腺相关病毒概述

引言

腺相关病毒（AAVs）是一种复制缺陷型细小病毒，其生产性感染需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。AAV无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以生产出无需辅助病毒的重组人血清型2型腺相关病毒（AAV-2）。AAV HELPER-FREE SYSTEM利用已经明确用于调节AAV复制和表达的腺病毒基因产物，并且这些基因产物能通过转染引进宿主细胞。在AAV HELPER-FREE SYSTEM中，生产具感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（例如：E2A,E4和VA RNA 基因）大部分由和人AAV-2载体ＤＮＡ共转染进细胞的pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。本系统包括通过改良HEK293腺相关病毒生产能力而衍生出的AAV-293细胞。通过消除对活的辅助病毒的需求，AAV Helper-Free System提供一个更安全，更纯净和更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因传递系统。

野生型AAV-2基因组由病毒rep和cap基因（分别编码复制和基因）及位于两侧的包含所有辅助和包装必须的顺式作用元件的反向末端重复序列（ITRs）组成。在AAV Helper-Free System中，rep和cap基因从病毒载体中移除并转移到pAAV-RC质粒中，AAV-2 ITRs仍位于病毒载体中。AAV rep和cap基因的转移允许感兴趣的外源基因插入病毒基因组中。本系统可以容纳最大插入3kb。

在传统的基因传递系统中，有一个很大的顾虑是通过重组而恢复病毒野生型。在本系统中，包含AAV-2末端重复序列的质粒(pAAV-MCS, pAAV-LacZ 和pAAV-hrGFP 以及 pAAV-IRES-hrGFP)与包含rep/cap基因的质粒(pAAV-RC)没有任何共同区域，从而阻止通过重组来野生型AAV-2。为了确保这种无共同区域的保持，只用本系统提供的组件是非常重要的。特殊情况下，只能用pAAV-RC作为rep和cap基因的来源和包含ITR的载体进行共转。

在AAV载体生产和AAV储存液滴度测定步骤中，AAV Helper-Free System都消除了对野生型腺病毒进行共感染的需求，使本系统成为彻底的无辅助病毒系统。而传统的AAV载体滴度测定时，需要野生型腺病毒和AAV载体储存液进行共感染。由于细胞类型的不同，进行滴度测定时用腺病毒进行共转染的最佳MOI值也是不同的，通常需要进行优化，这就导致了共转染进行滴度测定的方法变的复杂。在我们AAV Helper-Free System中独创了一个新颖的无腺病毒滴度测定方法，去除了对腺病毒进行共感染的需求，而且得出同腺病毒共感染方法相同的结果。

重组腺相关病毒是基因传递和表达的一个重要工具。AAV Helper-Free System具有广泛的宿主范围，高滴度病毒生产能力和长期的基因转染潜力的特征。AAV具有广泛的细胞类型感染能力，并且不依赖于宿主细胞活跃的分裂能力。另外，由于本系统不包含任何野生型病毒产品，宿主细胞免疫反应被降至最低，从而允许对具有免疫能力的宿主细胞进行基因传递。对于哺乳动物细胞基因传递策略，高滴度的重组病毒生产能力是必须要顾及的。AAV Helper-Free System可以生产出重组病毒滴度≥107病毒颗粒/毫升的病毒原液（浓缩后可以获得更高的滴度，文献报道浓缩后滴度最高可达≥1012病毒颗粒/毫升。浓缩及纯化方法见参考文献）。

AAV-2在复制许可的前提下具有复制到染色体上的能力，所以AAV-2在长期基因表达方面有特别重要的价值。缓慢分裂期或非分裂期细胞可以长期保存AAV-2基因组于染色体上，并能稳定表达。高速分裂期细胞在细胞复制和分裂后失去染色体上病毒基因组，并因此失去基因表达能力。病毒整合进基因组也会

发生，但是整合事件是罕见的。如果进行极高的复感染或者细胞被感染过并表达腺病毒复制酶，整合事件发生的频率则会增加。

腺相关病毒用于基因传递和表达的优势 较高的生物安全级别

AAV-2是天然缺陷型病毒（生产性感染依赖于几个额外的反式因子），并且目前还没有发现它和任何的人类疾病有关联。在AAV Helper-Free System中，AAV-2 反向重复（ITR）序列和rep/cap基因分别位于缺少共同序列的单独的质粒上，以阻止生产出重组野生型病毒。这样特征赋予了作为病毒来源的基因传递和表达系统的AAV Helper-Free System一个较高的生物安全级别。

宿主细胞范围广

腺相关病毒可以感染广泛的哺乳动物细胞并且以成功应用于人类和非人来蛋白的表达。和其它病毒来源各种载体相比，已证明用于具有免疫活性细胞的基因表达时，腺相关病毒载体效果更好。

高滴度

按照此手册重组AAV-2可以生产出≥107 病毒颗粒/毫升的高滴度病毒。文献报道病毒原液经浓缩后滴度最高可达≥1012病毒颗粒/毫升。

宿主细胞活跃的分裂不是感染的必要条件 重组腺相关病毒能感染分裂期和非分裂期细胞。 表达出的人类蛋白质可以正确的折叠和修饰

因为AAV Helper-Free System可以传递基因进入宿主人类细胞系，所以利用此系统表达的人类蛋白质可以正确的进行翻译后的修饰和折叠。

长期的基因表达潜能

重组AAV-2能保存于人类宿主细胞中，保持长期的基因转录潜能。在所有的细胞群中，病毒基因组通常存在于染色体上，一般形成串联体。这些串联体在缓慢分裂或非分裂细胞内稳定存在，在细胞群内长期进行基因转录和表达。然而，在处于高速分裂的细胞群内，则会丢失染色体上AAV基因组。病毒能整合今进宿主基因组，导致基因在分裂期细胞内长期表达，但是这是稀有事件。如果使用极高感染复数（MOI）的AAV进行感染或细胞被感染过野生型腺病毒并表达腺病毒复制酶，则整合发生的可能性会增加。然而，使用野生型腺病毒来增加整合事件会降低AAV系统的生物安全性。

AAV System简述

使用AAV System生产重组AAV颗粒。第一步是把外源基因克隆进合适的载体。大多数情况下，外源基因被克隆到一个包含ITR/MCS的载体中（pAAV-MCS 或pAAV-IRES-hrGFP）。这些载体中反向末端重复（ITR）序列提供所有AAV-2复制和包装必须的顺式作用元件。

在一些情况下，插入到含ITR的载体的某些序列由于大肠杆菌内ITRs之间的同源重组而发生序列重排。这时，外源基因应首先克隆进穿梭载体pCMV-MCS中，构建鉴定完成后，将包含表达框的Not I片段亚克隆进已经经Not I酶消化好的包含ITR的pAAV载体中。

重组表达质粒同pHelper（携带腺病毒来源的基因）和pAAV-RC（携带AAV-2复制和衣壳基因）共转染进AAV-293细胞（提供AAV复制和包装所需的所有反式作用因子）。从被感染AAV-293细胞中收集AAV-2病毒颗粒，随后用于感染各种哺乳动物类细胞。

感染宿主细胞后，基因表达前，单链病毒必须变成双链病毒。病毒互补链的合成依赖于细胞复制因子。这个转变是重组基因表达的限制步骤，可以通过腺病毒双重感染或依托泊苷（喜树碱或丁酸钠）来加速。然而，加速基因表达的试剂对目标细胞是有毒的，如果残留到细胞上会杀死目标细胞。因此依托泊苷只能短期使用或为了提高病毒滴度时使用。通常，为了基因的稳定表达，AAV基因组在细胞内会形成高分子量多联体。

腺相关病毒包装细胞AAV-293 冻存AAV-293细胞的复苏：

1、将10mlDMEM生长培养基（见培养基和试剂的准备）加入15ml圆锥管中。

2、将细胞冻存管放入37℃水浴中轻轻摇动1-2分钟使之融解。从水浴中拿出冻存管并通过用70%酒精（室温）擦拭管表面进行净化。

3、将融解的细胞悬浮液移至装有10 ml生长培养基的锥形管中。 4、200×g，3分钟，室温离心收集细胞。吸去生长培养基。

5、加入5 ml新鲜生长培养基到锥形管中，用吸液管上下轻轻吹打使细胞悬浮。

6、将5 ml细胞悬浮液移至75cm2含有10 ml新鲜生长培养基的组织培养瓶中。将细胞放入37℃，5%CO2培养箱中。

7、每天监视细胞密度。当细胞培养至50%汇合率时要进行传代。接下来进行AAV-293细胞传代或AAV-293细胞液氮存贮液的准备。

AAV-293细胞的传代：

注：下述的实验方案是从75cm2组织培养瓶中传代细胞。

当细胞单层达到50%汇合率时需要进行传代，如果细胞汇合率超过70%，AAV-293细胞会失去增强的病毒生产表型。

1、在37℃水浴中预热DMEM生长培养基和胰酶-EDTA溶液。

2、移去生长培养基。用10 mlPBS(phosphate-buffered saline)清洗细胞一次。 3、用5 ml胰酶-EDTA溶液消化细胞1-3分钟。

注：用胰酶-EDTA溶液作孵育细胞的时间最短需要使贴壁细胞从培养瓶上脱落下来。这个过程可以使用倒置显微镜监视，过度消化会破坏或杀死细胞。

4、用5 ml生长培养基稀释细胞以使胰酶失活。

5、分别转移2 ml的细胞悬浮液到每一个175cm2的组织培养瓶，共5瓶。每一瓶含有28 ml的生长培养基。将细胞放入37℃，5%CO2培养箱中。每天查看细胞密度，细胞汇合率要维持在50%。

AAV-293细胞液氮冻存：

1、37℃水浴预热DMEM生长培养基，胰酶-EDTA溶液和冻存培养基。

2、收集健康的处于对数生长期的细胞。吸去生长培养基，用10 ml PBS清洗细胞。用胰酶-EDTA溶液作用于细胞1-3分钟。

注：用胰酶-EDTA溶液作孵育细胞的时间最短需要使贴壁细胞从培养瓶上脱落下来。这个过程可以使用倒置显微镜监视，过度消化会破坏或杀死细胞。

3、用10ml生长培养基稀释细胞阻止胰酶作用。转移细胞悬液到50ml离心管中。取一小份细胞用血细胞计数器计数。

4、200 × g，10分钟，室温离心收集细胞。吸除生长培养基。

5、用冻存培养基（见培养基和试剂的准备，不含抗生素）再悬浮细胞至1×106个/ml，然后分装细胞悬液到2ml冷冻管，1 ml/管。

6、通过逐渐降温冷冻细胞。将小管至于泡沫盒然后将盒子放入-80℃冷冻过夜。 7、转移冻存细胞的小管到液氮中长期保存。 初级AAV溶液的制备： 准备AAV-293细胞

在每一个100-mm组织培养盘10 mlDMEM生长培养基中加入3×106 个AAV-293细胞，48小时后用于转染。

注：为了获得较高的滴度，AAV-293细胞的健康和传代的密度是非常重要的因素。当细胞汇合率达到50%时须传代。当细胞在低代并生长健康是进行大量冻存是非常重要的。当传代和铺板用于转染时要避免细胞成团。在用AAV质粒转染之前细胞或许会生长到较高的汇合率。

AAV-293细胞的转染：

尽管大量的转染实验方案可以成功用于这些载体的转染，但是推荐使用百恩维HET高效转染试剂盒。本实验方案用于转染AAV-293细胞时，可稳定获得高滴度。进一步获得高滴度AAV病毒。