄｕｓｔｉｒａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００５２）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｉｅｃｔｉｖｅ　Ａｎ　ＨＰＬＣ．．ＥＬＳＤ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌ．．１ｙｓｉｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ｕｓｅｄ　ｏｒｆ　ｔｈｅ　ａｄｅｍｅｔｉｏｎｉｎｅ　１．４．Ｂｕｔａｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ　ｆｏｒ　ｉｎｉｅｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｏｎ　ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ，Ｃ，。ｃｏｌｕｍｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ　ｏｆ　ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ—ｍｅｔｈａｎｏｌ一０．１％ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２：１：９７、ａｔ　ｒｏｏｍ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．ＥＬＳＤ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ，ｔｈｅ　ｄｒｉｆｔ　ｔｕｂｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗａｓ　１０５℃ａｎｄ　ｅｌｕａｎｔ　ｇａｓ　ｗａｓ　ａｉｒ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｌｆｏｗ　ｒａｔｅ　Ｏｆ　３．０Ｌ／ｍｉｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　０．２０６６－２．０６６０￣ｇ（ｒ＝０．９９９７，　＝５）．Ｔｈｅ　ｍｅａｎ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｗａｓ　９８．０２％ｗｉｔｈ　ＲＳＤ＝１．０５％（　＝９１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ．ａｃｃｕｒａｔｅ　ａｎｄ　ｈａｖｅ　ｇｏｏｄ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ　ｉｔ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌ—ｌｙｓｉｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ｕｓｅｄ　ｏｒ　ｆｔｈｅ　ａｄｅｍｅｔｉｏｎｉｎｅ　１．４一Ｂｕｔａｎｅｄｉｓｕｌｏｎａｔｆｅ　ｆｏｒ　ｉｎｉｅｃｔｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｔｈｅ　ａｄｅｍｅｔｉｏｎｉｎｅ　１．４．Ｂｕｔａｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ　ｏｒｆ　ｉｎｊ　ｅｃｔｉｏｎ；Ｌ—ｌｙｓｉｎｅ；ＨＰＬＣ；ＥＬＳＤ　注射用１，４一丁二磺酸腺苷蛋氨酸适用于肝硬化　前和肝硬化所致肝内胆汁郁积和妊娠期肝内胆汁郁　率较低，且产物的立体构型无选择性，很少使用。　②酶促转化法：利用腺苷蛋氨酸合成酶（腺苷转移酶）　积，在临床上是利胆保肝药的一线品种，占有很大　的市场份额。目前文献报道的腺苷蛋氨酸制备工艺　催化底物　一蛋氨酸和ＡＴＰ生成腺苷蛋氨酸。③微生　物发酵法：利用某些微生物（尤其是酵母菌的一些菌　株）在含有一定量　一蛋氨酸的培养基中生长时，在细　胞内能够积累较高浓度的腺苷蛋氨酸的特点，通过　大致分为以下３种：①化学合成法：以ｓ一腺苷同型半　胱氨酸和甲基供体（ＣＨ　Ｉ）合成腺苷蛋氨酸。由于产　收稿日期：　２０１３—０２—１０　基金项目：　“重大新药创制”科技重大专项“国药集团技术创新产学研联盟建设”（２０１１ＺＸ０９４０１・４０３）。　作者简介：　李蔷薇，女，硕士，助理研究员，主要从事药物新剂型、新技术的研究与开发，Ｅ—ｍａｉｌ：１２６８６２７９６＠ｑｑ．ｃｏｒｎ。　通讯作者，　王欣荣，男，硕士，研究员，Ｅ－ｍａｉｌ：２２７６０５１０６２＠ｑｑ．ｔｏｍ。　ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ法测定注射用１，４一丁二磺酸腺苷蛋氨酸注射用溶剂中　一赖氨酸的含量李蔷薇等　９２９　发酵制备腺苷蛋氨酸。我所目前使用的是微生物发　酵法生产原料药腺苷蛋氨酸，再将其与１，４一丁二磺　酸形成复盐，最后将其复盐制成冻干制剂。赖氨酸　２．２．２供试品溶液的制备　取本品（市售包装中的注射用溶Ｎ）５瓶，混匀，　精密量取０．５ｍＬ，置于１０ｍＬ容量瓶中，用水稀释至　刻度，摇匀；再精密量取０．５ｍＬ，置于２０ｍＬ容量瓶　中，用水稀释至刻度，摇匀。用０．２２ｇｍ滤膜虑过，　取续滤液即得。　２．３测定法　是人体必需的八种氨基酸之一，临床上多用于由于　赖氨酸缺乏所致发育不良、食欲不振、老年痴呆、　记忆力减退等。本品是以三一赖氨酸为主药的灭菌溶　液，作为腺苷蛋氨酸的注射用溶剂，每支５ｍＬ，每　支含￡一赖氨酸３８５～４５０ｍｇ。按照文献【ｓ］本品种的进口　注册标准要求，需对其注射用溶剂进行含量测定，　分别精密吸取对照品溶液１ＯｇＬ，供试品溶液　１０　Ｌ，注入液相色谱仪，测定，以线性回归方程计　即测定注射用溶剂中三一赖氨酸的含量。三一赖氨酸属　于末端吸收，目前文献［ｓ］采用的是衍生化法，将其接　入一个有紫外吸收的基团，再用紫外分光光度法进　行测定。但是这种方法操作非常繁琐，干扰大，重　复性、精密度差。而蒸发光散射检测器（ＥＬＳＤ）为质　量型检测器，不受外部环境干扰，试剂在检测器中　全部挥发，不干扰检测，灵敏度、稳定性及重现性　也很好，能符合含量测定的要求，且操作简便。本　文采用高效液相色谱一蒸发光散射检测法测定注射用　１，４一丁二磺酸腺苷蛋氨酸注射用溶剂中三一赖氨酸的含　量，方法灵敏，简单，稳定性和重复性较好，可代　替文献［５］中的　一赖氨酸含量测定方法。　１仪器与试药　高效液相色谱仪（美ｍＡｇｉｌｅｎｔ１　２００型１，蒸发光散　射检测器（美国Ａｌｌｅｔｃｈ　ＥＬＳＤ２０００ＥＳ型），ＸＷＫ．ＩＩＩ无　油空气泵（天津市华生分析仪器厂）。　注射用１，４．丁二磺酸腺苷蛋氨酸中的注射用溶　剂（厂家：雅培制药，批号７８Ｓ３６８Ｅ０２，注：该品　种上市品注射用溶剂是与产品放置于同一个包装　内），（自制品，批号２０１２０６１３０１、２０１２０６１３０２、　２０１２０６１３０３）；Ｌ一赖氨酸对照品（按中国药典２０１０版　检验合格的原料，含量９９．６％）；试验用水：重蒸馏　水；三氟醋酸为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯。　２色谱条件　２．１色谱条件与系统适用性试验　色谱柱：苏州环球Ｃ　柱（２　５　０ｍｍ×４．６ｍｍ，　５　ｍ）；流动相：甲醇．乙腈．０．１％三氟醋酸溶液　（２：１：９７）；流速：１ｍＬ／ｍｉｎ；ＥＬＳＤ漂移管温度：　１０５℃；空气作为载气，气体流速：３Ｌ／ｍｉｎ；柱温：　室温；理论塔板数按三一赖氨酸峰计算应不低于４０００。　２．２溶液制备　２．２．１对照品溶液的制备　分别精密称取　一赖氨酸对照品适量，分别加水制　成０．０５ｍｇ／ｍＬ的溶液、０．１ｍｇ／ｍＬ的溶液，０．１５ｍｇ／ｍＬ　的溶液即得。　算含量，即得。　２．４注射用溶剂制备　精密量取三一赖氨酸４２０ｍｇ，置于５ｍＬ容量瓶　中，用注射用水溶解，再用氢氧化钠调节其ｐＨ至　１０．０～１０．６范围内，注射用水定容，加入０．１％活性炭　搅拌３０ｍｉｎ，过滤，灌装入１０ｍＬ安瓿瓶，放置于高　压灭菌锅内，１１５℃下灭菌３０ｍｉｎ，即得。　３方法学考察　３．１检测器参数优化　因本品流动相中水相占比例大，溶剂蒸发需要　较高温度，在不同漂移管温度和不同载气流速条件　下观察　一赖氨酸对照品信号强度，最后确定漂移管　温度为１０５℃，气体流速为３Ｌ／ｍｉｎ为最优参数。　３．２阴性对照干扰试验　取按处方比例制备的无三一赖氨酸的阴性对照，　按供试品溶液制各项下方法同法操作，制备成阴性溶　液。另轧一赖氨酸对照品及供试品适量，同法操作，　结果见图１。试验表明辅料对　一赖氨酸测定无干扰。　３－３　线性关系考察　精密称取　一赖氨酸对照品５０ｍｇ，置５０ｍＬ量瓶　中，用水溶解并稀释至刻度，分别精密量取０．５、　１．０、２．０、３．Ｏ和５．０ｍＬ，分别置２５ｍＬ量瓶中，加水　稀释至刻度，摇匀，精密吸取上述各对照品溶液　１ＯｇＬ，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定三一赖　氨酸峰面积。以三一赖氨酸色谱峰面积（】，）的对数值为　纵坐标，　一赖氨酸的量（∞的对数值进行线性回归，　其线性回归方程为：Ｌｏｇ　１．５５０１Ｌｏ　７．４６７１，　（　Ｏ．９９９７，　＝５），线性范围为０．２０６６～２．０６６ｇｇ，该线　性范围符合要求。　３．４　仪器精密度试验　精密吸取对照品溶液１ＯｇＬ，注入液相色谱仪，　重复进样６次，测得平均峰面积为１　８７０．０７（ｎ＝６），　ＲＳＤ为１．５０％，符合含量测定要求。　３．５重复性试验　取注射用１，４一丁二磺酸腺苷蛋氨酸的注射用溶　９３０　中国抗生素杂志２０１３年１２月第３８卷第１２期　３．８样品测定　取注射用１，４　丁二磺酸腺苷蛋氨酸的注射用溶剂　３批（自制样品），按供试品溶液制备项下方法同法操　作，进样１０　，计算其结果如表２。　４　讨论　４　７　３　３　０５　２　９　０　５（１）由中国药典２０１Ｏ版二部附录ＶＤ高效液相色　谱法可知，蒸发光散射检测器响应值与供试品溶液　的浓度通常呈指数关系，因此对其进行对数转换，　采用线性回归方程进行计算。　图１　Ｉ碉性对照干扰试验高效液相图　Ｆｉｇ．１　ＨＰＬＣ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｔｅｓｔ　１　８　Ｏ　９　２钉铊６　４　２　６　４（２）流动相及流速选择：文献［３］以０．１％三氟醋酸　为流动相，１．０ｍＬ／ｍｉｎ为流速。但Ｃ，。链在水相环境中　不易保持伸展状态，它的随机卷曲将导致组分保留　■　６　９　ｌ　９　９　１９　０　８　９　Ｏ剂（批号７８Ｓ３６８Ｅ０２），按供试品溶液制各项下方法同　法操作，制备６份供试品溶液进行测定。平均值为每　值变化，造成色谱系统不稳定。因此考虑以以０．１％　三氟醋酸与一定的有机溶剂进行配比作为流动相。　３　３　９　９　４Ｊ　５５ｍＬ注射用溶剂中含有４５　１．４ｍｇ　Ｌ一赖氨酸（，ｚ＝６），ＲＳＤ　为１．６８％。　３．６　回收率试验　试验证明，以甲醇一乙腈一０．１％三氟醋酸溶液（２：１：９７）　为流动相，流速为１ｍＬ／ｍｉｎ，能使主峰与杂质峰分离　良好，符合要求【　。　（３）文献［４］、文献［５］均用抗坏血酸与注射用溶剂　进行衍生化反应，采用分光光度法测定其中赖氨酸　的含量。但衍生化反应操作繁琐，影响因素很多，　如反应温度、反应时间、ｐＨ值、不同衍生化试剂　的选择和用量等，如果操作人员稍有疏忽，就会出　现结果重复性差，测定结果不可靠等问题；且衍生　化试剂自身也可能存在紫外吸收，从而影响测定结　果。而我们采用ＨＬＰＣ．ＥＬＳＤ法完全可以避免出现上　述问题。　按本品标示量的８０％、１００％、１２０％进行回收率　试验。精密量取　一赖氨酸对照品３３６、４２０￣Ｄ５０４ｍｇ，　各３份，按照“２．４注射用溶剂制备”项下的方法制　备成注射用溶剂，再按“２．２．２”项下的方法制备成　供试品溶液，照“２．１”项下的色谱条件进行含量测　定，计算回收率，结果见表１。　３．７溶液稳定性试验　由于本品为注射用溶剂，即水针剂，故认为　－赖氨　酸在水溶液中长期放置稳定，所以免除本项试验。　表１回收率试验结果　Ｔａｂ．１　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆｒｅｃｏｖｅｒｙ　编号　１　２　３　加入量／ｍｇ　测定值／ｍｇ　回收率／％　平均值　９９．４６　ＲＳＤ／％　０．７９　总平均值／％　９９．７８　总ＲＳＤ／％　０．７１　４　５　６　７　１Ｏ０．Ｏ２　０．７２　９９．８６　８　９　表２样品含量测定结果　Ｔａｂ．２　Ｓａｍｐｌｅ　ａｓｓａｙ　ｒｅｓｕｌｔｓ　（４）采用ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ法测定　一赖氨酸的含量，试　验证明本法简便、可靠、专属性强、重复性好，可　做为注射用１，４一丁二磺酸腺苷蛋氨酸注射用溶剂中三一　赖氨酸含量测定的有效方法，并替代文献【５Ｊ中紫外一　衍生化法对　一赖氨酸的含量进行控制。　参考文献　ｆ下转第９４６页）　中国抗生素杂志２０１３年１２月第３８卷第１２期　ＬｅｘＡ蛋白无法裂解的致病性大肠埃希菌试验菌株，　感染小鼠后，通过环丙沙星和利福平治疗，结果显　示，试验菌株没有出现对２种药物的抗性，而对照菌　株则很快出现抗性［ｎ】。这些研究展示了ＳＯＳ应答抑制　［８］　［７】　ｌ　１７４一ｌ１　７６．　Ｓｔａｖａｎｓ　Ｊ．Ｔｈｅ　ＳＯＳ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｔｏ　ＤＮＡ　ｄａｍａｇｅ［Ｃ］．Ｎａｔｏ　Ｓｃｉ　Ｓｅｒ，２００６，２３２：３９—４７．　Ｊａｎｉｏｎ　Ｃ．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ＳＯＳ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｒｅｐａｉｒ　剂诱人的应用前景，但至今仍然缺乏简便实用的筛　选方法。本文通过恩诺沙星梯度平板直观准确地显　示，ｌｅｘＡ过表达显著增强了恩诺沙星在体外对大肠埃　［９］　ａｎｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｓｅｉ，２００８，　４：３３８．３４４．　Ｂａｉ　Ｈ，Ｄｕ　Ｊ　Ｆ，Ｈｕ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　Ｏｆ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｔｏ　希菌的杀菌力，抑制了抗药性菌株的出现，而且，　质粒过表达ｌｅｘＡ基因由于遗传稳定性和ＩＰＴＧ诱导的灵　ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ［Ｊ］．Ａｎｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１２，６２：２９３—２９８．　【１０］　Ｂａｉ　Ｈ，Ｓｕ　Ｗ　Ｚ，Ｚｈｕ　Ｘ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ　活性，以ＢＬ２１．ｕｎｍｏｄｉｉｆｅｄ和ＢＬ２１一ｌｅｘＡ菌株作为正负　对照，结合梯度平板法可望作为ＳＯＳ应答抑制剂的筛　选模型。　ｏｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｅｏｌｉ［Ｊ］．Ａｎｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１０，６０（４）：６５３－６６０．　Ｃｉｒｚｌ　Ｒ　Ｔ，Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｋ，Ａｎｄｅｓ　Ｄ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆｍｕｔａｔｉｏｎ　参考文献　等译．细菌抗药性［Ｍ】．北京：化工出版社，２０１２．　［１］　刘玉庆，　Ｈ，Ｚｈｕ　Ｘ　Ｌ，Ｈｕ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　［２］　ＢａｉＯｆ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ＣＯｌｉ　ｔｏ　ａｎｄ　ｃｏｍｂａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．　ＰＬｏＳ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，３（６）：１０２４—１０３３．　ｎｓ　Ｊ　Ｊ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　［１２】　Ｌｕ　Ｔ　Ｋ．Ｃｏｌｌｉｇｅｎｅ　ｎｅｔｗｏｒｋｓ　ａｓ　ａｄｊｕｖａｎｔｓ　ｆｏｒ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　ＮａｔｌＡｅａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００９，１０６（１２）：４６２９・４６３４．　ｍｂｅｒｌｙ　Ｒ　Ｌ，Ｃｈａｎｇ　Ｋ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｉｍｐａｃｔ　ｏｆｒｅｃＡ　ｏｎ　［１３】　Ｒｅｎｕ　Ｓ，Ｋｉｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ［Ｊ］．Ａｎｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１２，６２：２９３－２９８．　［３］　Ｌｉｎｄｇｒｅｎ　Ｐ　Ｋ，Ｋａｒｌｓｓｏｎ　Ａ，Ｈｕｇｈｅｓ　Ｄ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｏｒｏｑｕｉｎｏ１ｏｎｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ—ｒｅｌａｔｅｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２０１０，５４（１０）：４２６２—４２６８．　ｍ　Ｊ　Ｗ，Ｊｏｎａｔｈａｎ　Ｚ　Ｓ，Ａｎｎａ　Ｖ　ｅｔ　ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　ＲｅｃＡ　［１４］　Ｔｉａｃｔｉｖｉｔｙ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ　ｂｙ　ｈｉｇｈ——ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：Ｃｅｌｌ・－　ｐｅｒｍｅａｂｌｅ　ｓｍａｌｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ａｔｔｅｎｕａｔｅ　ｔｈｅ　ＳＯＳ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｉｎ　ｃｏｌｉ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｆｒｏｍ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｕｒｉｎａｒｙ　ｔｒａｃｔ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００３，４７（１０）：３２２２－３２３２．　ｉｃａ　Ｋ．Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ—　［４］　Ｚｈａｏ　Ｘ，Ｄｒｌｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ：ａ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｌｆｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ　ｓｔｕｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，２００１，３３（Ｓｕｐｐｌ　３、：Ｓ１４７—５６．　ｃａ　Ｋ．Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－　［５】　Ｚｈａｏ　Ｘ，Ｄｒｌｉｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ：ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｕｓｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ［Ｊ］．ＪＢｉｏｍｏｌＳｃｒｅｅｎ，２００９，１４（９）：１０９２—１１０１．　［１５］　刘玉庆，李靖冉，杜加法，等．用线性梯度平板准确测定药　物敏感性和分离抗药性菌株［Ｊ］．中国科学Ｃ辑：生命科学，　２０１　１，４１（９）：７４８—７５５．　ｖａｋ　Ｋ　Ｊ，Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ　Ｔ　Ｄ．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｇｅｎｅ　［１６】　Ｌｉｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄａｔａ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｎｄｏｗ［Ｊ］．ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ，２００２，１８５：５６１—５６５．　ｃｈｅｌ　Ｂ．Ａｆｔｅｒ　３０　ｙｅａｒｓ　ｏｆ　ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ＳＯＳ　［６］　Ｍｉｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｔｉｌｌ　ｓｕｒｐｒｉｓｅｓ　ｕｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，３（７）：　２一　。ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，２５：４０２—４０８．　（上接第９３０页）　国家药典委员会．中华人民共和国药典ＩＳ］．（２０１０年版二　部）．北京：化学工业出版社，２０１０：附录２９—３１．　２００４，１　０（４）：４３—４４．　［４］　赵鹏，王东凯，庄润，等．腺苷蛋氨酸注射用溶剂的制备　ＥＬＳＤ法测定小儿胃安片中盐酸赖　［２］　林华庆，钟瑜．ＨＰＬＣ．氨酸的含量［Ｊ］．药品评价，２００６，３（３）：１８８—２０１．　［３］　张伟，卓芝，周定娟，等．高效液相色谱　蒸发光散射检　及其中赖氨酸的含量测定［Ｊ］．中国医院药学杂志，２００６，　７（２６）：８７９—８８　１．　进口药品注册标准ＪＸ２００００２３９［Ｓ］．　【５］　中国药品生物制品检定所．（进口药品复核标准汇编２０００年）．２０００：１０８７．　测法测定复方盐酸赖氨酸片的含量［Ｊ］．儿科药学杂志，