三种来源的α-烯醇化酶重组表达及单克隆抗体的制备

三种来源的α-烯醇化酶重组表达及单克隆抗体的制备

烯醇化酶是一种高度保守的蛋白质,最早作为糖酵解过程的关键酶为大家所熟知,它能够分别在糖酵解和糖异生过程中催化磷酸甘油酸(PGA)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)之间的相互转化。除了在糖酵解过程中控制能量产生以适应机体需求,不同生物体内的α-烯醇化酶在不同的组织部位有不同的功能。

大量临床数据表明α-烯醇化酶作为自身抗原成分参与类风湿关节炎的治病过程,类风湿关节炎患者血清中环瓜氨化肽抗体以及抗瓜氨化烯醇酶抗体的形成等这些对抗瓜氨化蛋白抗体的阳性反应与类风湿性关节炎关系密切。然而α-烯醇化酶自身抗体是否直接参与类风湿关节炎的诱发目前还不清楚,本文旨在研究α-烯醇化酶特异性单克隆抗体以用于类风湿关节炎的诊断和治疗。

本文通过从大肠杆菌、牙龈卟啉单胞菌和人类基因组中通过PCR扩增获得三种不同来源的enolase,利用分子克隆技术构建重组表达质粒,以进行原核表达。将可溶性表达的三种蛋白作为抗原,免疫小鼠,间接ELISA法检测制备的这三种抗体血清效价,采用杂交瘤技术制备烯醇化酶特异性单克隆抗体。

研究结果如下：1.从大肠杆菌、牙龈卟啉单胞菌和人类基因组中通过PCR扩增得到三种来源的enolase基因,构建了重组表达质粒pET-Eno、pET-Peno和pET-Heno,并在宿主大肠杆菌中BL21(DE3)诱导表达。经SDS-PAGE分析,检测到高效的可溶性表达。

通过比较不同诱导条件下的表达趋势,得到最优表达条件：37℃,0.5 mM IPTG,6 h。2.将含有重组质粒的大肠杆菌中BL21(DE3)诱导6h时集菌,高压破碎取上清制样,将样品进行SDS-PAGE。

采用4℃预冷的KC1染色,切下目的条带,碾磨成糊状用生理盐水稀释至0.1 mg/mL,作为抗原皮下多点注射,免疫Balb/c小鼠。间隔两周免疫,共免疫4次,每次免疫前尾部静脉取血。

间接ELISA法检测血清中抗体效价,选择效价高者用于单克隆抗体的制备。3.单克隆抗体的制备：取对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和高效价免疫小鼠的脾细胞在50%PEG1500作用下进行融合,融合12 h添加HAT选择培养基,10-15天后取上清液用双抗夹心ELISA法(2μg/mL羊抗小鼠IgG为包被抗体,HRP标记兔抗小鼠IgG为捕获抗体)筛选阳性克隆,筛选到一株特异性结合的烯醇化酶特异性单克隆抗体。