农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系

2 02 0 年 2 月

林 业 科 学

SCIENTIA SILVAE

SINICAE

Vol. 56, No. 2Feb.,20 20

doi：10. 11707/j.l001-74==. 20200209农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系刘闵豪 徐郡儡 叶 靖李周岐 范睿深李 龙%西北农林科技大学林学院杨凌712100)!摘 要：【目的】优化杜仲叶片愈伤组织的再生体系，研究愈伤组织对抗生素和抑菌剂的敏感性,探索影响农杆 菌介导杜仲愈伤组织遗传转化的最适转化因子水平，构建农杆菌介导的杜仲愈伤组织瞬时转化体系，使杜仲成年

植株外植体为受体的遗传转化成为可能，为杜仲基因功能的研究与定向改良奠定基础。【方法】以杜仲成年植株

叶片为材料诱导愈伤组织，通过添加不同浓度植物生长调节剂与大量元素的MS培养基进行不定芽的诱导与增殖， 确定最适培养基$在此基础上，在培养基中添加不同浓度抗生素及抑菌剂,研究愈伤组织对其敏感性$以获得的

叶片愈伤组织受体系统为基础，通过,6%45)的正交试验,探索不同转化因子对农杆菌介导叶片愈伤组织遗传转化

的瞬时转化效率的影响，建立最适瞬时转化体系$使用获得的瞬时转化体系对愈伤组织进行遗传转化操作，筛选抗

性芽,对抗性芽进行GUS组织化学染色与PCR检验$【结果】再生体系优化的结果表明，3/4大量元素浓度的MS培

养基能够促进杜仲愈伤组织不定芽的诱导及生长；愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS +0. 27 pnol-L-1

NAA + 4. 4 pmol-L-1 6-BA,诱导率为=3%±10.0%；不定芽复壮的最适培养基为 3/4MS + 0. 054 pmol-L-1 NAA + 4.4 pmo.LT 6-BA,平均伸长长度为%2.47±1.33) cm$抗生素与抑菌剂敏感性试验表明,遗传转化的选择培养基

中，抑菌剂头抱霉素的最适浓度为200 ms，1，筛选用的抗生素卡那霉素最适浓度为70 mg-,1 $转化因子的正交 试验表明，最适的农杆菌介导杜仲叶片愈伤组织遗传转化的转化因子组合为：预培养5天、侵染10 min和共培养

3天$使用最适瞬时转化体系对约200个愈伤组织进行遗传转化操作，共筛选获得3个抗卡那霉素的抗性芽；GUS

组织化学染色显示G5S基因在抗性芽中得到了表达，PCR检测证明这些抗性芽中存在NPT'基因$【结论】杜仲

叶片愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS + 0.27 pmol-L1 NAA + 4.4 pmol-L1 6-BA,不定芽复壮的最适

培养基为3/4MS + 0. 054 pmol-L'1 NAA + 4.4 pmol-L'1 6-BA$农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织瞬时转化体系为：

预培养5天、侵染10 min和共培养3天，筛选培养基为3/4MS + 0. 054 pmo. L1 NAA + 4.4 pmo. L1 6-BA + 200 mg-L1Cef + 70 mg-L1Km$利用此体系共获得3个抗性芽,PCR分析和GUS组织化学染色都表明T-DNA已 整合到抗性芽基因组中$关键词： 杜仲；农杆菌介导遗传转化；再生体系；GUS瞬时表达文献标识码：A

中图分类号：S718.46 文章编号：1001-7488( 2020) 02-0079-10Agrobacterium tumefaciens -Mediated Transformation of Leaf Callus in

Eucommia ulmoiUrsLiu Minhao Xu Junlei Ye Jing

% College of Forestry, Northwest

Li Zhouqi Fan Ruishen Li LongUniversity YangUng 712100)Abstract: 【Objective) To optimize the ccllus regenextion system for Eucommia ulmoiVst leef explants, to assess thesensitivity oO ccllus to Km and Cef, and to determine the optimum factoe levels foe Agrofacterium ymghOens-mediated

transformation, in order to allow foe genetiv transformation of adult plant of E. ulmoiVet.【Method) Callus was induced from lewes of E. ulmoiVet adult plants. It was inoculated in diferent cencentrations of MS medium, NAA and 6-BA to

optimiee cultuee condition sooead eentitiou sbud indu ction and eegene eation.En addition, dioeeentconcenteationsooKm and

Cef were added to the culture medium to study ccllus sensitivity. Based on the obtained ccllus receptoo system foe leaves,

an L]6 % 45 ) orthogonal array experiment was ccnducted to explore the effect of diferent ecnversion factors onAgrooacterium-mediated transformation eeiciency. Transformation with an optimum ccmbination of factoe was used to收稿日期：2019-03-01；修回日期：2019-05-08。基金项目：陕西省科技统筹创新工程计划项目％ 2013KTCL02-03 )；陕西省重点研发计划% 2019NY-012 )；中国博士后科学基金资助项目

% K3080218027) $*李周岐为通讯作者$80林业科学56卷obtain Km-resistant buds, which were assessed as transformants by GUS histochemical staining and PCR. [ Result) MS

medium at 3/4 strength promoted the induction and growth of adventitious buds in E. ulmoides. The optimum medium foe

induction of advvntitious buds in callus was 3/4MS + 0. 27 (mmol • L\"1 NAA + 4. 4 (mmol • L\"1 6-BA, with induction rate of 83%±10. 0% ; The optimal medium foe advvntitious bud rejuvvnation was 3/4MS + 0. 054 (mmol• L\"1 NAA + 4. 4 (mmol•

L\"1 6-BA, with an avvraae growth length of % 2.47 ± 1. 33 ) cm. Sensitivity testing of antibiotio and bacteriostatic agents showed thatin theseleted medium ooegeneti teansooemation, the optimal onUent eations o oCe oand Km ooeseeeningweee

200 mg * L\"1 and 70 mg * L\"1 , respectively. The orthooonal test showed that the optimum combination of factors for

AgroOacterium-mediated transformation was 5 days of pre-culture, 10 min of infection time and 3 days of cc-cultivvtion.

Genetio transformation of about 200 cdli was cdried out using the optimum instantaneeus conversion system, and three

Km-resistant buds were obtained. GUS histochemiccl stainingshowed that the GUS gene was expressed in thess Km- resistant buds , and PCR analysio demonstrated the presence of the NPT' gene.[ Conclusion) Foe E. ulmoides cdlus , thio

study defined an advvntitious bud induction medium, 3/4MS+ 0. 27 jjimol * L 1 NAA + 4.4 jjimol * L 1 6-BA, and an

advvntitious bud rejuvvnation medium : 3/4MS + 0.054 jmol • L 1 NAA + 4.4 jmol • L 1 6-BA. 4goOac+Oum-mediated transformation of ccllus invvlvvd 5 days of pre-culture, 10 min of infection time and 3 days of co-cultivation, and the

selection medium, 3/4MS + 0.054 jmol • L\"1 NAA + 4. 4 jmol • L\"1 6-BA + 200 mg • L\"1 CeS + 70 mg • L\"1 Km. Three

resistant buds were obtained using thio system. PCR analysio and GUS histochemiccl staining indiccted that T-DNA had

been ontegeated onto the genome o othese Km Bees ostant buds. Th os eepo et demonst eated thatgenetocteansooematoon could be studied in a mature E. ulmoides tree, laying a foundation foe studying gene functions and foe objective-specific improvvment of E. ulmoides.Key words:

Eucommia ulmoides ； AgroOacteoum-mediated traniormation ； reeeneration process； GUS transientexpression杜仲(Eucommia ulmoides )是我国特有的重要经 没有以成熟植株组织为受体的遗传转化体系研究的

济树种$杜仲树皮为传统中药材,现代药理学研究

报道，仅有以下胚轴为受体的遗传转化体系％赵丹

表明，其主要药用成分为木质素、环烯醞话类、黄酮 等,2009 ；李岩等,2011)，下胚轴属于子代材料，不 能代表原优良品种的遗传背景％ Sidorova et al.,

类、苯基丙烷、多糖、氨基酸、其他话类和脂肪族%张 京京等，2014 )$此外,杜仲树皮、树叶及果实中含

2017 )，这一局限性严重制约了杜仲基因功能与遗 传改良的研究$本研究以杜仲优良品种’华仲4号0成年植株

有杜仲胶%反式聚异戊二烯),具有耐水性、耐腐蚀 性、低温塑性、良好的韧性和溶解性,在化工领域具

有巨大的潜力% Fang, 2016)$由于木本植物生长周期长与生长环境控制难等 原因，传统的杜仲杂交育种要经过很长时间才能获

叶片为材料，优化了叶片愈伤组织的再生体系，并在 此基础上研究了愈伤组织对抗生素与抑菌剂的敏感

性$以获得的叶片愈伤组织受体系统为基础,通过 正交试验探索不同转化因子对GUS瞬时表达率的

得新的品种，严重制约了杜仲资源的开发利用$随

着现代生物技术的发展,组织培养与农杆菌介导的 遗传转化技术广泛运用于林木育种研究中，克服了

影响$使用最适转化因子组合对约200个愈伤组织

进行了遗传转化操作,共筛选获得3个抗卡那霉素

% Km)的抗性芽,PCR检测证明这些抗性芽中存在

传统育种的不足,具有良好的前景％ Gm et al

2004) $杜仲组织培养的研究早在20世纪80年代 就开始进行,到目前为止，已有以子叶和下胚轴为外

9PT'基因$本研究构建的体系使得在杜仲成熟材 料中进行基因遗传转化的研究成为可能,为杜仲基

植体的再生体系,以及叶和腋芽的组织培养研究报

因功能的研究与定向改良奠定基础,对杜仲资源的 开发利用具有重要意义$道％ 张朝成，1988； Chen et al., 1995 ； 2008 ；李琰等，

2006；袁云香,2012),在此基础上,对愈伤组织的

继代条件进行了研究,初步构建了以叶片为外植体 的再生体系%金晓玲等，2014 )$尽管如此,杜仲组

1材料与方法1.1试验材料杜仲成年植株叶片采集于西北农林科技大学林

织培养仍存在愈伤组织不定芽诱导率低、不定芽再

生困难等问题%刘慧敏等,2016),这导致杜仲目前 学院试验苗圃种植的’华仲4号’％杜兰英等,

第2期刘闵豪等：农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系812014），该优良品种于2005年从河南灵宝引种至西 北农林科技大学试验苗圃，树龄14年$采集时间为

1.6农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化转

化因子正交试验设计4-5月，此时间段采集的外植体具有最低的污染率 根据农杆菌介导的杜仲下胚轴遗传转化体系 %赵丹等,2009；李岩等,2011）和其他植物愈伤组

% 罗丽,2009 ）$遗传转化使用的植物表达载体为PBI121,含有 该表达载体的农杆菌％ Agrobacterium tumefaciens *菌

织为受体的遗传转化系统％ Yang rt al., 2010 ; Abdallat f al, 2011 ; Trivellini, 2015 ;黄天带等，

株EHA105由西北农林科技大学刘雅莉教授惠赠$ 2010；陈子龙等,2014），本试验选择了 4个可能影 响农杆菌介导杜仲叶片愈伤组织遗传转化效率的转 化因子%预培养时间、侵染时间、共培养时间和乙酰

1.2杜仲叶片的表面灭菌采集的叶片在自来水中冲洗3 h,然后使用 75% % Y/Y）酒精清洗30 s,再浸泡在5% %M/V）次氯

丁香酮浓度）进行研究，通过L16%45）的正交试验表

酸钠溶液中5 min进行表面灭菌,消毒后用无菌蒸 +水冲洗3次,放在无菌滤纸上干燥,切成约

0. 5 cmX0. 5 cm的小片备用$1.3愈伤组织的诱导与增殖将切成小片的叶片接种于愈伤组织诱导培养

基，每瓶3到4片，叶片诱导愈伤组织培养基为 MS + 8. 1 ^mol-L-1 NAA + 4. 4 ^mol-L-1 6-BA$ 接 种后在%24±2） r的温度下暗培养4天,再在光照条

件下培养30-40天,光照周期为每日16 h，温度为 %24±2） r $获得的叶片愈伤组织采用MS + 0.27 !mol-L1NAA + 6. 7 ^mol-L1 6-BA 的继代培养基

%金晓玲等，2014），继代周期为18天$1.4不定芽诱导与复壮培养基的优化将继代培养2个周期的愈伤组织接种于含不同

浓度大量元素的MS % MS ,3/4MS）培养基中,添加不 同浓度的 NAA%0、0. 27、0. 54 ^mol-L1）和 6-BA%0、4.4、6.7、&8 ^mol-L1）,培养3周后,统计不定芽

诱导率％诱导出不定芽的愈伤组织/所有愈伤组

织）$将愈伤组织诱导的不定芽接种到含不同浓度 NAA % 0. 054、0. 27 “mol - L1 ）和 6-BA % 4. 4、& 8

^mol-L1）的MS（ MS,3/4MS）培养基上进行复壮,3 周后测量不定芽伸长长度$每个处理50个愈伤组

织，培养条件同1.3的光照培养条件,整个试验重复 3次,使用SPSS17.0对数据进行处理,采用Tukey 检验进行差异分析$1.5杜仲愈伤组织抑菌剂和抗生素敏感性试验遗传转化的抗性芽选择培养基以不定芽诱导培

养基为基础培养基,抑菌剂为头抱霉素% Cef）,筛选 用的抗生素为卡那霉素% Km）$将愈伤组织分别接 种于含不同浓度 Cef（ 0、50、100、200、300 mg-,1）

和Km%0、25、50、100、200 mg-L1）的不定芽诱导培 养基中，每个处理30块愈伤组织，培养条件同1.3

的光照培养条件$3周后统计不定芽诱导率,分析 愈伤组织对抑菌剂和抗生素的敏感性,以获得最适 合的选择培养基$进行试验设计，转化因子的水平如表1所示$1.7遗传转化操作将-80 r冰箱中保存的农杆菌甘油菌使用接种

环接种于固体LB培养基上划线活化,28 r倒置培 养16 h,再挑取平板上的单克隆接种于50 mL含50

mg-L^1卡那霉素的液体LB培养基中，于28 r、180 r-mv-1的摇床震荡过夜培养,直到ODg。值达到

0.6-0. 7$将农杆菌悬浮液在室温下以4 000 r-min-1

离心10 mv收集菌体,再使用不含激素的无菌液体 MS培养基重悬农杆菌,重悬至OD\"。值达到0.6后

加入不同水平浓度的乙酰丁香酮% AS）备用$正交试验的每个处理均使用50块愈伤组织,接 种于不定芽诱导培养基中进行预培养$将预培养后

的愈伤组织置于农杆菌重悬液中进行侵染，侵染后

使用无菌滤纸吸干菌液,接种于普通的不定芽诱导 培养基，于% 24±2） r条件下进行暗培养$1.8 GUS组织化学染色使用GUS组织化学染色法% Jefferson, 1987）检 测GUS瞬时表达效率$具体为各处理的愈伤组织

在共培养后,置于X-Gluc染色液％ GUS染色液, Solarbiv）中,37 r 染色 6 h,使用 90%% V/V）和 70%

% V/V）的酒精分别脱色24 h,以除去叶绿素$统计

愈伤组织的染色情况,进行染色强度的评级%孟妮

等,2018），并以GUS组织化学染色结果代表GUS

瞬时表达效率%含蓝色GUS染色位点愈伤组织/所 有愈伤组织）,使用SPSS17. 0进行数据处理并进行 方差分析$1.9抗性芽的筛选使用获得的瞬时转化体系对愈伤组织进行遗传

转化操作,将共培养后愈伤组织使用CEFO水%含 200 mg-L-1 Cef的无菌蒸+水）冲洗3次,再在含

100 mg-L^1 Cef的液体MS培养基中浸泡10 min脱

毒，使用无菌滤纸吸干多余液体后，接种于选择培养 基上培养，筛选获得抗性芽，培养条件同1.3的光照

培养条件$筛选出的抗性芽使用GUS组织染色法82林业科学56卷%同1. 8)和PCR法进行检测$5'-TCACTTCGCTCGCGGAGAA-3P，下游引物为1.10抗性芽的PCR检测使用CTAB法从获得的抗性芽叶片中提取总5'-AGAGGVGATAGAGCGAGATGC-3',扩增片段长度为465 bp$PCR反应体系为:94 °C 3 min 预变性；98 °C变性10 s,60°C退火20s,72 °C 延伸 70 s,共30个循环；再72 C延伸5 mo $ PCR产物通过DNA,以没有进行遗传转化操作的不定芽叶片DNA和PBI121质粒作为对照进行PCR检测$以 NPT'基因为检测标准设计特异性引物：上游引物为1%琼脂糖凝胶电泳进行检测$表】转化因子正交试验!Tab. 1 Factors and levels of编号No.预培养时间Pre-culture duration/d』Hn ) orho&onal侵染时间Infection duration/min共培养时间Co-culture duration./dAS浓度AS concentration/% |xmol- L 1 )012340000222255556812127255101583451005346781276152551251001010159410111273225568121351001210101010151415127108142551651063①AS：乙酰丁香酮 Acetosyringone.2结果与分析2.1大量元素与生长调节剂对杜仲叶片愈伤组织 再生体系的影响的MS培养基的不定芽诱导率更高$在3/4MS +

0.27 !mol-L-1NAA + 4. 4 ^mol-,1 6-BA 的培养基

上，不定芽诱导率最高% 83%±10%),并且诱导的芽 更加健康%图1c)$不定芽复壮的结果与不定芽诱

叶片接种到愈伤组织诱导培养基% MS + 8.1

!mol - L“ NAA+ 4. 4 ^mol - L-16-BA)上培养 25 天左

导的结果相似，不定芽的伸长长度受大量元素浓度

影响更显著,在 3/4MS + 0.054 \"mol-L\" NAA +4. 4 \"mol-L1的6-BA的培养基中芽伸长长度最长, 为%2. 47±1. 33) cm% 图 1d) $右，叶片逐渐膨大，并在切口处出现小块愈伤组织， 诱导率达90%,这些愈伤组织在几天内迅速生长

%图1a), 35天左右即需进行继代培养$愈伤组织 接种到继代增殖培养基% MS + 0. 27 !mol・L“NAA+

2.2头抱霉素与卡那霉素对不定芽诱导的影响抑菌剂与抗生素敏感性试验%表3 )表明：在含

6.7 ^mol-,1 6-BA)进行增殖培养时,会在继代培 养20天后出现褐化,因此适宜的继代培养周期为 18-20天，胚性愈伤组织约在连续继代培养2次后

有 300 mg-L1 Cef 和 50 mg-L1 Km 的 MS 培养基

上，愈伤组织仍呈黄褐色,但是无法诱导不定芽；在 含 400 mg-L-1 Cef 和 70 mg・L“ Km 的 MS 培养基

形成%图1b),能够进行不定芽诱导$这些试验结果 与金晓玲等%2014)的研究结果相似$上，愈伤组织则完全褐化死亡$因此，遗传转化的选 择培养基中，抑菌剂头抱霉素的浓度为200 mg-L1, 能抑菌并不会对愈伤组织产生过大影响；筛选用的

不定芽诱导和复壮培养基的优化试验结果%表

2)表明：愈伤组织诱导不定芽的诱导率受到6-BA 和NAA配比的影响，当6-BA与NAA浓度比为16 ： 1 时,不定芽的诱导率最高$此外，3/4浓度大量元素抗生素卡那霉素浓度为70 mg-,1,能够导致不含

Km抗性的野生型愈伤组织死亡,从而筛选出有Km 抗性的抗性芽$第#期刘闵豪等：农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系83图1杜仲叶片诱导愈伤组织及其再生过程Fig. 1 Callus induction and plant regeneration in E. ulmoidesk叶片在愈伤组织诱导培养基% MS + 8. 1 ^mol-L^NAA + 4.4 ^mol• L\"16-BA&上培养5周形成的愈伤组织；3在继代增

殖培养基% MS + 0. 27 ^mol-L-1 NAA + 6.7 ^mol-L-1 6-BA)上继代培养2个周期的愈伤组织；c愈伤组织在不定芽诱导

培养基% 3/4MS + 0. 27 !mol«L_1 NAA + 4.4 ^mol-L-1 6-BA)上培养2周诱导的不定芽；d.在不定芽复壮培养基% 3/4MS +

0.054 ^mol-L-1 NAA + 4.4 ^mol-L1 &上复壮2周的不定芽；e.在不定芽复壮培养基上继代培养2次获得的植株$

a. Callus induction on ccllus induction medium % MS with 8. 1 |jimob L_1 NAA and 4. 4 |jimol• L_ 1 6-BA) aftee 5 weeks ； b. Callus multiplicction on ccllus subculture medium % MS with 0.27 |jimol • L_1 NAA and 6. 7 |jimol • L_1 6-BA) aftee sub-cultured twice； c. Adventitious bud induction on shoot induction medium % 3/4MS with 0.27 ^mol - L_1 NAA and 4. 4 ixmol • L_1 6-BA & aftee

2 weeks； d. Shoot multiplicction on shoot reeeneration medium % 3/4MS with 0. 054 |jimol• L_1 NAA and 4. 4 ixmol* L_16-BA) after 2 weeks ； e. Planis on shoot reeeneration medium after sub-cultured iwice.Tab. 2 Effect of different concentrations of macro-Blement, NAA and 6-BA on shoot induction and regeneration培养基表2不同浓度的大量元素NAA6-BA对杜仲不定芽诱导和复壮的影响①NAA浓度Concenieaioon otNAA/( xmol«L_1 &0.27不定芽诱导率、、Medium6-BA浓度Conccntration of 6-BA/

% jjimol- L_1 &不定芽伸长长度

Percentage of shoot induction % %)

% mean土 SD &Shoot length/cm % mean ±SD )——MSMSMSMSMSMSMSMSMSMS004.44.44.46.70±00±0 f—0.540.0540. 51±0. 48 b0.2753 土7.0 abcd20±8. 7 ef0.86±0.91 ab———0.540.2700.05448 土15.6 bcde24±9. 1 def

—8.88.88.88.8004.44.44.46.70.34±0.41 b0.48±0.27 b———0.2719±4. 5 ef0.540.2755±14. 4 abc3/4MS3/4MS3/4MS3/4MS3/4MS3/4MS3/4MS3/4MS3/4MS3/4MS0±00±0—0.540.0542.47±1.33 a1.39±1.01 ab———0.2783±10. 0 a0.540.2700.05443 ±10.7 bcde60±16.8 ab8.88.88.88.847 ±21.9 bcde—1. 21±0. 65 ab1.03±0.82 ab—0.2726 ±6.0 cdeQ66±11.0 ab0.540. 05&均值差异显著性检验所划分的差异显著性$ Datarepresent meens 土 SD from 3 biologiccl replicctes. Means followed by different letters are significantly differeni using a Tukey tesi % P \" 0. 05 & .①SD表示来自3次试验重复的标准差$数据后的小写字母表示使用Tukey %

84林业科学表3头1霉素(Cef)与卡那霉素(Km)对不定芽诱导的影响56卷Tab. 3 Effects of different concentrations of Cef and Km on shoot induction编号Km浓度Concontrationof Km/ % mg・ L_1)

Cef浓度 不定芽诱导数No.Concontration ofCef/% mg- L_1 )000A0A0A0Numbeo of

愈伤组织状况

shoo rindu oed2115Growing states of callus102050黄绿色,致密 Yellowish green , compaot黄绿色,致密 Yellowish green , compaot2

30001824205黄褐色，致密 Yellowish brown , compaot褐色,死亡Brown , deed褐色,死亡Brown , deed4570100600A0A0A0黄褐色，致密 Yellowish brown , compaot黄褐色，致密 Yellowish brown , compaot黄褐色，致密 Yellowish brown , compaot黄褐色，致密 Yellowish brown , compaot褐色,死亡Brown , deed78100200910

30040002・3农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化的

转化因子他预培养时间%预培养时间的GUS瞬时表达率均值 为：0 天 24.0%、2 天 17.8%、5 天 37.5%、10 天

通过,6%45)的正交试验设计(表1),共进行了 16组不同水平处理的转化因子组合试验,试验结果

27.5%)。根据这些试验结果可以获得农杆菌介导

杜仲叶片愈伤组织遗传转化的最佳转化因子组合 是：预培养5天,侵染10 min,共培养3天$表明：GUS瞬时表达率高的处理组合其愈伤组织染

色程度%图2)也更强%表4),其中侵染时间与共培

2.4抗性芽的检测总计约200块愈伤组织进行了最适转化因子 组合的农杆菌介导的遗传转化,在选择培养基上 共获得3个抗Km的抗性芽％图3 )$对抗性芽的 叶片进行GUS组织化学染色,3个抗性芽叶片均

养时间对GUS瞬时表达率有显著影响%0. 05),

即侵染时间与共培养时间显著影响农杆菌介导杜仲

叶片愈伤组织遗传转化效率,而AS浓度和预培养 时间的影响不显著%表5 )$比较均值可以发现GUS

瞬时表达率随着侵染时间和共培养时间的增加以 “S形”曲线上升％侵染时间的GUS瞬时表达率均值

呈蓝色,而未进行遗传转化操作的愈伤组织和不 定芽叶片的GUS组织化学染色均为无色％图4),

为：6 min 22.0%、8 min 16.0%、10 min 35.0%、 15 min 33.8%；共培养时间的GUS瞬时表达率均值

这表明GUS基因在抗性芽中得到了表达。使用 NPT'基因的特异引物对抗性芽、未进行遗传转化

为：1 天 10.8%、2 天 16.5%、3 天 38.5%、4 天 41.0%),侵染10 min和共培养3天的GUS瞬时表

操作的不定芽叶片和PBI121质粒的PCR分析%图 5 )表明：在抗性植株和pBI121质粒中检测到 NPT'基因的465 bp扩增产物,而在未进行遗传转

达率达到了高值;4天的共培养时间虽然瞬时表达 率均值更高,但提升较小并且对愈伤组织伤害较大$ 此外,虽然预培养时间对GUS瞬时表达率没有显著 影响,但预培养5天的GUS瞬时表达率均值高于其

化的不定芽叶片中没有该扩增产物。GUS检验与 PCR分析初步证明T-DNA已经整合到了这些抗性

芽的基因组中。Fig.2 Pattern of scoring for the histochemical GUS assay of callusK空白对照；b.未染色；o. + %染色程度浅);5 + + (染色程度中等);e. + + + (染色程度强)。a. Blank control； b. Unstained； o. + % staining is shallow) ； d + + % staining moderate) ； e. + + + % staining the strongest).第#期刘闵豪等：农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系表4 转化因子正交试验的GUS瞬时表达①85Tab. 4

编号Transient GUS expression in L16 (45) matrix of factors of genetic transformation染色率 Dyeing rate% % )No.+26+++++GUS瞬时表达率Transient GUS expression frequence% % )26120000322628201248404264016561226440400327891012628226281634281011041056200012216122813144168021822183034151642810①+、+ +和+ + +分别表示染色程度浅、中等和强的愈伤组织染色率%图2 )。+ , ++ , and + + + indicate the staining rate of the callus with a light,

medium and strong level% Fig・ 2)・表5 转化因子正交试验GUS瞬时表达的方差分析①Tab. 5 ANOVA of transient GUSexpression frequency in L方差来源平方和16( 5 ) 4 marrex offacroriofgenerecrraniformareon均方自由度Sources of vvrianceA :预培养时间 Pre-rulture durationSum otsqutaes0.082Degaeeot taeedom3333316Metn squtaeP0.0277.7460.2620.0630.850B : AS 浓度 AS concentration0.0030.1020.2810.0110.0010.0340.0940.004C：侵染时间 Infection duration9.65826.5750. 047 *D :共培养时间 Co-rulture duration误差Error0.012 *总计Total1.618① * :差异显著 Significant difference% P < 0. 05).图3抗Km的抗性芽Fig.3 Km-resistant budsa, b , c.愈伤组织在筛选培养基上培养2周诱导出的3个抗性不定芽$ a, b , e. A total oO 3 Km-resistant buds induced on

the selection medium % 3/4MS + 0. 054 |xmot • L_1 NAA + 4. 4 |xmot • L_1 6-BA + 200 mg• L_1 Cef + 70 mg • L_1 Km )afteo 2 weeks.86林业科学56卷化体系来克服。构建农杆菌介导的遗传转化体系,建立受体系

统的再生体系是前提条件％ Gorpenchenko et al,

2006&。本研究分析了 NAA和6-BA对杜仲愈伤组 织诱导不定芽以及不定芽复壮的影响,其结果与金 晓玲等% 2014&的研究结果相似；此外,本研究还发

现MS培养基只添加3/4浓度的大量元素对杜仲叶

片愈伤组织诱导不定芽以及不定芽的复壮有显著的 促进作用。植物组织培养中,大量元素浓度是重要 的影响因素之一,然而由于大部分试验中均使用MS

图4愈伤组织和抗性芽叶片的GUS组织化学染色

Fig.4 Transient GUS expression of callus and

leaf tissuxs oO Km-resistant budsa,a.对照组%未进行遗传转化操作）愈伤组织和不定芽叶片

的GUS组织化学染色；b.最适转化因子组合进行遗传转化的 愈伤组织的GUS组织化学染色；d.抗Km的抗性芽的GUS组 织化学染色 o a, a. GUS xxpression in callus and lext tissuxs oO

cantrols % untransformed plants & ； b. GUS xxpression in callus oO

optimum transforming factoro cambination : pre-rulture duration of

5 days, infection duration of 10 min and ca-rulture candition of 3 days ； d. GUS xxpression in lexves of Km-resistant buds.MP 1[ 23c500 bp400 bp图5抗性芽、未进行遗传转化操作的不定芽叶片和

pBI121质粒的PCR分析Fio・5 PCR analysio of putative transformant,b ona es exaio epB'1 2 1 and aon ieolsp : pBI121质粒；c：未进行遗传转化操作的不定芽叶片；1,2,3 :

获得的 3 个抗性芽 $ p : Binary vectoa pBI121 ； a : Untransformed

plani； 1 , 2, 3 : Puiaioexieansooemanis.3讨论本研究优化了杜仲叶片愈伤组织的再生体系, 对影响农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化的

转化因子进行了研究。长期以来，杜仲只有一种以 下胚轴为受体的遗传转化体系％赵丹等,2009；李 岩等,2011 &,下胚轴为子代材料,无法代表该优良 品种的遗传背景% Sidorove % al., 2017）。如今,这一

缺点可以通过使用成年杜仲叶片愈伤组织的遗传转

培养基,大量元素浓度对杜仲再生体系的影响被忽 视。一些研究表明,大量元素浓度能够显著影响不

定芽 的培养 ％ Azadi et al, 2010 ； Zhao et al, 2014 ；

周新华等,2017）,甚至影响农杆菌介导的转化效率 % Naik % al, 2011 ）。其原因可能是大量元素的减少 使得培养基中盐浓度降低,促使酚的代谢减少,大大

减轻褐化现象，而褐化是愈伤组织继代培养和不定 芽诱导最主要的干扰因素之一。此外,早在1980 年,Lloyd和 McCown 就 发现 山 月 桂％ Kalmia

latifolia&的茎尖培养更适合于低盐培养基,从而开 发了 WPM % woody plant medium &木本植物培养基

% Lloyd % al, 1980）。本研究的结果也表明，杜仲更 加适合于低盐培养基中培养,这一结果值得进一步 研究。考虑到多因素研究的复杂性,本研究采用了正 交试验研究4种转化因子%预培养时间、AS浓度、侵 染时间、共培养条件&对GUS瞬时表达率的影响。

结果表明侵染时间和共培养条件是影响农杆菌介导

杜仲愈伤组织遗传转化的主要因素,而AS浓度和

预培养时间对其影响不明显。与其他植物相同,侵 染时间对杜仲愈伤组织的遗传转化至关重要,较长 的时间能够提高转化效率。在本研究中,10 min的

侵染时间达到了最高的GUS瞬时表达率并且有较

低的愈伤组织死亡率,这一侵染时间与杜仲的下胚

轴转化体系相同,但比大部分木本植物短,这可能是 由于杜仲对农杆菌EHA105有更高的敏感性%李岩 等,2011 ）o较长的共培养时间则有利于农杆菌将 T-DNA转化到植物基 因组中% Kondo % al, 2000）。

不过,本研究的结果表明，4天共培养时间的GUS瞬 时表达率均值虽高于3天，但提升较小并且对愈伤

组织伤害较大，一些其他植物遗传转化的研究结果

表明共培养时间不宜超过3天,长期的共培养会使 农杆菌过度生长从而导致转化效率降低% Cervera %

al, 1998 ； Curtis % al, 1999 ； Yang % al, 2010）。本研究中获得的3个抗性芽经PCR分析和第2期刘闵豪等：农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系87GUS组织化学染色检验证明，T-DNA已整合到了抗

callus induction of Eucommia ulmoides. Bulletia of Botanical Research，26 ( 2) : 182- 186. . in Chinese])性芽基因组中，表明这一遗传转化体系能够将基因 导入成熟植株的组织培养材料中，为杜仲基因功能

李 岩，赵德刚-2011.妙基因促进杜仲遗传转化不定芽再生.北京

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transformation of Eucommia ulmoiles Olie. Journal of Beijing Forestiy University，33 ( 6) : 90-93. . in Chinese / )与遗传改良的研究奠定了基础$在今后的研究中可

以进一步优化不定芽复壮后的再生体系,完善整个 转化系统，获得转基因植株$刘慧敏，杜红岩，乌云塔娜-2016.杜仲生物技术育种研究进展-湖

4结论本研究对杜仲以叶片为外植体的再生过程进行

南林业科技，43(2) : 132-136.( Liu H M， Du H Y， WuRun T N.2016.Adeanaesin aeseaaah on

biotechnology breeding of Eucommia ulmoiles. Hunan Forestry

了优化，并对影响农杆菌介导的杜仲愈伤组织遗传 转化因子进行了研究$结果表明,添加3/4大量元

素浓度的MS培养基对不定芽诱导和复壮有显著的 促进作用，愈伤组织诱导不定芽最适培养基:

3/4MS + 0. 27 ^mol-L-1 NAA + 4. 4 ^mol-L-1 6-BA,

不定芽复壮的最适培养基：3/4MS + 0.054 ^mol-

L1 NAA + 4.4 ^mol-L1 6-BA$农杆菌介导杜仲叶 片愈伤组织遗传转化最适合的转化因子组合为：预

培养5天、侵染10 min和共培养3天,筛选培养基

为 3/4MS + 0.054 ^mol-L1 NAA + 4. 4 ^mol-L1 6-BA+200 mg-,1Cef + 70 mg-L-1Km$ 利用此体系

共获得了 3个抗性芽，PCR分析和GUS组织化学染 色都表明T-DNA已整合到抗性芽基因组中$参考文献陈子龙，梁玉玲，鲜于梁艳，等• 2014.农杆菌介导的胀果甘草愈伤

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