(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111732628 A(43)申请公布日 2020.10.02
(21)申请号 202010593858.9(22)申请日 2020.06.24
(71)申请人 浙江天台药业有限公司
地址 317200 浙江省台州市天台县城关丰
泽路
申请人 中国计量大学(72)发明人 周益峰 付姿莉 郭一平 杨晓章
陈杨毅 毛志峰 (74)专利代理机构 杭州知闲专利代理事务所
(特殊普通合伙) 33315
代理人 张勋斌(51)Int.Cl.
C07K 5/083(2006.01)C07K 1/06(2006.01)
权利要求书2页 说明书7页 附图1页
CN 111732628 A(54)发明名称
一种GHK三肽的合成方法(57)摘要
本发明公开了一种GHK三肽合成的方法，先
赖氨酸和组氨酸进行保护得到保分别对甘氨酸、
护的甘氨酸、赖氨酸和组氨酸；保护的甘氨酸依次与N‑羟基琥珀酰亚胺、保护的组氨酸和N‑羟基琥珀酰亚胺反应得到Boc‑Gly‑His(Trt)‑OSu,然后再将其与保护的赖氨酸进行反应得到保护的三肽，最后与三氟乙酸反应得到GHK三肽。本发明提供的方法避免了使用钯碳氢气进行脱保护，操作步骤简单稳定安全，相比于已有工艺来说，避免了离子交换脱三氟乙酸或色谱合成的方法，避免了使用树脂，通过使用甲醇，乙酸乙酯等常见经济试剂脱三氟乙酸盐，得到GHK三肽，极大地降低了成本，可用于大规模生产。
CN 111732628 A
权 利 要 求 书
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1.一种GHK三肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在氢氧化钠的作用下，甘氨酸与Boc酸酐在1，4-二氧六环中进行反应，反应结束后经过后处理得到Boc-Gly-OH；
(2)在三乙胺的作用下，组氨酸与二甲基二氯硅烷在二氯甲烷中进行反应，反应完毕再加入含三苯基氯甲烷的二氯甲烷溶液和三乙胺继续反应，反应结束后经过纯化处理Trt-His-OH；
(3)在碳酸氢钠和五水合硫酸铜的作用下，赖氨酸或其盐与Boc-酸酐在丙酮和水的混合溶剂中进行反应，反应结束后经过纯化处理，得到Boc-Lys-OH；
(4)在DCC的作用下，步骤(1)得到的Boc-Gly-OH与Hosu在1,4-二氧六环中进行反应，反应结束后经过纯化处理得到Boc-Gly-OSu；
(5)在DIPEA的作用下，步骤(4)的Boc-Gly-OSu和步骤(2)的Trt-His-OH在DMF中进行反应，反应结束后经过纯化处理得到Boc-Gly-His(Trt)-OH；
(6)在DCC的作用下，步骤(5)的Boc-Gly-His(Trt)-OH与Hosu在二氧六环中进行反应，反应结束后经过后处理得到Boc-Gly-His(Trt)-OSu；
(7)在碳酸氢钠的作用下，步骤(3)的Boc-Lys-OH与步骤(6)的Boc-Gly-His(Trt)-OSu在四氢呋喃和水的混合溶剂中进行反应，反应结束后经过纯化处理得到Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH；
(8)在三乙基硅烷的作用下，步骤(7)的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH和三氟乙酸在二氯甲烷中进行反应，反应结束后经过纯化处理得到GHK三肽三氟乙酸盐；
(9)步骤(8)的GHK三肽三氟乙酸盐溶解在乙酸乙酯和甲醇的混合溶液中，然后加入二乙胺至白色沉淀析出，抽滤，收集滤饼，进行纯化处理得到所述的GHK三肽。
2.根据权利要求1所述的GHK三肽的合成方法，其特征在于，步骤(1)中，反应温度为室温，反应时间为12～24小时；
所述的后处理包括：浓缩，水相用HCl水溶液调节PH至2-4后再用乙酸乙酯萃取，然后干燥过滤，滤液室温浓缩，最后再将浓缩物分离纯化得到Boc-Gly-OH。
3.根据权利要求1所述的GHK三肽的合成方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的纯化处理包括：
反应结束后，加入乙酸乙酯和水搅拌，抽滤，滤饼中加入乙酸乙酯，在高温条件下油浴回流，关闭加热后抽滤，滤饼中加入大量含三乙胺的水溶液，室温条件下搅拌，抽滤，滤饼中加入四氢呋喃和水的体积比为1:1的混合溶液，在高温条件下回流至完全澄清后，分离纯化得到Trt-His-OH。
4.根据权利要求1所述的GHK三肽的合成方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的纯化处理包括：
向反应液中加入乙酸乙酯和水的体积比为1:2的混合溶液，搅拌、抽滤后滤饼中加入8-羟基喹啉和蒸馏水直至体系开始澄清，继续搅拌10-12h，分离纯化得到Boc-Lys-OH。5.根据权利要求1所述的GHK三肽的合成方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的二氧六环与Dcc的体积-质量比为4.5-5.5:1。
6.根据权利要求1所述的GHK三肽的合成方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的纯化处
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权 利 要 求 书
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理包括：
加水稀释，用柠檬酸溶液调节pH为3-4，搅拌、过滤，滤饼用乙酸乙酯溶解、水洗、收集有机层、干燥、浓缩，然后加入甲基叔丁基醚和乙酸乙酯至体系溶清，然后加入石油醚，析出固体，过滤、干燥得到所述的Boc-Gly-His(Trt)-OH。
7.根据权利要求1所述的GHK三肽的合成方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的后处理包括：反应完全后抽滤、滤液浓缩，然后用四氢呋喃溶解，直接进入下一步。
8.根据权利要求1所述的GHK三肽的合成方法，其特征在于，步骤(7)中，所述的后处理包括：
旋蒸除去有机层，静置，将上清液进行抽滤，再用水多次溶解底部沉淀并抽滤，收集滤液，用柠檬酸溶液调节PH为3-4，搅拌，抽滤，收集滤饼，滤饼用乙酸乙酯溶解，水洗，收集有机相，干燥，过滤，滤液浓缩得白色固体，然后用二氯甲烷和石油醚重结晶得到所述的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH。
9.根据权利要求1所述的GHK三肽的合成方法，其特征在于，步骤(8)中，反应温度为室温，反应时间为12～24小时。
10.根据权利要求1所述的GHK三肽的合成方法，其特征在于，步骤(9)中，所述的后处理为用乙酸乙酯进行打浆，抽滤，收集滤饼，旋干得到所述的GHK三肽。
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说 明 书一种GHK三肽的合成方法
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技术领域
[0001]本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种GHK三肽的合成方法。
背景技术
[0002]三肽-1(GHK)是一种内源性胶原三肽，存在于血浆等组织液中，可调节皮肤再生，增强表皮基底细胞的分化和增殖能力，可以促进伤口愈合和组织再生，增加胶原蛋白和粘多糖，刺激核心蛋白聚糖的合成，促进血管生长和神经生长，具有抗氧化和抗炎效应。[0003]目前GHK的合成方法主要是经典固相合成。固相合成即将保护氨基酸由C端向N端逐个延伸，通过缩合、脱保护、再缩合、切割树脂、离心、冻干和高效液相制备得到纯度高于90％的GHK产品。该方法中需要的树脂市场价格过于昂贵，交换活度小，且其合成过程中所使用的缩合剂和碱都明显过量，导致GHK原料成本增加，并且不适用于工厂大规模生产，因此，降低GHK三肽生产成本、保证GHK合成过程稳定安全的工艺方法研究具有重要意义。[0004]熊瑛等人公开了一种GHK三肽的合成方法(厦门大学，2007硕士论文)，该合成方法以甘氨酸、赖氨酸和组氨酸为原料，分别制得N-Boc-Gly-OH、His(trt)和Lys(Boc)，然后依次合成N-Boc-Gly-His(trt)–OH，再合成N-Boc-Gly-His(trt)-Lys(Boc)–OH，然后脱去保护得到GHK三肽，该方法整个过程操作简单，不过缺点是合成N-Boc-Gly-His(trt)–OH的收率较低，仅仅只有36.5％，纯度也较低，并且合成过程中需要用到树脂，还不太适合工厂大规模生产。此外,最后得到的是GHK三肽的三氟乙酸盐，不是GHK三肽产品，不符合实际需求。发明内容
[0005]本发明要解决的技术在于提供一种安全稳定、降低成本、操作简单、可大规模生产的GHK三肽的合成方法。[0006]为解决以上问题，本发明提供了一种GHK三肽合成的方法，该方法包括：先用二碳酸二叔丁酯分别对甘氨酸和赖氨酸进行保护得到Boc-Gly-OH和Boc-Lys-OH，然后用三苯基氯甲烷对组氨酸进行保护得到Trt-His-OH；再用Boc-Gly-OH与N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳二亚胺反应得到Boc-Gly-OSu,然后再将其与Trt-His-OH反应得到Boc-Gly-His(Trt)-OH，随之再与N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳二亚胺反应得到Boc-Gly-His(Trt)-OSu,然后再将其与保护的赖氨酸进行反应得到保护的三肽，最后将保护的三肽与三氟乙酸反应得到GHK三肽。[0007]具体包括以下步骤：[0008](1)在氢氧化钠的作用下，甘氨酸与Boc酸酐在1，4-二氧六环中进行反应，反应结束后经过后处理得到Boc-Gly-OH；[0009](2)在三乙胺的作用下，组氨酸与二甲基二氯硅烷在二氯甲烷中进行反应，反应完毕再加入含三苯基氯甲烷的二氯甲烷溶液和三乙胺继续反应，反应结束后经过纯化处理Trt-His-OH；[0010](3)在碳酸氢钠和五水合硫酸铜的作用下，赖氨酸或其盐与Boc-酸酐在丙酮和水
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的混合溶剂中进行反应，反应结束后经过纯化处理，得到Boc-Lys-OH；[0011](4)在DCC的作用下，步骤(1)得到的Boc-Gly-OH与Hosu在1,4-二氧六环中进行反应，反应结束后经过纯化处理得到Boc-Gly-OSu；[0012](5)在DIPEA的作用下，步骤(4)的Boc-Gly-OSu和步骤(2)的Trt-His-OH在DMF中进行反应，反应结束后经过纯化处理得到Boc-Gly-His(Trt)-OH；[0013](6)在DCC的作用下，步骤(5)的Boc-Gly-His(Trt)-OH与Hosu在二氧六环中进行反应，反应结束后经过后处理得到Boc-Gly-His(Trt)-OSu；[0014](7)在碳酸氢钠的作用下，步骤(3)的Boc-Lys-OH与步骤(6)的Boc-Gly-His(Trt)-OSu在四氢呋喃和水的混合溶剂中进行反应，反应结束后经过纯化处理得到Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH；[0015](8)在三乙基硅烷的作用下，步骤(7)的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH和三氟乙酸在二氯甲烷中进行反应，反应结束后经过纯化处理得到GHK三肽三氟乙酸盐；[0016](9)步骤(8)的GHK三肽三氟乙酸盐溶解在乙酸乙酯和甲醇的混合溶液中，然后加入二乙胺至白色沉淀析出，抽滤，收集滤饼，进行纯化处理得到所述的GHK三肽。[0017]步骤(1)中，反应温度为室温，反应时间为12～24小时；[0018]所述的后处理包括：[0019]浓缩，水相用HCl水溶液调节PH至2-4后再用乙酸乙酯萃取，然后干燥过滤，滤液室温浓缩，最后再将浓缩物分离纯化得到Boc-Gly-OH。[0020]步骤(1)中，所述的分离纯化过程如下：[0021]加入二氯甲烷溶解浓缩物，然后加入石油醚进行析晶，抽滤，干燥得到所述的Boc-Gly-OH，采用该结晶方法处理简单，得到的产物收率和纯度稿。[0022]步骤(2)中，所述的纯化处理包括：[0023]反应结束后，加入乙酸乙酯和水搅拌，抽滤，滤饼中加入乙酸乙酯，在高温条件下油浴回流，关闭加热后抽滤，滤饼中加入大量含三乙胺的水溶液，室温条件下搅拌，抽滤，滤饼中加入四氢呋喃和水的体积比为1:1的混合溶液，在高温条件下回流至完全澄清后，然后经过结晶，过滤、干燥得到Trt-His-OH。[0024]步骤(3)中，所述的纯化处理包括：
[0025]向反应液中加入乙酸乙酯和水的体积比为1:2的混合溶液，搅拌、抽滤后滤饼中加入8-羟基喹啉和蒸馏水直至体系开始澄清，继续搅拌10-12h，分离纯化得到Boc-Lys-OH；[0026]该处理过程不需要采用树脂吸附铜，降低了成本，并且操作更加简单。[0027]步骤(4)中，所述的二氧六环与Dcc的体积-质量比为4.5-5.5:1。[0028]步骤(5)中，所述的纯化处理包括：[0029]加水稀释，用柠檬酸溶液调节pH为3-4，搅拌、过滤，滤饼用乙酸乙酯溶解、水洗、收集有机层、干燥、浓缩，然后加入甲基叔丁基醚和乙酸乙酯至体系溶清，然后加入石油醚，析出固体，过滤、干燥得到所述的Boc-Gly-His(Trt)-OH。[0030]步骤(6)中，所述的后处理包括：反应完全后抽滤、滤液浓缩，然后用四氢呋喃溶解，直接进入下一步。[0031]步骤(7)中，所述的后处理包括：[0032]旋蒸除去有机层，静置，将上清液进行抽滤，再用水多次溶解底部沉淀并抽滤，收
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集滤液，用柠檬酸溶液调节PH为3-4，搅拌，抽滤，收集滤饼，滤饼用乙酸乙酯溶解，水洗，收集有机相，干燥，过滤，滤液浓缩得白色固体，然后用二氯甲烷和石油醚重结晶得到所述的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH。[0033]步骤(8)中，反应温度为室温，反应时间为12～24小时。[0034]步骤(9)中，所述的后处理为用乙酸乙酯进行打浆，抽滤，收集滤饼，旋干得到所述的GHK三肽。
[0035]更具体地，本发明提供的方法步骤如下：[0036](1)合成Boc-Gly-OH
[0037]将甘氨酸与1,4-二氧六环、NaOH溶液混合，搅拌条件下加入Boc酸酐,室温反应24h，然后30-50℃条件下浓缩，水相用HCl水溶液调节PH至2-4后再用乙酸乙酯萃取，然后干燥过滤，滤液室温浓缩，最后再将浓缩物分离纯化得到Boc-Gly-OH。其化学方程式如下：
[0038]
(2)合成Trt-His-OH[0040]以二氯甲烷为溶剂，加入组氨酸，室温搅拌条件下加入含二甲基二氯硅烷的二氯甲烷溶液和三乙胺，高温条件下油浴回流反应6-10h，加热完毕后自然冷却至室温，加入含三苯基氯甲烷的二氯甲烷溶液和三乙胺，室温条件下搅拌。然后加入乙酸乙酯和纯净水，室温条件下搅拌。然后抽滤，滤饼中加入乙酸乙酯，在高温条件下油浴回流，关闭加热后抽滤，滤饼中加入大量含三乙胺的水溶液，室温条件下搅拌1-3h，抽滤，滤饼中加入四氢呋喃和纯净水的体积比为1:1的混合溶液，在高温条件下回流至完全澄清后，分离纯化得到Trt-His-OH。其化学方程式如下：
[0039]
[0041]
(3)合成Boc-Lys-OH
[0043]将赖氨酸盐酸盐完全溶解于蒸馏水中，加入碳酸氢钠和五水合硫酸铜搅拌，再加入Boc-酸酐和丙酮搅拌24h。然后向体系中加入乙酸乙酯和蒸馏水的体积比为1:2的混合溶液，搅拌1-3h，抽滤后滤饼中加入8-羟基喹啉和蒸馏水直至体系开始浑浊，继续搅拌10-12h，分离纯化得到Boc-Lys-OH。其化学方程式如下：
[0042]
[0044]
[0045][0046]
(4)合成Boc-Gly-OSu
将步骤(1)的Boc-Gly-OH完全溶解于1,4-二氧六环中，加入Hosu和1,4-二氧六环
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与Dcc的体积-质量比为4.5-5.5:1的混合溶液，室温搅拌12-24h，然后加入冰醋酸继续搅拌，分离纯化得到Boc-Gly-OSu。其化学方程式如下：
[0047]
[0048]
(5)合成Boc-Gly-His(Trt)-OH
[0049]在步骤(4)的Boc-Gly-OSu中加入DMF、DIPEA和步骤(2)的Trt-His-OH，室温搅拌2-4h，然后加入蒸馏水，用柠檬酸溶液调节PH为2-4，继续搅拌，分离纯化得到Boc-Gly-His(Trt)-OH。其化学方程式如下：
[0050]
[0051]
(6)合成Boc-Gly-His(Trt)-OSu
[0052]在步骤(5)的Boc-Gly-His(Trt)-OH中加入1,4-二氧六环、Hosu和1,4-二氧六环与Dcc的体积-质量比为8-9:1的混合溶液，室温搅拌3-5h，抽滤，滤液浓缩得到Boc-Gly-His(Trt)-OSu。其化学方程式如下：
[0053]
(7)合成Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH
[0055]在步骤(3)的Boc-Lys-OH中加入含步骤(6)的二肽酯的四氢呋喃溶液，然后加入碳酸氢钠和水的质量-体积比为1:16-18的混合溶液，室温搅拌过夜，TLC判断反应完全(展开剂为二氯甲烷与甲醇的混合溶液)，旋蒸除去有机层至瓶底出现胶状物，停止旋蒸后，静置。静置后将上清液进行抽滤，剩余底部沉淀用水溶解后再进行抽滤(直至沉淀不再减少停止此步骤)，收集滤液，用柠檬酸溶液调节PH为3-4，搅拌半小时，抽滤，收集滤饼，滤饼用乙酸乙酯溶解，水洗，收集有机相，干燥过滤，滤液浓缩得白色固体，分离纯化得到Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH。其化学方程式如下：
[0054]
[0056]
[0057][0058]
(8)合成GHK三肽三氟乙酸盐
在步骤(7)的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH中加入二氯甲烷使其完全溶解，再
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加入三氟乙酸和三乙基硅烷的体积比为9:1的混合溶液，室温搅拌过夜，高温浓缩后加水和乙酸乙酯的体积比为(1:1)的混合溶液使固体溶解，再用乙酸乙酯洗涤萃取，收集水相，旋蒸得到GHK三肽三氟乙酸盐。其化学方程式如下：
[0059]
[0060]
(9)合成GHK三肽
[0061]在步骤(8)的GHK三肽三氟乙酸盐中加入乙酸乙酯和甲醇的体积比为2：1的混合溶液使其溶解，再加入二乙胺至白色沉淀析出，抽滤，收集滤饼后对其进行纯化得到GHK三肽。其化学方程式如下：
[0062]
[0063]
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0064](1)本发明的合成方法完全不需要用到树脂，并且所用的缩合剂和碱的用量较少，可以有效地降低整个工艺的成本；[0065](2)本发明的合成方法的后处理更加简单，仅仅包括常规的洗涤、萃取和结晶步骤，便于工业化。附图说明
[0066]图1是实施例1合成的GHK三肽的液相色谱图。
具体实施方式
[0067]以下结合附图和实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于以下所述内容。
[0068]实施例1
[0069]1.合成Boc-Gly-OH[0070]将甘氨酸(2g，26.64mmol)与1,4-二氧六环(50ml)，NaOH溶液(16ml,31.97mmol)混合，搅拌条件下加入Boc酸酐(6.97g,31.97mmol),室温反应12h，然后30-50℃浓缩，浓缩液用乙酸乙酯洗涤，水相用HCl水溶液调节PH至2-4后再用乙酸乙酯萃取三到四次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在35-40℃的条件下浓缩，浓缩至产物呈油状物。加入二氯甲烷使其刚好溶解成液态，搅拌条件下滴加50ml石油醚，搅拌直至产物析出，抽滤，干燥，得到Boc-Gly-OH，TLC检测显示一个点，收率为95％。
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2.合成Trt-His-OH
[0072]称取4g(25.81mmol)L-组氨酸，加入70ml无水二氯甲烷，室温搅拌条件下加入含5.4ml(43.87mmol)二甲基二氯硅烷的10ml无水二氯甲烷溶液，65℃下油浴回流反应6h。加入13ml(92.91mmol)三乙胺，继续回流4h后关闭加热，自然冷却至30-40℃，加入含7.2661g(26.06mmol)三苯基氯甲烷的10ml无水二氯甲烷溶液，再加入3.6ml(25.55mmol)三乙胺，30℃下搅拌2h。然后加入80ml乙酸乙酯，滴加7.2ml纯净水，补加40ml乙酸乙酯至体系可以顺利搅拌，30℃条件下搅拌2h。抽滤，滤饼中加入120ml乙酸乙酯，在90℃条件下油浴回流1h，关闭加热，自然冷却至室温抽滤，滤饼加入含2.4ml三乙胺水溶液140ml，室温条件下搅拌2h，抽滤，滤饼加入四氢呋喃：纯净水＝1:1共140ml，在80℃条件下回流至完全澄清后，停止加热和搅拌，室温结晶。多次抽滤，收集滤饼，干燥得Trt-His-OH，TLC检测显示一个点，收率为95％。
[0073]3.合成Boc-Lys-OH
[0074]取5g(36.95mmol)赖氨酸盐酸盐，加入50ml水，溶解，加入碳酸氢钠5.40g(64.28mmol)，搅拌5-10min，加入五水合硫酸铜4.39g(17.56mmol)，体系变蓝，加入碳酸氢钠5.40g(64.28mmol)，搅拌5-10min，加入Boc-酸酐10.8g(49.48mmol)，再加入丙酮55ml，搅拌24h。然后向体系中加入乙酸乙酯300ml，水600ml，搅拌2h，抽滤，收集滤饼，加入8-羟基喹啉2.74g(18.87mmol)，搅拌条件下加入水直至体系开始搅拌，溶液由蓝色逐渐变为绿色，体系呈粘稠状，继续搅拌12h，加入水500ml，抽滤，收集滤液，滤液旋干得到Boc-Lys-OH，纯度为92％，收率为80％。
[0075]4.合成Boc-Gly-OSu
[0076]取Boc甘氨酸3.5036g(20mmol)，加入40ml1,4-二氧六环，加入Hosu2.5320g(22mmol)，加入溶于10ml1,4-二氧六环的Dcc 4.9519g(24mmol)，30℃室温搅拌16h，然后加入冰醋酸1ml，继续搅拌1h，抽滤，滤液45℃浓缩至干，加入20ml异丙醇打浆，抽滤，滤饼干燥得Boc-Gly-OSu，TLC检测显示一个点，收率为90％。[0077]5.合成Boc-Gly-His(Trt)-OH
[0078]取Boc甘氨酸酯6.807g(25mmol)，加入80mlDMF，加入DIPEA 4.4ml(25mmol)，Trt组氨酸10.313g(25mmol)，室温搅拌2-3h，然后加入375ml的水，用柠檬酸溶液调节PH为3-4，继续搅拌15min，抽滤，收集滤饼加入乙酸乙酯溶解，水洗，收集有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩(T＝45℃)，加入20ml甲基叔丁基醚，加入3-4ml乙酸乙酯直至体系溶清，加入60ml石油醚，析出大量固体，搅拌15min，抽滤，收集滤饼，滤饼旋干得到Boc-Gly-His(Trt)-OH，纯度为94％，收率为85％。
[0079]6.合成Boc-Gly-His(Trt)-OSu[0080]取二肽8.3196g(15mmol)，加入40ml 1,4-二氧六环，加入Hosu2.0716(18mmol)，加入溶于40ml1,4-二氧六环的Dcc 4.6424g(22.5mmol)，室温搅拌4-5h，4h后开始液相监测直至二肽反应完全，抽滤，滤液浓缩(T＝45℃)，浓缩完毕后用四氢呋喃(80ml)至溶解，然后投入下一步反应。
[0081]7.合成Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH[0082]取Boc赖氨酸4.4268g(18mmol)，加入80ml含15mmol二肽酯的四氢呋喃溶液，加入碳酸氢钠4.5365g(54mmol)，加入水80ml，室温搅拌过夜，TLC判断反应完全(展开剂为二氯
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甲烷∶甲醇＝9∶1)，旋蒸除去有机层(T＝45℃)，瓶底出现胶状物，停止旋蒸后，静置。静置后将上清液进行抽滤，剩余底部沉淀用水溶解(沉淀溶解度低需要多次用水溶解，直至沉淀不再减少)，共用水800ml，再进行抽滤，收集滤液，用柠檬酸溶液调节PH为3-4，搅拌15min，抽滤，收集滤饼，滤饼用225ml乙酸乙酯溶解，水洗，收集有机相，再用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得白色固体。加入适量二氯甲烷(15-20ml)，再加入大量的石油醚(150-200ml)，有白色固体析出，搅拌15min，抽滤，滤饼旋干得到Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH，纯度为97％，收率为80％。
[0083]8.合成GHK三肽三氟乙酸盐[0084]取保护三肽6.2624g(8mmol)，加入48ml的二氯甲烷使其溶解，再加入48ml的三氟乙酸，2.56ml三乙基硅烷，室温搅拌过夜，浓缩，T＝60℃。加水(35ml)和乙酸乙酯(30ml)使固体溶解，再用乙酸乙酯洗涤萃取，收集水相，旋蒸得到GHK三肽三氟乙酸盐，纯度为99％，收率为98％。
[0085]9.合成GHK三肽
[0086]取7.4819g三肽三氟乙酸盐，加入甲醇100ml，加入200ml乙酸乙酯，溶解，加入二乙胺8ml，白色沉淀析出，抽滤，收集滤饼，滤饼用乙酸乙酯(适量，50ml)打浆30min，抽滤，收集滤饼，旋干得到GHK三肽，HPLC图谱见图1，纯度为96％，收率为83％。[0087]实施例2
[0088]本实施例的合成Boc-Gly-OH步骤1中，[0089]将1,4-二氧六环替换为丙酮，其他操作与实施例1步骤1相同，得到Boc-Gly-OH，收率为72％。其他步骤与实施例1相同，得到GHK三肽。[0090]实施例3
[0091]本实施例的合成GHK三肽三氟乙酸盐步骤8中，取保护三肽6.2624g(8mmol)，再加入12ml的三氟乙酸，2.56ml三乙基硅烷，2.56mL水，室温搅拌过夜，浓缩，T＝60℃。加水(70ml)和乙酸乙酯(60ml)使固体溶解，该步骤的其他步骤与实施例1相同，得到GHK三肽三氟乙酸盐，收率为81％。其他步骤与实施例1相同，得到GHK三肽。
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CN 111732628 A
说 明 书 附 图
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图1
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