5-Aza—CdR对胃癌细胞系BGC823生长及p27kip1基因异常甲基化的影响

山东医药２００８年第４８卷第１期　可见，ＶＥＧＦ．Ｃ可促进淋巴管生成，是食管鳞状细胞　癌发生淋巴结转移的重要调控因子；阻断ＶＥＧＦ—Ｃ／　ＶＥＧＦＲ－３之间的信号传导，可抑制食管鳞状细胞癌　的淋巴管生成和淋巴结转移，阻止其进展，为食管鳞　状细胞癌提供新的治疗靶点。　［参考文献］　［１］Ｏｈｎｏ　Ｍ，ＮａｋａｍｕｒａＴ，ＫｕｎｉｍｏｔｏＹ，ｅｔ　８１．Ｌｙｍｐｈａｇｅｎｅｓｉｓ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｖ￣ｕｌａｌ＂ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ—Ｃ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　［Ｊ］．Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　Ｔｒｅａｔ，２００１，６６（２）：１５９—１６４．　［３］Ｗｈｉｔｅ　ＪＤ，Ｈｅｗｅｒ　ＰＷ，Ｋｏｓｕｇｃ　Ｄ，ｃｔａ１．Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ—Ｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｓ　ａｎ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ　ｍａｒｋｅｒ　ｆｏｒ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔｌａ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。２００２，６２（６）：１６６９—１６７５．　［４］Ｖｅｉｋｋｏｌａ　Ｔ，Ｊｕｓｓｉｌａ　Ｌ，Ｍａｋｉｎｃｎ　Ｔ，ｃｔ　１．Ｓｉａｎａｇｌｌｉｎｇ　ｖｉａ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｃｎ—　ｄｏｔｈｅｌｉｌ　ｇｒｏｗｔａｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－３　ｉｓ　ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｆｏｒ　ｌｙｍｐｈａｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｃｎｉｃ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．ＥＭＢＯ　Ｊ，２００１。２０（６）：１２２３—１２３１．　［５］Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｅｙｎｄｅｎ　ＧＧ，Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ａｕｗｃｒａ　１，Ｖａｎ　Ｉａｅｒｅ　ＳＪ，ｃｔ　ａ１．Ｄｉｓ—　ｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ　ｂｌｏｏｄ　ａｎｄ　ｌｙｍｐｈ　ｖｅｓｓｅｌ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ：ａ　ｐｒｏ－　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｌ　Ｒｅｐ，２００３，１０（４）：９３９－９４３．　［２］Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ　Ｊ，Ｋｉｔａｍｕｒａ　Ｋ，Ｋａｂａｓｈｉｍａ　Ａ，ｃｔ　ａ１．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｃｅ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｌ　ｇｒｏｗｔａｈ　ｆａｃｔｏｒ－Ｃ（ＶＥＧＦ—Ｃ）ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｓｐｅｃｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｂｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２００６，９４　（１１）：１６４３—１６４９．　（收稿１３期：２００７－０９—１８）　５－Ａｚａ—ＣｄＲ对胃癌细胞系ＢＧＣ８２３生长　及ｐ２７ｋｉｐｌ基因异常甲基化的影响　王贺玲　，张健　。孙军　，李岩¨，王学清　（１沈阳市第一人民医院，辽宁沈阳１１００４１；２锦州市中心医院；３中国医科大学附属盛京医院）　［摘要］选择浓度为１×１０　ｍｏｌ／Ｌ的５．氮杂＿２　一脱氧胞苷（５－Ａｚａ－ＣｄＲ）处理体外培养的ＢＧＣ８２３细胞后，用　ＡＯ染色检测药物处理后细胞增殖情况；ＭＳＰ法检测用药前后细胞中Ａｐａｆ－１基因的甲基化状态；ＲＴ—ＰＣＲ法检测用　药前后细胞中ｐ２７ｋｉｐｌ的ｍＲＮＡ表达的变化。结果显示，药物作用细胞增殖明显受到抑制，ｐ２７ｋｉｐｌ基因的甲基化　状态得到了逆转，ｐ２７ｋｉｐｌ基因的ｍＲＮＡ表达得到增加。认为５－Ａｚａ．ＣｄＲ对ＢＧＣ８２３细胞具有增生抑制作用，　ｐ２７ｋｉｐｌ基因的表达情况与其甲基化状态的改变有关。　［关键词］５．氮杂Ｉ２　．脱氧胞苷；基因，ｐ２７ｋｉｐｌ；胃肿瘤；甲基化　［中图分类号］Ｒ７３５．２　［文献标识码］Ｂ　［文章编号］１００２－２６６Ｘ【２００８】０１－０１２０－０２　ｐ２７ｋｉｐｌ是已经确认的抑癌基因，研究表明　ｐ２７ｋｉｐｌ基因在多种肿瘤细胞及肿瘤细胞系中失活，　异常的ＤＮＡ甲基化修饰是ｐ２７ｋｉｐｌ基因失活的主要　机制¨　。本研究选择１×１０　ｍｏｌ／Ｌ　５．氮杂．２　．脱氧　胞苷（５－Ａｚａ—ＣｄＲ）作为工作浓度，对该药物与　ＢＧＣ８２３细胞生长状态的关系进行进　步的研究，同　时对ＢＧＣ８２３细胞系ｐ２７ｋｉｐｌ基因的甲基化的状态　公司产品。　１．２检测方法　１．２．１　丫啶橙染色检测细胞生长情况取对数生　长期的细胞以１×１０　／ｍｌ接种于６孔细胞培养办，孔　中预先放入经１％多聚赖氨酸处理的小盖玻片，待细　胞爬片后，加药处理，空白组加入同体积的ＲＰＭＩ　１６４０。１×１０　ｍｏｌ／Ｌ的５．Ａｚａ．ＣｄＲ作用７２　ｈ后，取　进行观察，进一步探讨该抑癌基因表达与其甲基化　状态的相关性。　１材料与方法　１．１材料ＳＧＣ７９０１细胞系，ＢＧＣ８２３细胞系购自　中国医科大学细胞生物教研室，５－Ａｚａ．ＣｄＲ、ＲＴ．ＰＣＲ　试剂盒购自ＴａＫａＲａ公司，Ａｎｎｅｘｉｎ＿ｖ－ＦＩＴＣ凋亡检测　试剂盒为北京宝赛生生物技术有限公司生产，ＲＰＭＩ　１６４０培养基为Ｈｙｃｌｏｎｅ产品，Ｔａｑ酶及ｄＮＴＰ均为　ＴａＫａＲａ公司产品，Ｗｉｚａｒｄ　ＤＮＡ　Ｃｌｅａｎ．ｕｐ为Ｐｒｏｍｅｇａ　・通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｍｈ—ｗＭ＠ｔｏｍ．ｃｏｒｎ　１２０　出盖玻片，并使有细胞的面向下倒扣在预先滴有ＡＯ　染液的载玻片上，立即置荧光显微镜下观察并摄片。　１．２．２　ＭＳＰ方法检测ｐ２７ｋｉｐｌ的甲基化状态应用　饱和酚一氯仿抽提各组及ＢＧＣ８２３细胞基因组　ＤＮＡ，取２０　Ｉ．Ｌｇ　ＤＮＡ溶于４５　ｌ去离子水中，加入５　３　ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ　７５　ｏＣ　１５　ｍｉｎ后，立即放在冰上，　经新鲜配制６０　ｍｍｏｌ／Ｌ的５　ｌ氢醌，４．８　ｍｏｌ／Ｌ的亚　硫酸钠３２０　Ｉｘｌ处理，５５℃水浴过夜，用Ｗｉｚａｒｄ　ＤＮＡ　Ｃｌｅａｎ—ｕｐ纯化回收ＤＮＡ用于甲基化特异ＰＣＲ分析。　甲基化引物：上游５　一ＣＧＡＣＧＴＣＧＧＴＡＡＧＧ１ＴｒＧ一３　，　下游５　．ＡＡＡＣＧＣＧＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＧ＿３　，ＰＣＲ反应条　维普资讯 http://www.cqvip.com 山东医药２００８年第４８卷第１期　件：９４℃变性４５　ｓ，５５℃复性４５　ｓ，７２　ｏｅ延伸６０　ｓ，　共３８个循环，扩增长度为１９３　ｂｐ。非甲基化引物上　游：５　一ＴＧＴＧＡ，ｒＩＷＧＡＴＧｒｌｑ＇ＧＧＴＡＡＧＧＴ－３　，下游：５　一　２．３　５－Ａｚａ—ＣｄＲ对细胞中ｐ２７ｋｉｐｌ基因ｍＲＮＡ的影　响５－Ａｚａ—ＣｄＲ处理前ＢＧＣ８２３细胞系的ｐ２７ｋｉｐｌ基　因的ｍＲＮＡ为表达缺失，在经５－Ａｚａ—ＣｄＲ处理２４、　４８、７２　ｈ后，ｐ２７ｋｉｐｌ基因的ｍＲＮＡ表达明显增加，光　ＣＡＡＡＣＣＡＣ　ＡＡＣＣＣＡＡＡＣＴＣＴ－３　，循环条件：９４　ｏＣ变　性４５　ｓ，５５℃复性４５　ｓ，７２　ｏＣ延伸６０　ｓ，共３８个循　环。扩增长度为２２３　ｂｐ。　１．２．３半定量ＲＴ—ＰＣＲ分析ｐ２７ｋｉｐｌ表达用ＴＲ—　Ｉｚｏｌ试剂提取各组ＢＧＣ８２３细胞总ＲＮＡ。用逆转录　酶和Ｏｌｉｇａ（ｄＴ）２０引物合成ｃＤＮＡ。Ｐ２７ｋｉｐｌ引物序　密度值（ｐ２７ｋｉｐｌ／ｆｌ—ａｃＯｎ）分别为０．４６±０．０１２、　０．８７２±０．０３５和０．８９８±０．０２１，并且有一定的时间　依赖性。　３讨论　因甲基化导致转录灭活的基因对ＤＮＡ甲基化　列上游引物：５　一ＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＴＧＧＡＡ－３　，下游　引物：５　一ＧＣＴＩ＇ＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＴＧＡ－３　，扩增长度为　４９８　ｂｐ。以１３一ａｃｔｉｎ为内参，上游引物：５　一ＧＴ—　ＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡ－３　，下游引物：５　一ＣＴＣＣＴ．　ＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡ　Ｃ－３　，扩增长度为４９８　ｂｐ。　两对引物分别加入２５　ｌ反应体系中，ＰＣＲ反应条　件：９４℃变性４５　ｓ，５７℃复性４５　ｓ，７２　ｏＣ延伸６０　ｓ，　共３５个循环。ＲＴ—ＰＣＲ产物经２％琼脂糖胶分离，用　Ａｌｐｈａ　Ｉｍａｇｅ　２０００自动成象仪摄影，用Ｆｌｕｏｒｃｈｅｍ　Ｖ　２．０　Ｓｔａｎｄ　Ａｌｏｎｅ软件分析ＲＴ—ＰＣＲ产量。　１．３统计学方法结果以ｘ±ｓ表示，所得数据用成　组设计资料的ｔ检验进行分析。　２结果　２．１　５－Ａｚａ—ＣｄＲ对细胞凋亡的影响５－Ａｚａ—ＣｄＲ作　用７２　ｈ后，细胞形态改变明显，核质比例减少，核仁　不明显，部分细胞细胞膜有不规则突起，部分细胞表　面皱缩、内陷，随作用时间增加，有些细胞成团聚集，　体积变小，细胞皱缩呈圆形或卵圆形，细胞核固缩，　染色质边集，出现凋亡相关的形态学改变甚至部分　细胞死亡脱落，脱壁悬浮。　２．２　５一Ａｚａ—ＣｄＲ对细胞中ｐ２７ｋｉｐｌ基因甲基化状态　的影响　见图１。从电泳图可见，ｐ２７ｋｉｐｌ基因在　ＢＧＣ８２３细胞系中均为甲基化的纯合子，而在经过５一　Ａｚａ—ＣｄＲ处理后，则出现了杂合状态，即该基因甲基　化得到了逆转。　ｌ　２　３　４　Ｍａｒｋｅｒ丽—－．　而　５００　ｂｐ　２５０　ｂｐ　图１　５－ａｚａ－ＣｄＲ作用后ｐ２７ｋｉｐ１基因甲基化状态的改变　注：１为对照组；２～４为５－ａｚａ－ＣｄＲ作用２４、４８、７２　ｈ；Ｍ为甲基化　条带；ｕ为非甲基化条带；Ｍａｒｋｅｒ为ＤＩ２２０００　抑制剂非常敏感，易重新活化　Ｊ。理论上，细胞基因　如果仅出现高甲基化而无突变或缺失，在去甲基化　后基因能重新表达。甲基化抑制剂是胞苷类似物５一　Ａｚａ—ＣｄＲ，它的作用机制是能与ＤＮＡ甲基转移酶共　价结合，降低ＤＮＡ甲基转移酶的生物活性。本研究　证实５－Ａｚａ—ＣｄＲ对人胃癌细胞系ＢＧＣ８２３有显著的　增殖抑制的作用。　肿瘤细胞凋亡受众多凋亡相关基因调控，　ｐ２７ｋｉｐｌ基因所表达的蛋白是细胞周期依赖性激酶　的负性调控因子，属于ｃｉｐ／ｋｉｐ家族，能阻断细胞周　期从Ｇ，期到ｓ期的转换，而且在许多肿瘤组织中存　在着表达异常－３】，本实验结果显示，ｐ２７ｋｉｐｌ基因在　胃癌细胞ＢＧＣ８２３细胞中有异常甲基化修饰，并影　响基因的转录，失去其作为抑制基因的功能，促使细　胞发生恶性行为。胃癌ＢＧＣ８２３细胞经５－ａｚａ—ＣｄＲ　处理后，ｐ２７ｋｉｐｌ基因甲基化状态出现了逆转，并且　随着药物作用时间的延长，ｐ２７ｋｉｐｌ基因甲基化状态　逐渐减弱，ｐ２７ｋｉｐｌ基因的ｍＲＮＡ因此恢复表达，表　明５－ａｚａ—ＣｄＲ可重新激活因甲基化失活的ｐ２７ｋｉｐｌ　基因，并逆转恶性肿瘤细胞的表型行为。　综上所述，５－Ａｚａ—ＣｄＲ抑制胃癌细胞ＢＧＣ８２３增　殖及诱导凋亡的机制可能与提高ｐ２７ｋｉｐｌ基因表达　有关。我们认为ｐ２７ｋｉｐｌ基因在胃癌细胞系中的弱　表达与其启动子ＣｐＧ岛的异常甲基化修饰有关，５一　Ａｚａ—ＣｄＲ去甲基化能恢复ｐ２７ｋｉｐｌ基因的功能，这也　为胃癌的诊断及去甲基化治疗提供了依据。　［参考文献］　［１］Ｎａｋａｔｓｕｋａ　Ｓ，Ｌｉｕ　Ａ，Ｙａｏ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｒｅｇｉｏｎ　ｉｎ　ｐ２７　ｇｅｎｅ　ｐｌａｙｓ　ａ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｌｙｍｐｈｏｉｄ　ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ　［Ｊ］．１ｎｔ　Ｊ　Ｏｎｃｏｌ，２００３，２２（３）：５６１－５６８．　［２２　Ｗｉｊｅｒｍａｎｓ　ＰＷ，Ｋｒｔｄｄｅｒ　ｊｗ，Ｈｕｉｊｉｇｅｎｓ　ＰＣ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｉｎｆｕ－　ｓｉｏｎ　ｏｆ　ｌｏｗ－ｄｏｓｅ　５－Ａｚａ－２　－ｄｅｏｘｙｅｙｔｉｄｉｎｅ　ｉｎ　ｅｌｄｅｒｌｙ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ－　ｒｉｓｋ　ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｅ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ［Ｊ］．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１９９７，１１（１）：１－５．　［３］高红，张志波，尚海．ｐ５７ｋｉｐ２和ｐ２７ｋｉｐｌ基因ｍＲＮＡ在胃癌组织　中的表达及意义［Ｊ］．中国医科大学学报，２００４，３３（６）：５２５－５２９．　（收稿１３期：２００７．１１－２６）　ｌ２ｌ